WB实验,一抗,该怎么孵育？

wb的基本原理和操作流程

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WB简单流程

WB简单流程
1）PAGE胶的制备
根据目的蛋白的分子量选择不同的凝胶浓度，高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓度胶分离。

2）上样及电泳
1. 上样
每孔上样量为10-30 μg蛋白，可以根据实验要求加大上样量。

根据蛋白定量结果取所需蛋白加入适量上样缓冲液，沸水浴10min后离心取上清上样。

2. 电泳
浓缩胶70V 30分钟，分离胶120V 90分钟，可以根据具体实验要求调整电压和时间。

当染料到达胶底部时切断电源，停止电泳，进行下一步转膜。

3）转膜
转印详细操作依据Trans-Blot Turbo RTA transfer kits在Trans-Blot Turbo TM转印系统中进行。

转印完成后，将NC膜或者PVDF膜，从暗盒中取出，进行下一步封闭。

4）膜的封闭及抗体孵育
1. 封闭：5%脱脂奶粉室温封闭1小时或4℃过夜。

2. 一抗：根据说明书稀释抗体，抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，和膜室温孵育1小时或4 ℃孵育过夜。

3. 二抗：孵育一抗的膜用TBST洗涤3次，每次10min。

随后根据用量，按照适当比例稀释HRP标记的二抗，与膜室温孵育1h。

用TBST洗涤3次，每次10min。

5）显色：按照合适比例配置ECL后，使用BIO-RAD molecular image设置不同曝光时间，拍照并保存。

western blot一抗二抗原理

western blot一抗二抗原理Western blot，也叫蛋白印迹，是目前常用的一种蛋白质分析方法。

它的原理是利用抗体特异性识别目标蛋白质，从而检测出目标蛋白质的存在与否、大小以及数量等信息。

Western blot分为以下几个步骤。

1. 蛋白质电泳分离Western blot的第一步是将待检测蛋白质进行电泳分离。

蛋白质在电场中根据其分子量（大小）不同而被分离为不同的带状条带，这些条带被称为蛋白质谱图。

2. 转印分离完毕后，我们需要将带状条带转移到聚丙烯酰胺酰膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）上，以便后续的蛋白质定位和检测。

转印过程使用电泳原理，在之前的电泳装置上将PVDF或NC膜和分离完毕的蛋白质谱图叠在一起，经过一定的电流和时间，蛋白质被转移到膜上。

3. 阻断非特异性结合在转移完毕后，需要将膜进行阻断，避免非特异性结合发生。

一般采用的方法是在膜上浸泡含有蛋白质的阻断液（如牛血清白蛋白BSA 或马血清白蛋白MSA）中，这样就能够避免非特异性抗体反应。

4. 第一次抗体孵育接下来就是第一次抗体孵育。

在这一步，我们需要使用目标蛋白质的特异性抗体，将其与膜上的蛋白质结合。

第一次抗体要与目标蛋白质结合，从而使后续反应中的第二次抗体只能结合到第一次抗体上，不会与膜上其他蛋白质结合。

通常在孵育完毕后，需要进行多次的洗涤步骤，去除未结合的第一次抗体。

5. 第二次抗体孵育第二次抗体孵育是Western blot中的关键步骤之一。

这里的第二次抗体是针对第一次抗体的特异性抗体。

第二次抗体的发光物质（如酶或化合物）通常与第二次抗体结合，使其结合的部位出现发光，从而证明目标蛋白质的存在与否。

总之，Western blot的原理是通过特异性抗体的结合实现蛋白质定位和检测。

这种分析方法广泛用于分子生物学研究中，尤其是蛋白质鉴定和分析方面。

它是一种可靠、有效的检测方法，同时也具有一定的局限性，需要根据实际情况进行优化和改进。

WB实验步骤详解

WB实验步骤详解WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和鉴定蛋白质的实验技术。

在WB实验中，通常将目标蛋白质从混合蛋白样本中分离出来，然后通过电泳将其分离在聚丙烯酰胺凝胶上，并利用蛋白质转印技术将蛋白质迁移到膜上。

最后，使用特异性抗体进行免疫染色来检测目标蛋白质。

下面是WB实验的详细步骤：1.提取蛋白质：首先，从细胞、组织样本中提取蛋白质。

这个步骤可以使用不同的方法，例如细胞裂解、组织切碎和离心等。

提取的蛋白质可以用于整个WB实验的下一步。

2.蛋白质电泳分离：将提取的蛋白质样本与样品缓冲液混合，然后加载到聚丙烯酰胺凝胶上。

通常使用的凝胶是SDS-（聚丙烯酰胺凝胶电泳），该凝胶根据蛋白质的分子量将其分离开来。

样品加载完毕后，通电进行电泳分离。

较小的蛋白质会迁移到凝胶的上部，较大的蛋白质会停留在凝胶的下部。

3.转印：将电泳分离后的蛋白质转移到膜上。

通常使用的膜是聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素膜。

在转印之前，通常将凝胶浸泡在转移缓冲液中以增强转印效果。

然后，将凝胶与膜、滤纸层堆叠在一起，将其放置在转印装置中，施加电流进行蛋白质转印。

4.阻断：将转印完成的膜孔洞中的非特异性结合位点进行阻断。

阻断是为了防止以后的抗原-抗体反应受到非特异性结合的干扰。

最常用的阻断剂是1%-5%的非脂牛奶粉或5%-10%的牛血清蛋白。

5.抗体孵育：使用特异性的抗体来检测目标蛋白质。

首先将抗体稀释在主抗体稀释液中，然后将其加到阻断后的膜上进行孵育。

通常在4℃下过夜孵育，使抗体与目标蛋白质结合。

选择合适的抗体对于获得准确的结果非常重要。

6.辅助抗体孵育：将特异性抗体之外的次级抗体添加到膜上，用于识别已结合的主抗体。

这些次级抗体通常与酶（如辣根过氧化物酶）或荧光染料标记进行共轭，以便于标记的抗体的检测。

次级抗体与主抗体结合形成复合物。

7.检测：使用特定的检测方法来显示已结合的抗体。

这些方法可以使用酶标法（如辣根过氧化物酶反应和色素显色）或荧光技术（如荧光染料）。

WB完整步骤

Western blot 步骤：配胶制胶跑胶转移胶（转膜）封闭和孵抗体扫膜一.配胶这些小孔的孔径随“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。

SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。

1.分离胶（按照自己目的蛋白的大小说明选择合适的浓度）2.浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。

容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，二制胶1.灌入2/3的分离胶后应立即封胶，即压线。

30分钟胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。

封胶后切记，勿动。

如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。

30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉过硫酸铵（APS）(10%;w/v)取3g过硫酸铵，溶于去离子水，至终体积为30mL。

此溶液4℃下在短暂的数日内是稳定的，但建议，对每一组新胶均应新鲜配制但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气2.灌积层胶5%（统一）40min说明：可延长，宁长勿短。

WB详细操作步骤

Western blot实验检测蛋白表达，抗体很重要，用到的有一抗、二抗、内参抗体WB步骤1 蛋白样本处理：(1)一部分采用完全变性的方法（加入β-巯基乙醇）：加入适量5×SDS-PAGE loading buffer，100ºC沸水加热处理5min，使蛋白充分变性，12000 rpm离心5 min，取上清备用。

(2) 一部分采用非完全变性的方法（未加入β-巯基乙醇）：加入适量5×SDS-PAGE loading buffer，100ºC沸水加热处理5min，使蛋白充分变性，12000 rpm离心5 min，取上清备用。

2 分离胶浓缩胶配方如下：分离胶的浓度要根据蛋白的大小来决定，如下表所示：SDS-PAGE分离胶浓度（%）最佳分离范围（kD）6 50-1508 30-9010 20-8012 12-6015 10-40不同浓度的分离胶与5%浓缩胶，配方如下：分离胶5%浓缩胶试剂8% 10% 12% 15% 试剂体积去离子水（mL) 5.52 4.8 3.96 2.76 去离子水（mL) 4.0 30%丙烯酰胺（mL) 3.24 3.96 4.8 6.0 30%丙烯酰胺（mL) 1.01.5mol/lTris.cl(PH8.8)（mL) 3.0 3.0 3.0 3.01.0mol/lTris.cl(PH6.8)（mL)1.010%SDS（mL) 0.12 0.12 0.12 0.12 10%SDS（μL)80.0 10%AP（mL) 0.12 0.12 0.12 0.12 10%AP（μL)60.0 TEMED（μL)7.2 4.8 4.8 4.8 TEMED（μL)8.0 总体积（mL) 12.0 12.0 12.0 12.0 总体积（mL) 6.03 制胶：加入分离胶溶液至2/3处，加水饱和正丁醇封胶，室温放置40 min后加浓缩胶至顶，插入梳子，静置10 min。

免疫荧光共定位一抗孵育方法

免疫荧光共定位一抗孵育方法嘿，朋友们！今天咱就来唠唠免疫荧光共定位一抗孵育方法。

这可真是个有意思的事儿，就好像是给细胞们精心准备一场特别的“派对”。

咱先得把细胞准备好呀，就像给小客人们打扫干净房间一样。

然后呢，把一抗这个“主角”请出来。

这一抗可重要啦，它就像是一把特别的钥匙，能准确地找到它要开启的“锁”。

你可别小看了这一抗的选择哦，得选对才行！就跟你去参加聚会得穿合适的衣服一样。

选好了一抗，就该让它和细胞来个亲密接触啦。

把一抗小心翼翼地滴在细胞上，就好像给细胞轻轻地披上一件特别的“披风”。

这时候就得有耐心啦，让一抗慢慢地和细胞相互熟悉、相互作用。

你想想，要是你去认识新朋友，不也得花点时间了解一下嘛。

在这个过程中，可不能太着急，得给它们足够的时间来“交流感情”。

然后呢，等它们相处得差不多了，就得把多余的一抗洗掉啦。

这就像是派对结束后，把场地清理干净一样。

可别留着那些多余的呀，不然会干扰后面的观察呢。

这整个过程就像是一场精心编排的舞蹈，每一个步骤都得恰到好处。

要是哪个环节出了差错，那可就跳不好这支舞啦。

你说，这免疫荧光共定位一抗孵育是不是很神奇？就这么一系列的操作，就能让我们看到细胞里面那些奇妙的现象。

这就像是打开了一个微观世界的大门，让我们看到了平时看不到的精彩。

而且啊，这可不是随随便便就能做好的，得细心、得耐心、得有技巧。

就像做菜一样，调料放多了或者放少了，味道就不一样了。

咱这一抗孵育也是同样的道理呀，稍微不注意，可能结果就不理想啦。

所以啊，朋友们，当你们进行免疫荧光共定位一抗孵育的时候，一定要认真对待，把每个细节都把握好。

别嫌麻烦，这可是为了看到更美丽、更准确的结果呀！这就好像是追求一个梦想，过程可能会有点辛苦，但当你看到那令人惊喜的成果时，一切都值得啦！你们说是不是呢？反正我是这么觉得的！。

wb实验流程及注意事项

wb实验流程及注意事项
WB实验是一种常见的免疫学实验，其流程大致如下：
1.制备细胞悬液：将需要研究的细胞通过离心、洗涤等操作制成含有约1×10^6个/ml的单细胞悬液。

2.孵育细胞：将细胞悬液加入含有10%腹水的RPMI1640培养基中（也可添加适量的FBS）进行孵育，通常孵育时间为24-48小时。

3.收获细胞：将孵育后的细胞通过离心等方式收获，以备进行下一步操作。

4.制备干标准物：将抗体或其他试剂制成干标准物（包括一系列浓度档次），通常冷冻保存备用。

5.制备稀释液：将PBS或其他缓冲液配成不同浓度的稀释液，可用于对干标准物的稀释。

6.加入样品：将步骤3中的细胞悬液加入96孔板中，加入相等体积的稀释液。

7.加入干标准物：将制备好的干标准物加入96孔板中，加入相等体积的稀释液。

8.孵育：将加入样品和干标准物的96孔板进行孵育，通常为2-3小时，使细胞与抗体结合。

9.洗涤：用PBS或其他缓冲液进行洗涤，去除未结合的试剂。

10.加入二抗：加入与干标准物匹配的二抗，并进行孵育。

经过一定时间，细胞与试剂结合形成免疫复合物。

11.用底物发光：加入底物，进行化学发光反应，根据发光量推算出样品中对应物质的浓度。

注意事项：
1.所有试验所用材料要保持洁净，尤其是培养皿和吸管，以避免污染。

2.在制备稀释液和样品时要准确称量，避免误差，同时要注意样品的体积和浓度，保证实验的可靠性。

3.在操作过程中，要规范操作流程，严格遵守实验规程，注意自身安全。

4.试剂保存要避免高温和阳光照射，同时要注意过期时间。

5.实验过程中要及时记录数据，以便后续分析。

wb孵抗体流程

wb孵抗体流程
在Western Blot实验中，孵育抗体是关键步骤之一。

以下是抗体孵育的详细流程：
1. 将配置好的一抗倒入抗体孵育盒。

2. 将封闭完的PVDF膜用TBST清洗一遍后置于一抗中，置于4℃冰箱或者冷库缓慢摇动过夜。

3. 过夜后将孵育了一抗的PVDF膜置于TBST中重复清洗3次，每次10分钟。

4. 将PVDF膜置于二抗中室温缓慢摇动1小时。

以上步骤完成后，即可进行后续的显影、定影等步骤，最终获得实验结果。

需要注意的是，每一步都要严格按照实验操作规程进行，确保实验结果的准确性和可靠性。

抗体和单域抗体体外孵育方法

抗体和单域抗体体外孵育方法
- 将稀释好的抗体滴两三滴到蜡板上，然后放膜在上面，使膜紧贴在蜡板上，再将剩余的抗体加到膜上，最后盖上平皿盖子，在4度过夜或室温孵育即可。

- 将用过的培养皿（100mm或96孔板盖子）中铺上石蜡膜，长宽比所用的膜各大约1-2cm。

先将配置好的一定浓度的抗体，滴加至石蜡膜中间，然后将膜的蛋白面朝下铺在石蜡膜上，抗体会随着膜的方向均匀分布，而不流向其他地方，最后盖上平皿盖子，用保鲜膜将培养皿整体包裹起来，在4度过夜或室温孵育均可。

你可以根据具体的实验需求和条件，选择适合的孵育方法。

WB实验,一抗,该怎么孵育？

一抗，该怎么孵？为什么实验室中最常用的WB（Western blot）实验看起来较难重复？为什么同样样品同样配方师兄师姐却技高一筹？如何才能确保我实验结果的可重复性？可能原因有很多，本文主要讲一抗该怎么孵？一抗稀释缓冲液——取决于抗体特异性一抗应在含5%BSA或5%脱脂牛奶的TBST缓冲液中稀释。

每种抗体都预先确定了最佳稀释缓冲液，并写入了各产品的说明书，请遵照产品说明书进行配制，从而得到最佳的信号。

例如(A)，免疫印迹分析胰岛素处理过的C2C12细胞提取物，采用Phospho-Akt (Ser473)Antibody #9271。

遵照说明书，用基于BSA缓冲液稀释得到信号显著强于基于牛奶的缓冲液。

孵育——过夜孵育提高抗体结合一抗孵育时间会有很大的差别，具体取决于研究人员采用的操作流程。

我们建议转移之后封闭一小时，随后在4℃下进行过夜一抗孵育。

此处(B,C)所示为抗体性能的两个实例，4℃过夜孵育，或室温条件下2小时孵育。

例如(B)，免疫印迹分析HeLa细胞提取物，未经处理或加入LY294002 #9901或Human Insulin-like Growth Factor I (hIGF-I) #8917处理，采用Phospho-Akt(Ser473)Antibody #9271 (上) 和PKCδAntibody #2058 (下) 。

Phospho-Akt(Ser473) 和 PKCδ都在4℃过夜孵育中表现更佳。

简短孵育系统——孵育时间越短产生信号越弱宣传简短抗体孵育时间的系统越来越流行，因为它们能减少免疫印迹结果所需时间。

使用这些系统时，应遵循生产商推荐的操作流程并使其最佳化。

这些操作流程通常要求较弱的封闭缓冲液和较高一抗和二抗浓度，以便在简短的时间周期内实现必要的抗体结合水平。

CST科学家将Millipore的SNAPi.d..（一款真空运作孵育系统，可将抗体孵育时间降至30分钟以下）和CST推荐的抗体孵育操作流程进行了比较。

WB实战之抗体孵育

WB实战之抗体孵育首先，抗原抗体识别原理的物理学解释，抗体孵育过程实际上就是一个竞争结合的动力学过程。

由于抗原和抗体特异性结合的效率是非特异性结合的数百万--数十亿倍，所以当特异性抗体与非特异性'抗体'（不好描述，指添加在抗体稀释液中的封闭蛋白，我们可以把它们看成非特异性的一抗）竞争时，尽管抗体稀释液中封闭蛋白的浓度是一抗浓度20K：1以上，在碰撞几率相同的条件下，由于时间的积累加孵育过程中反复漂洗（孵育抗体要摇晃，对吧），特异性一抗积累了识别、结合优势。

同样在TBST等漂洗的情况下，由于亲和力等原因，使得一抗很牢靠并进一步增加对比优势，再经过2抗特异性积累和ECL的最终放大形成特异性条带和非特异性背景之间荧光信号的巨大差异。

由以上碰撞结合、亲和力差异这些基本现象，我们可以解释WB 中出现的现象。

1.在样品制备时，PBS漂洗目的时去除培养基中BSA。

不漂洗的后果，是在BSA位置任何抗体都可以非特异性的结合从而显影。

用碰撞的原理去解释：当杂带很浓的时候，抗体的特异性已经毫无意义，它只符合物理定律中的碰撞几率原理；因为你的杂带浓，碰撞几率大，粘附一抗的机会多，因此它就会显出来，但切记这是杂带。

当杂蛋白含量高到一定程度，“任何”一种一抗都可以在该位置显出条带。

2.因此，用条带的深浅去判断是否是靶蛋白，这是非常不科学的。

在默认抗体有效的情况下，如果抗原靠近区域没有杂带，背景干净，依据分子量大小可以初步确认靶蛋白的位置；如果有杂带，并不一定是特异性条带就比杂带亮，也许杂带蛋白浓度大，非特异性粘附的一抗更多。

目前判断杂带和靶蛋白的唯一标准是分子量；而当分子量大小类似时，只有通过增加过表达或IP纯化的样品做阳性对照，或者KD该蛋白的样品做阴性对照一起电泳转膜，才能准确区分靶蛋白和杂质。

（用IP或KD样品也是验证商品化抗体是否有效的可靠方案）。

靶蛋白分子量该如何确定？由1中的解释可知，杂带比靶蛋白荧光信号强且干净一点也不意外，而经常不同的公司对同一靶蛋白给出不同的分子量，那么如何确定新上手不熟悉的靶蛋白的分子量呢？A. 用“过表达或IP纯化的样品做阳性对照”，这是最靠谱的方案。

荧光Western免疫印迹方法(第一抗体在牛奶中孵育)

荧光Western免疫印迹方法（第一抗体在牛奶中孵育）做Western免疫印迹时，将膜泡在用稀释抗体中4°C孵育过夜并轻轻晃动。

抗体稀释在含5% w/v 脱脂奶粉的1X TBS, 0.1% Tween-20当中注意：双荧光Western中两种一抗需要是不同物种来源的而且对应的二抗应标记有不同荧光。

如果两种一抗相应推荐使用的一抗稀释液不同，则将两种抗体单独在两种稀释液中试验，选用效果更好的稀释液用于双荧光实验。

以下方法中的试剂可以根据货号从Cell Signaling Technology (CST)公司购得。

A.所需溶液和试剂注意：所有溶液用Milli-Q或相当级别的水配制。

1.1X磷酸盐缓冲生理盐水2.1X SDS 上样缓冲液(#7722, #7723) 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8，25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油, 50 mM DTT, 0.01% w/v 溴酚蓝或酚红。

3.转膜缓冲液：25 mM Tris 碱, 0.2 M 甘氨酸, 20% 甲醇(pH 8.5)。

4.10X Tris缓冲盐水(TBS): 配制1L时，称取24.2g Tris碱，80g NaCl加入1L水中；调整pH为7.6（稀释至1X使用）。

5.脱脂牛奶: (#9999)6.封闭液：含5% w/v脱脂奶粉，0.1% Tween-20的1X TBS。

配150ml时，在135ml水中兑入15ml 10X TBS，混匀；加入7.5g脱脂奶粉，使之溶解。

7.漂洗液: 1X TBS, 0.1% Tween-20 (TBS/T)。

8.Antibody Dilution Buffer: 1X TBS, 0.1% Tween-20 with 5% nonfat dry milk; for 20 ml, add2 ml 10X TBS to 18 ml water, mix. Add 1.0 g nonfat dry milk and mix well. While stirring,add 20 μl Tween-20 (100%).抗体稀释液：含5% w/v脱脂奶粉或BSA，0.1% Tween-20的1X TBS。

孵育一抗的相关条件

孵育一抗的相关条件
孵育一抗的相关条件包括：
1. 制备基础培养基：需要使用富含营养成分的基础培养基，常用的有DMEM、RPMI1640、MEM等。

2. 补充血清和抗生素：培养一抗细胞时需添加10%的胎牛血清或牛血清，以及1%的青霉素和链霉素。

3. 选择合适的培养温度与气体组成：常规情况下，以37℃、5% CO2培养。

4. 保持细胞稳定：每隔2-3天更换一次培养基，以保证细胞生长和稳定状态。

5. 收集一抗：一抗制备好后，通过离心、滤液等方式收集一抗。

6. 储存一抗：一抗制备好后，可通过冻干或冷冻保存的方式储存，以备后续使用。

WB完整步骤

Western blot 步骤：配胶制胶跑胶转移胶（转膜）封闭和孵抗体扫膜一.配胶这些小孔的孔径随“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。

SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。

1.分离胶（按照自己目的蛋白的大小说明选择合适的浓度）2.浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。

容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，二制胶1.灌入2/3的分离胶后应立即封胶，即压线。

30分钟胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。

封胶后切记，勿动。

如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。

30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉过硫酸铵（APS）(10%;w/v)取3g过硫酸铵，溶于去离子水，至终体积为30mL。

此溶液4℃下在短暂的数日内是稳定的，但建议，对每一组新胶均应新鲜配制但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气2.灌积层胶5%（统一）40min说明：可延长，宁长勿短。

westernblotting实验操作步骤

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot, WB）WB是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。

WB 是进行微量蛋白质分析比较成熟的技术之一。

以下是总结Western Blot 操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。

A第一部分：蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：1.尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）；2.保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、表面活性剂、还原剂等的选择）；3.提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）；4.尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）；5.样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。

方法的选择◆自行配制抽提试剂，根据文献方法或经验提取；◆购买商品化试剂盒，按其说明书的方法提取。

Example 1：实验中提取肾脏总蛋白，具体实验过程如下：1.提前一天4℃解冻RIPA，一定要完全融化；配PBS（用于细胞试验则需高压）；2.配制裂解液：PMSF:RIPA=1:99,PMSF终浓度为100mM（根据样本数配制所需的量，临用临配）；3.裂解组织：每个样品称取100mg，加1ml裂解液，匀浆后4℃静置2h使其充分裂解，14000g，4℃离心10min，取上清。

4.蛋白定量：取少量上清稀释30倍蛋白定量，然后计算出各样本原液蛋白浓度。

注意由于裂解液里含有较高浓度的洗涤剂，蛋白定量不能选用Bradford法，可以选用改良的Lowry’s法或者BCA法。

5.样品蛋白浓度均一化：根据蛋白定量计算的结果将各样品蛋白浓度调整一致。

具体方法为加入PBS稀释至样品浓度一致，本次蛋白浓度为3mg/ml。

WB详细操作过程

一、制胶1、注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干2、玻璃板干净后，对着与胶接触的面对其靠拢，整齐的夹到绿色架子里，再按照说明书，配制分离胶（分为两块的配制与一块的配制），其中PAGE（解冻现拿现用，聚丙酰胺（4度冰箱冷藏），在加入分离胶之前用水检验是否漏水3、用枪头，对好玻璃板的边缘打下去，注意快速不要漏出去，液面要平，根据插梳子的位置，加入到一定高度，最后在加满纯水覆盖其上，封胶4、静置40min,将分离胶上的水倒出，观察分离胶是否有较好的制作好5、配制浓缩胶（分为两块的配制与一块的配制），配制好后迅速的加入到玻璃板内，，并插上梳子，静置30min6、结束后，将玻璃板取下，放入纯水的盒子里，放入到4度冰箱内备用二、提取蛋白1、取出六孔板，吸取原培养液丢弃，靠边加入PBS洗涤（500ml），轻晃，吸取废液丢弃，洗涤三次2、加入蛋白裂解液（视细胞数量而定）加入裂解液之后，调小移液枪量程，反复摧打至培养皿底部全透明3、将产物吸入1.5ml的EP管，用震荡机振荡30s，冰浴10min，反复三次，取的两支EP管标注蛋白名字）4、振荡离心13000转，4度，5min5、用移液枪取离心后的上清液至新取的EP管，1.5ml 2支，注意名称的对称6、放入—80度冰箱储存三、蛋白定量测定1、准备工作：BCA工作液、蛋白标准液、96孔板、冰盒、提取的蛋白2、按照说明书计算所需BCA工作液的量，A液：B液=50：13、在孔板盖子上标记，加标准液（8个）与样品的标记，在本子上写好浓度梯度，对着位置加入标准液浓度0，1，2，4，8，12，16，20，之后在标准样品的孔内，用pbs加满到20微升4、加完标准液，在对应的孔里加样品20微升，最后将配好的BCA 液加入到标准液和样品中各200微升，5、放在37度振荡培养箱内振荡孵育30分钟6、提前将酶标仪打开7、时间到了之后，去将孔板拿出放入酶标仪中测蛋白：步骤：session ——new——next——use default——next finish——设置波长（526）——出仓——file wizard——设置孔板数——no.of unknows——add and close——左上角results——左下方右键点（report/export)——把左侧中的data添加到右框——点save to file 选择储存路径——保存出仓——放板、入仓、开始8、若没有错误，则将剩余的蛋白根据比例1：4（Loading buffer：蛋白）加入Loading buffer9、孵育100度，5min，提前将电锅浴打开10、完成后放入-80度四：样品蛋白处理准备：PBS，移液枪，1.5mlEP管步骤：取出上样样品至1.5 ml离心管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。