生物芯片在食管癌研究中的应用进展

生物芯片在食管癌研究中的应用进展朱宏１综述施瑞华１郜恒骏１，２审校南京医科大学第一附属医院消化内科１（２１００２９）生物芯片上海国家工程研究中心２恶性肿瘤的发生、发展是多基因参与的复杂过程。

从基因和蛋白水平诠释肿瘤的病因、发病机制、病理过程和治疗机制是当前肿瘤研究的主要内容。

描绘出不同肿瘤或同一肿瘤不同亚型的基因和蛋白表达谱是肿瘤分子学研究的基础。

但如何在同一时间内完成数以万计的基因和蛋白检测，一直是困扰研究者的难题。

生物芯片的出现，从根本上解决了这一难题，它是利用芯片技术中信息集成化和平行处理的原理，将核酸片段、多肽等生物大分子甚至组织、细胞等生物样品有序地固化于固相支持物表面，根据生物大分子间具有特异性相互识别的能力，使之与已标记待测生物样品中的靶分子杂交，通过对获得的信号应用扫描仪和相关软件进行定量和定性分析，可对细胞、糖、脂、核酸和蛋白质等物质进行准确、快速、大信息量检测。

食管癌是严重危害我国人民生活健康的恶性肿瘤之一。

在食管癌的分子病理学、分子治疗学研究中，生物芯片以高通量、连续化、集成化、微型化和自动化等优势得到了广泛应用，现就相关文献作一简要综述。

一、基因芯片在食管癌基因表达谱研究中的应用近年来应用基因芯片研究发现了大量食管癌的相关基因。

Ｈｕ等［１］应用含５８８个人类基因片段的基因检测芯片，检测食管鳞癌细胞株的基因表达，并以该细胞株宿主的正常食管上皮组织作为对照，结果发现５２个上调基因和８个下调基因，其ｍＲＮＡ水平均出现２倍以上的变化。

其中部分差异性表达基因应用半定量逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）法进行验证，结果与芯片检测一致。

免疫组化法对其中的癌基因Ｆｒａ－１和Ｎｅｏｇｅｎｉｎ、细胞周期相关基因Ｉｄ－１和ＣＤＣ２５Ｂ的蛋白水平进行检测，结果发现这四种基因在食管鳞癌细胞株、食管鳞癌组织中表达明显增加，并与肿瘤分化密切相关。

基因表达谱芯片为发现肿瘤相关功能基因和新基因提供了便捷有力的工具。

Ｌｕｏ等［２］应用含３４１７６个基因的ｃＤＮＡ芯片检测了食管鳞癌的基因表达谱变化，对照正常食管鳞状上皮、食管鳞癌组织，结果有７７个下调基因和７个上调基因，其中３１个下调基因和１个上调基因系首次发现，与食管鳞癌有关。

涉及鳞状上皮细胞分化的基因普遍出现下调，包括膜联蛋白Ⅰ、ＳＰＲＲｓ、钙结合蛋白Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、转谷氨酰胺酶ＴＧＭ３、细胞角蛋白ＫＲＴ４、ＫＲＴ１３、ＧＫＬＦ和ｃｙｓｔａｔｉｎＡ等，这些基因大多编码组成细胞膜结构的钙结合蛋白和钙调节蛋白；而与细胞侵袭和增殖基因，如纤维连接蛋白、ＳＰＡＲＣ、组织蛋白酶Ｂ和ＫＲＴ１７等均表达增加，进一步分析表明食管鳞癌的ＧＫＬＦ表达变化可能对ＳＰＲＲ１Ａ、ＳＰＲＲ２Ａ和ＫＲＴ４的表达具有调节作用。

通过免疫组化和吸印技术（ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ）法进一步验证了芯片检测结果的可靠性。

Ｌｕ等［３］应用ｃＤＮＡ芯片检测食管鳞癌基因表达谱时发现，与正常食管鳞状上皮相比，已表达序列标志（ＥＳＴｓ）ａａ７００３５１在食管鳞癌中的表达显著增加。

根据ａａ７００３５１碱基序列，通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）获得了该基因ｃＤＮＡ序列，并将其命名为ＥＣ９７，全长３３５３ｂｐ，蛋白产物含８１３个氨基酸、２５个外显子，染色体定位于１６ｐ１２～１６ｐ１３．１。

对２０例食管鳞癌样本分析表明，其在食管鳞癌组织中的表达率为６０％（１２／２０）。

通过基因芯片分析肿瘤基因表达谱的变化，按基因差异性表达功能分类，可发现新的肿瘤病理机制。

Ｚｈｉ等［４］采用１４８０３个基因ｃＤＮＡ芯片对６对食管鳞癌和正常鳞状上皮组织基因的表达谱分析发现，肿瘤组织中有９个基因表达上调和３６个基因表达下调，这些差异性表达基因中有９个与花生四烯酸代谢有关，包括膜联蛋白－Ⅰ、Ⅱ，Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ１０、Ｓ１００Ｐ、谷光苷肽过氧化物酶－３、磷酸卵磷酯转移蛋白、ａｌｄｏ－ｋｅｔｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｆａｍｉｌｙ１和环氧合酶（ＣＯＸ）－２等。

ＲＴ－ＰＣＲ、蛋白质印迹法（ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）和免疫组化等方法证实，基因和蛋白水平的膜联蛋白－Ⅰ、Ⅱ表达明显下调，而ｃＰＬＡ（２）、ＦＬＡＰ、ＣＯＸ－２、５－ＬＯＸ和１２－ＬＯＸ等表达上调。

该研究提示・综述・花生四烯酸代谢途径及其变化可能参与了食管鳞癌的癌变过程。

在食管腺癌发病分子机制的研究中，基因表达谱芯片同样发挥了更大作用。

Ｄａｈｌｂｅｒｇ等［５］应用ｃＤＮＡ芯片对食管腺癌１２０００个基因的表达情况进行了检测，其中食管腺癌１０例、正常胃黏膜６例、食管黏膜７例、异型增生Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓ上皮３例，食管腺癌转移淋巴结２例、食管鳞癌１例和２个食管癌细胞株。

与正常食管黏膜上皮相比，配对资料分析显示腺癌中有６４个上调基因和１１２个下调基因，表达变化达４倍以上。

这些基因涉及细胞骨架、细胞黏附、肿瘤抑制和信号传导等功能。

日本学者Ｋａｎ［６］等采用ｃＤＮＡ芯片同时对多种食管癌细胞株和食管癌组织进行检测，发现了一批在食管癌细胞株中普遍出现差异性表达的基因，还发现部分食管腺癌细胞株（ＫＹＡＥ和ＯＥ－３３）和鳞癌细胞株（ＫＹＳＥ）的基因表达谱有所不同，但ＳＫ－ＧＴ－４、ＴＥ７等腺癌细胞株和鳞癌细胞株的基因表达谱相近。

比较肿瘤细胞株和癌组织基因表达谱，也存在显著不同，特别是基质金属蛋白酶、纤溶酶原活化因子、胶原、桩蛋白和血小板凝血酶敏感蛋白２等在食管癌细胞株中表达明显增加，但在食管癌组织中无变化。

对食管癌基因表达谱中的２３个基因聚差异性表达类分析表明，其对判断患者预后具有一定价值。

二、基因芯片在食管癌发生过程基因表达变化研究中的应用一般认为食管癌的发生由正常上皮→不典型增生→癌变的多步骤过程，并涉及多个基因变化。

运用基因芯片检测手段，比较分析其基因表达谱变化，可快速有效地发现与食管癌发生、发展有关的信息。

Ｘｕ等［７］应用４０９６个基因的ｃＤＮＡ芯片分别对食管癌、癌前病变和正常上皮组织进行了分析，结果发现与正常组织比较肿瘤组织中有１３５个基因出现差异性表达，其中上调８５个基因，下调５０个基因；癌前病变组织有３１个基因出现差异性表达，其中上调２７个，下调４个。

癌前病变与肿瘤组织比较，１３个基因有相似变化，而另１８个基因仅在癌前病变组织中出现差异性表达。

据此推测在肿瘤组织中出现差异性表达的１３５个基因可能与肿瘤的发生、进展有关，在癌前病变组织中差异性表达的３１个基因可能涉及肿瘤的起源和发展。

根据食管鳞癌发生过程中不同的病理阶段，Ｚｈｏｕ等［８］应用ｃＤＮＡ芯片分别对基底细胞单纯性增生、不典型增生、原位癌、早期癌和晚期癌基因表达谱进行对比分析，发现５８８个待测肿瘤相关基因中，有１００多个基因在食管鳞癌发生、发展的不同阶段出现了差异性表达，特别是Ｐ１６０ＲＯＣＫ、ＪＮＫ２等基因可能在食管鳞癌的发生早期发挥了重要作用。

Ｌｕ等［９］亦进行了类似的研究，发现在鳞状上皮轻度不典型增生中许多基因表达已发生变化，部分肿瘤相关基因在食管鳞状上皮不典型增生和肿瘤组织中出现高表达或过度表达。

因而认为基因芯片有助于发现食管癌相关基因，可为食管癌的早期诊断和治疗提供有价值的线索。

三、基因芯片在食管癌发病分子机制研究中的应用应用分子水平阐述食管癌的发病机制，对食管癌的预防、诊断和治疗具有重要意义。

Ｙｏｓｈｉｎａｇａ等［１０］发现ａｃｔｉｖｉｎＡ与食管癌淋巴结转移密切相关；将ａｃｔｉｖｉｎＡ的亚单位（ａｃｔｉｖｉｎβＡ）基因转染到人食管癌细胞株内，通过ｃＤＮＡ芯片分析该细胞株和对照细胞株的基因表达谱，发现Ｎ－钙黏蛋白（ｃａｄ－ｈｅｒｉｎ）在转染细胞株中表达明显增加；临床上检测Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎｍＲＮＡ和ａｃｔｉｖｉｎβＡｍＲＮＡ水平密切相关；临床病理学分析表明，Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎｍＲＮＡ的表达与肿瘤浸润深度呈正相关。

病例分组研究亦证实，Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎｍＲＮＡ高表达者的预后较低表达者明显为差。

笔者认为ａｃｔｉｖｉｎＡ可能通过调节Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ表达来影响食管癌淋巴结转移和预后。

酸反流是促进Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓ食管形成和发展为Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓ腺癌的重要因素，短暂的酸暴露可促进细胞增殖，这种高增殖反应可能与Ｎａ（＋）－Ｈ＋交换器活性和ＭＡＰＫ信号传导通路变化有关。

Ｍｏｒｇａｎ等［１１］在探讨酸反流对食管黏膜作用的分子病理机制时，通过基因芯片筛查Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓ腺癌细胞株ＳＥＧ－１在酸暴露前后不同时段之间的基因表达差异，结果发现１３８个基因在酸暴露前后的不同时段出现表达变化，早期表达下调基因涉及细胞凋亡，早期表达上调基因则与细胞增殖有关，并通过ＲＴ－ＰＣＲ证实了芯片检测结果。

基因表达谱分析还提示ＭＡＰＫ途径可能通过依赖ｐ５３调控途径而发挥抑制细胞凋亡的作用。

四、生物芯片在寻找食管癌特异性标记物中的应用通过基因表达谱的不同可鉴别恶性肿瘤和癌前病变，以期发现早期诊断标记物是基因芯片的重要功能之一。

Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ等［１２］首先利用基因芯片技术分析Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓ食管和Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓ食管相关性腺癌的基因表达谱的不同，并筛选出２３个基因。

应用实时定量ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、Ｔａｑｍａｎ和ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｔｏｏｌｓ三种方法对９８个标本（１９例Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓ食管和２０例Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓ食管相关性腺癌）进行了分析，发现已筛选的２３个基因在腺癌和Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓ食管之间表达差异显著，推测由这些基因构建的小型检测芯片对与Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓ食管相关性腺癌可能具有一定的早期诊断价值。

美国学者Ｓｅｌａｒｕ等［１３］采用ｃＤＮＡ芯片结合生物信息学工具，对手术标本和内镜活检标本中Ｂａｒｒｅｔｔ’ｓ食管、食管鳞癌、食管腺癌和食管印戒细胞癌的８０００个基因表达谱进行分析研究，认为ｃＤＮＡ芯片结合生物信息学技术可完成不同病理类型食管癌和癌前病变的鉴别，并可用于小的活检标本，这一研究结果表明基因芯片技术在食管癌基因诊断中具有广阔的应用前景。

寻找、发现食管癌特异性标记物对食管癌的治疗和改善预后具有重要意义。

在这一研究领域中，运用基因芯片和组织芯片可对大量待选基因和相关蛋白进行快速高通量筛选。

Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ等［１４］用ｃＤＮＡ芯片对２６例食管癌组织基因表达谱进行检测，发现增殖潜能相关抗原（ＰＰ－ＲＰ）ｍＲＮＡ水平在食管鳞癌组织显著增加，与正常食管上皮组织相比，ＰＰ－ＲＰ表达率相对比达３９６．２。

免疫组化检测亦发现ＰＰ－ＲＰ蛋白在食管鳞癌细胞中表达明显增加，而在正常细胞中几乎不表达。

针对这种高特异性抗原制定的免疫治疗方案无疑将对食管癌免疫治疗提供新的思路。

Ｆｕｒｉｎ蛋白是一种前蛋白转化酶，能激活多种肿瘤生长相关因子，如生长因子及其受体、黏附分子和基质降解酶等。

Ｌｏｐｅｚ等［１５］采用包括食管、口腔和支气管鳞癌组织的组织芯片，通过免疫组化法检测Ｆｕｒｉｎ蛋白在鳞癌组织中的表达情况，并与常规石蜡包埋的鳞癌标本、正常鳞状上皮和鳞状上皮不典型增生组织进行比较，发现Ｆｕｒｉｎ蛋白在鳞癌组织中高表达，并可能与鳞癌的发生、发展密切相关。