聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶
6-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶植物098 原硕0901080808摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生化反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装臵、凝胶配臵等问题，熟悉所有的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。
关键字：聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，同工酶一、研究背景及目的：同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
它们是DNA编码的遗传信息表达的结果。
最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等有一定关系。
因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高、重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。
过氧化物是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断变化。
因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一种时期植物体内代谢的变化。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生化反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装臵、凝胶配臵等问题，熟悉所有的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。
二、研究依据及原理：聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N ，N —四甲基乙二胺(N，N，N ，N —tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。
实验五过氧化物同工酶PAGE分析
成分
含量
作用
A液（30%Acr-0.8%Bis） 2.65mL
交联剂
B液（Tris+EDTA） 4.75mL
缓冲液
C液（TEMED）
10μL
加速剂
D液（10% AP）
50μL
催化剂
四、操作步骤
样品制备 称取小麦幼苗叶片0.5 克，放入研钵内，
加 pH8.0 样品提取液1mL，于冰浴中研 成匀浆，转入离心管，在高速离心机上以 8000rpm 离心 10 分钟，倒出上清液， 以等量 40%蔗糖混合，并加2滴溴酚蓝， 即为样品液。
同功酶是机体调节酶活性的一种方式，在各种生物体中 广泛存在。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。 它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。 在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此， 测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某 一时期植物体内代谢的变化。
（二）过氧化物同工酶及其活性染色（P98）
三、材料、仪器和试剂
试剂：
A液：30%Acr-0.8%Bis B液：Tris+EDTA C液：TEMED D液：10%AP 电极缓冲液：硼酸钠-硼酸（pH8.3） 0.5%溴酚蓝 染色液：0.1%联苯胺 样品提取液：pH8.0Tris-HCl缓冲液 40%蔗糖溶液
四、操作步骤
凝胶制备
四、操作步骤
装槽、上样
30-50μL
四、操作步骤
电泳 接好电源线(上槽接负极，下槽接正极)。
打开电源开关，调节电压，以10V/cm稳 定电压电泳，待前沿指示染料溴酚蓝下行 至距胶板末端1-2 厘米处，即可停止电泳。
四、操作步骤
剥胶、染色
烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
实验八 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、实验目的１ 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
２ 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。
３ 掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。
４ 掌握过氧化物酶的活性的测定。
二 实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr ）和交联剂（即共聚体的N,N －甲叉双丙烯酰胺 Bis ）在加速剂（N,N,N ’,N ’－四甲基乙二胺 TEMED ）和催化剂（过硫酸胺 (NH 4)4S 2O 8 简称AP ）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性１ 聚合反应聚丙烯酰胺是由Acr 和Bis 在催化剂（AP ）或核黄素（C 17H 20O 6N 4）和加速剂（TEMDA ）的作用下聚合而成的三维网状结构。
催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有２种催化体系：① AP-TEMED 属化学聚合作用② 核黄素－TEMED 属光聚合作用２ 凝胶孔径的可调性及其相关性质① 凝胶性能与总浓度及交联度的关系凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr 与Bis 之比： 00100a bT m +=⨯ a:b<10 脆硬乳白交联度： 00100bc a b =⨯+ a:b>100糊状易断② 凝胶浓度与孔径的关系T （Acr 和Bis 总浓度）增加 孔径减小 移动颗粒穿过网孔阻力增加③ 凝胶浓度与被分离物分子量的关系分子量增加 阻力增加 移动速度减慢。
同时还与分子形状及分子电荷有关系。
在操作时，可以选用007.5凝胶。
因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。
３ 试剂对凝胶聚合的影响水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ）原理根据有无浓缩效应可分为：连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH 值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。
实验二 过氧化物酶同工酶的提取、分离
实验二过氧化物酶同工酶的提取、分离苟亚峰摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定玉米幼苗过氧化物酶同工酶，实验结果显示玉米幼苗中至少含有5种过氧化物同工酶。
关键词：过氧化物同工酶；PAGE；电泳分离引言同工酶是指催化同一种化学反应，但酶的分子结构组成却有所不同的一组酶。
同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如过氧化物酶在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。
电泳(electrophoresis，简称EP ) 指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
1937年瑞典科学家Tiselius 成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖。
50年代，先后出现了以滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物的电泳技术。
60年代，出现了聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。
这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基团体系时，就会聚合。
引发产生自由基的方法有两种：（1）化学法：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺单体形成单体长链。
化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；（2）光聚合法：光聚合法的催化剂是核黄素（VB2），光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。
垂直板聚丙烯酰胺凝胶连续电泳分离乳酸脱氢酶同工酶(活性染色鉴定法)
电泳结果实例
1 2 3 4
LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1
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电泳装置
采用Pharmacia公司的SE250小型夹心式垂直 板电泳装置： 制胶装置 制备凝胶板 电泳装置 进行凝胶电泳 每组（2人）做一块胶，两组共用一套电泳装置， 两套电泳槽共用一台电泳仪。
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操作步骤
一、样品制备： 样品制备： 断脊椎处死小鼠，取适量小鼠骨骼肌、肝脏、 心肌和脑组织，加入5倍组织重的匀in，15 min)， 吸出上清液，加入等体积40 %的蔗糖（含少许溴酚 蓝）混匀，放置4℃冰箱中备用。
3
AP-TMTED催化体系 AP-TMTED催化体系
TEMED催化 生成硫酸自由基： 催化AP生成硫酸自由基 催化 生成硫酸自由基：
－ S2O82－
2SO4
硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链： 单体并形成单体长链： 硫酸自由基的氧原子激活 单体并形成单体长链
Bis将单体长链间连成网状结构： 将单体长链间连成网状结构： 将单体长链间连成网状结构
10电荷因素蛋白质分子形状和大小相同所带电荷性质和数量不同分子大小蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同分子大小不同分子形状蛋白质分子所带电荷性质和数量相同分子形状不同电荷因素分子大小分子形状11连续系统是指电泳系统采用相同孔径的凝胶缓冲系统等条件下进行区带电泳是利用蛋白质分子的电荷效应进行分离凝胶的分子筛效应不明显一般只用于分离一些比较简单的样品缺点是分辨率不高
6
温度
分子氧
杂质
凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响
凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝 胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因 素。T为凝胶溶液中单体和交联剂的总质量浓度，C为凝胶溶液中交联 剂占单体和交联剂总量的质量分数。 b a+b C = × 100 % T = × 100 % a+b m 式中，a为丙烯酰胺单体的质量(g)，b为交联剂的质量(g)，m为溶液的 终体积(mL)。 凝胶a、b的比例决定了凝胶的物理性状。当a:b小于10时，凝胶脆且硬， 不透明，呈乳白色；当a:b大于100时，即使用5%的丙烯酰胺凝胶也呈 糊状；通常用a:b在30左右，并且丙烯酰胺浓度高于3%，凝胶富有弹 性并且透明。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分析过氧化物酶同工酶
实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶一、目的同工酶是指能催化同一种化学反应， 但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组 酶。
它们是 DNA 编码的遗传信息表达的结果。
最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生 长发、代谢调节及抗性等都有一定的关系。
因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的 意义。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高，重现性强，测定结果便于 观察、记录和保存。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生 长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。
因此，测定这种酶 的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶 的生物化学反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装置、凝胶配制等问题，熟悉所有 的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。
二、原理1．电泳现象带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
由于带电胶粒或分子中各种成份，所具有的电荷和分子量不同，在电场中将以不同的速 度移动，因而在电泳进行过程中，不同的成份将按照各自的迁移速度得到有效的分离。
2．影响电泳的主要因素若将带净电荷 q 的粒子放入电场，则该粒子所受到的引力 F 引可用数学式表示如下：F 引 =E × q (1)式中 E 为电场强度，单位为“伏特／厘米” ，表示电场中单位距离上的电位差。
如果这种情况发生在真空中，则带电粒子会朝着电极加速前进并且最后与电极相撞。
但 在溶液中，由于电场的牵引力 F 引与加速运动的粒子和溶液之间产生的阻力（即摩擦力）F 阻 相对抗，故上述现象不会发生。
根本 Stokes 公式，阻力的大小取决于粒子的大小和形状以 及所在介质的粘度：F 阻 = 6pghn(2) 式中 F 阻是球形粒子所受的阻力，g 是球形粒子的半径，h 是溶液的粘度，n 是粒子移动的速度。
植物过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳实验指导
植物过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳【目的】1．掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及操作过程。
2．了解聚丙烯酰胺圆盘电泳的实际应用，利用此法分离植物过氧化物同工酶。
【概述】1．聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支承物的一种电泳技术。
其凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构。
凝胶网孔的大小可通过改变单体浓度和交联剂浓度的比例加以调节，常用的所谓标准凝胶是指含丙烯酰胺7%～7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能达到满意的结果。
聚丙烯酰凝胶电泳过程中除了一种电泳所具有的电荷效应外，还具有“分子筛”效应；不连续的凝胶电泳过程中具有电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
不连续凝胶电泳体系的不连续性体现在：（1）凝胶由上、下两层组成，两层胶孔孔径不同。
上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH 值不同。
如常用的碱性系统中，电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl 缓冲液，分离胶为pH8.9的Tris-HCl 缓冲液。
（3）在电场中形成不连续的电位梯度。
在这种不连续的系统中有三种物理效应起作用，使样品分离效果好、分辨率高。
这三种效应是电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
① 电荷效应 由于各种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而在一定电场作用下迁移率不同。
承载有并效电荷多的，泳动的快，反之则慢。
CH 2CH C=O NH 3CH 2=CH C=O NH CH 2NH C=O CH 2+CH 2CH C=O NH 3CH 2CH C=O NH 3C=O NH CH 2NH C=O CH 2CH 2CH [[]]nn 催化剂② 分子筛效应 因为聚丙烯酰胺具有网孔结构，所以直径大，形状不规则的分子，电泳时通过凝胶受到的阻力大，移动较慢；分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到的阻力小移动较快。
聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE
过氧化物酶染色原理
过氧化物酶能催化过氧化氢把联苯胺氧化 为蓝色或棕色产物
电泳装置
本实验采用不连续系统凝胶电泳，
整个电泳系统包括DYY型常压电泳
仪、夹心式垂直板电泳槽。
试剂
（1）1.5％琼脂 （3）分离胶缓冲液，pH8.9 (pH8.9 Tris-HCl缓冲液) （5）浓缩胶缓冲液，pH6.7 (pH6.7 Tris-HCl缓冲液) （2）核黄素溶液 （4）电极缓冲液，pH8.3 (pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液) （6）40％蔗糖溶液
实验4、聚丙烯酰胺凝胶电泳 分析过氧化物酶同工酶
同工酶
• 电泳 是指带电粒子在电场中向与其自
身带相反电荷的电极移动的现象。
带负电粒子
正极
带正电粒子
负极
影响电泳速度的外界因素
1.电场强度
电场强度也称电位梯度，是指单位长度 （每一厘米）支持物体上的电位降 一般，电场强度越高，带电颗粒移动速 度越快。 过高、过低均不宜 当需要增大电场强度以缩短电泳时间时， 需附有冷却装置
2．缓冲液的pH值和离子强度
pH 值距离其等电点愈远，其所带 净电荷量就越大，电泳的速度也 就越大
缓冲液通常要保持一定的离子强 度，一般所用离子强度为 0.020.2之间。
3.电渗现象
液体在电场中对于一个固体支 持物的相对移动，称为电渗现 象。
电渗方向影响泳动速率
4、温度的影响
温度每升高 1 ℃，迁移率约增加 2.4%。为降低热效应对电泳的影 响，可控制电压或电流，或在电 泳系统中安装冷却散热装置。
pH8.9
(a)
１、电荷效应：各种蛋白质按其所带电 荷的种类及数量，在电场向一定电极， 以一定速度泳动。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
TEMED 丙烯酰胺 + 甲叉双丙烯酰胺------------------聚丙烯酰胺凝胶 Ap (三维网状结构)
AP-TMTED催化体系
TEMED催化AP生成硫酸自由基：
S2O82－
¯ 2SO4·
硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：
Bis将单体长链间连成网状结构：
通过改变凝 胶浓度及交 联度来调节 凝胶的孔径， 具有良好的 分子筛效应。
试剂贮备液瓶号 ①分离胶缓冲液 吸取毫升数
②分离胶贮液 ③过硫酸铵 蒸馏水 4ml 8ml 2ml
2ml
混匀，立即用装有针头的注射器将凝胶液缓缓注入已准 备好的干洁胶室中。胶室两侧和底部要防止渗漏，注胶 过程中要防止气泡产生。胶液加至离玻璃板顶部约 0.8cm处，此时将电泳槽垂直放置；立即注入蒸馏水使 胶的表面覆盖少量水层。约30min后，胶和水层之间出 现清晰的界面，表明聚合完成。
3、样品的制备
过氧化物酶的提取：称 取1g甘薯叶柄置于冰浴 上的研钵内，加入1ml样 品提取液(内含 pH6.8 、 0.05mol/L Tris－HCl， 20%蔗糖)研成匀浆后， 再加2ml提取液研磨均匀， 转入离心管，于3500rpm 离心15min，其上清液即 为酶的提取液，供电泳 分析用。
7、绘制酶谱条带，并计算各同工酶的迁移率
[结果计算]： a Rf值 = ----b
a
b
四、注意事项
安装玻璃夹心槽时，两片玻璃要干燥，有机玻璃条要夹平并用 胶布密封好。 分离胶或浓缩胶配制好的混合液要马上进行灌胶，以免溶液聚 合成胶。 过硫酸铵要现用现配。 分离胶灌好，上层要覆盖一层水层，避免胶氧化，同时使分离 胶胶面平整。 电泳仪连接电泳槽后，通电要严格控制电泳，每个电泳槽的电 流不能超过10mA,电压不能超过170V，电压过高会导致玻璃板 裂开。 染料必须现用现配。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离LDH同工酶
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离LDH同工酶一、实验目的1.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。
2.学习聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法分离LDH同工酶。
二、实验原理LDH 同工酶是由催化反应相同、分子结构和理化性质不同的一组酶组成，由于分子效应和电荷效应，他们分别以不同的速度在以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳中泳动，可分离出5种同工酶，泳动速度为LDH1> LDH2> LDH3> LDH4> LDH5。
聚丙烯酰胺凝胶电泳有丙烯酰胺单体和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂作用下，形成的三维网状结构称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称PAGE），电泳速度与粒子所带电荷、粒子大小有关外，还与网络的孔径有关。
粒子大于凝胶孔径的，电泳速度慢。
反之则电泳速度快。
三、实验试剂30％凝胶贮存液：丙烯酰胺29g，亚甲双丙烯酰胺1g，加蒸馏水溶至100ml，过滤棕色瓶4度保存。
Tris-甘氨酸电极缓冲液（5X）：Tris碱 15.1g 甘氨酸94g溶解于900ml去离子水中调解为PH8.3用去离子水定容至1000ml。
10％过硫酸铵：将0.5g过硫酸铵溶解于5ml水中。
Tris-Hcl 1.5mol／ml（ PH8.8）：18.165g Tris碱溶解于40ml水中，用1mol/lHCl调节PH至8.8，加水定容至100ml。
Tris-Hcl 0.5mol／ml（ PH6.8）：12.11g Tris碱溶解于40ml水中，用1mol/lHCl调节PH至6.8，加水定容至100ml。
2X样品缓冲液：Tris碱0.76g 蔗糖20g加41.5ml水溶解，然后加蒸馏水定容至50ml。
染色液：甲醇250ml 冰乙酸50ml 考马斯亮R250 0.5g去离子水200ml.脱色液：甲醇250ml 冰乙酸80ml去离子水200ml。
TEMED（四甲基乙二胺）四、实验操作1 PAGE凝胶的制备12%分离胶配方大约注入玻璃板的2/3轻轻在其顶层加入少量去离子水以磨平胶面。
荞麦过氧化物酶同工酶研究
生 ’ 。过氧化物酶同工 酶是基 因表达的产物 ， 。］ “ 对其
研 究能够 从分 子水平 上 揭示 物 种 的遗 传 基 础 ， 在物 种
的鉴定 、 起源 、 进化 和分类等 方面研 究上 已发挥着 重要 作 用 。另 外 ， 炳 庆 ］谢 可 军 等 ］林 新 春 垃 区 、 、 等 李 雪等 ］铁 军等 的研 究 均 发现 过 氧化 物酶 、 同工酶 能作为 植物 的分类依 据 。 目前 ， 国内外有 关荞 麦 过 氧化 物 酶 同工酶 的 研究 报道较 少 。主要有 高洪君 等 对甜 荞几 个 收集 系 ， 赵
１ ３ 数据 分析 方法 ．
甜 荞 Ｅ ０ １１０ Ｆ ｅ ￣ｅ ｏ ２ × 贵州大方 县马场镇 Ｅ Ｓ２ ７ ２０ １ ．ｓ ｌ＇， ０ ｃ ｒｍ ｄ Ｓ１ Ｅ ０ １０ ０ Ｓ２ ７ ０ ３ １ ０ Ｅ ０ １ １０ Ｓ２ ７ ２ ０２ ０
Ｅ ２ ０ ０ １０ Ｓ ０ ７ ９７ １ Ｅ ０ ７ ２０ ３ Ｓ ０ １ １０ ２ Ｅ ０ ８ ２ ８ １ Ｓ２０ ０ １０ Ｅ ０ ７ ０４ １ Ｓ ０ １０ ０ ２
Ｅ Ｓ８
本 研究 采用 系 统聚类 法 ， 首先 将各 样本看 成一 类 ，
有 酶带 数 计 为 １ 无 酶带 计 为 ０ 使用 Ｓ Ｓ １５分 析 ， ， Ｐ Ｓ１．
ｅｃｌ ｔｍ ２ Ｘ 贵 州 威 宁 雪 山镇 ｓｕｅ ｕ ｎ
贵 州 黔 西 县
软件 ， 利用欧氏距离计算样 品间距离， 用最短距离法计 算 类 群 间 距 离 ， 系 统 聚类 分 析 方 法 对 其 进 行 聚 类 按
１ 材 料 与 方 法
１１ 材 ． 料
作者简介： 张以忠（ ９ ７一）， ， １７ 男 硕士 ， 副教授 ， 在读博士研究生 ； 研究方
过氧化物酶同工酶的提取、分离
反之越快； ⑤电场强度：
电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快； ⑥离子强度：
离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快； ⑦电渗现象：
电场中，液体相对于固体支持物的相对移动； ⑧支持物筛孔大小：
孔径小，电泳速度慢，反之则快。
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4、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作 为载体的一种区带电泳。
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(1)聚丙烯胺凝胶的生成：
聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲 叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。在具 有自由基时，Acr和Bis就会聚合。
引发产生自由基的方法有两种：
①化学法 ②光聚合法
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①化学聚合：
引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’－ 四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生氧自由 基，激活单体形成自由基，发生聚合。化学聚合形成的凝 胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；
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4.2 点样：
轻拔电泳梳子→用微量进样器点样→每孔约30μl。
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5、电泳：
接通电源→稳流→调节电流到每孔 1mA左右→当溴酚蓝前沿进入分离胶后，可 适当加大电流→待前沿下行到距胶末1cm处，
停止电泳。
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6、剥胶、固定、染色：
将凝胶板取下→放入装水瓷盘中→剥 下胶片→并浸洗二次→倒去水→加入固定 液10分钟→倒去固定液→加显色液（联苯 胺），显色→观察记录。
a与b的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，a 与b的重量比应在30左右。常用29 ： 1
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(4)不连续PAGE的原理：
第一、三个不连续性： ①凝胶孔径的不连续； ②缓冲液离子组成及各层凝胶pH的不连续； ③在电场中形成的电位梯度的不连续。
过氧化物酶同工酶电泳分析（经典有用）
过氧化物酶同⼯酶电泳分析（经典有⽤）过氧化物酶同⼯酶电泳分析实验原理（1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。
上层为⼤孔径的浓缩胶，下层为⼩孔径的分离胶。
（2）缓冲液离⼦组成及各层凝胶的pH不同。
本实验采⽤碱性系统。
电极缓冲液为pH8.3的Tris-⽢氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。
⽽分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。
（3）在电场中形成不连续的电位梯度。
在这样⼀个不连续的系统⾥，存在三种物理效应，即电荷效应、分⼦筛效应和浓缩效应。
在这三种效应的共同作⽤下，待测物质被很好地分离开来。
下⾯以本实验要分离的⼩麦苗过氧化物酶同⼯酶为例，分别说明三种效应的作⽤：（1）电荷效应：各种酶蛋⽩按其所带电荷的种类及数量，在电场作⽤下向⼀定电极，以⼀定速度泳动。
（2）分⼦筛效应：分⼦量⼩，形状为球形的分⼦在电泳过程中受到阻⼒较⼩，移动较快；反之，分⼦量⼤、形状不规则的分⼦，电泳过程中受到的阻⼒较⼤，移动较慢。
这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。
（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，⽽使原来很稀的样品得到⾼度浓缩。
其原因如下：①由于两层凝胶孔径不同，酶蛋⽩向下移动到两层凝胶界⾯时，阻⼒突然加⼤，速度变慢。
使得在该界⾯处的待分离酶蛋⽩区带变窄，浓度升⾼。
②在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶⽤的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。
HCl 是强电解质，不管在哪层胶中，HCl⼏乎都全部电离，Cl－布满整个胶板。
待分离的酶蛋⽩样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-⽢氨酸缓冲液中。
电泳⼀开始，有效泳动率最⼤的Cl－迅速跑到最前边，成为快离⼦（前导离⼦）。
在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％的⽢氨酸（pI = 6.0 ）有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离⼦（尾随离⼦）。
这样，快离⼦和慢离⼦之间就形成了⼀个不断移动的界⾯。
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班级：植物118 姓名：凌云学号：1101080807 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶2012.12.11研究背景：同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
它们是DNA 编码的遗传信息表达的结果。
最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发、代谢调节及抗性等都有一定的关系。
因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。
因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
实验原理：电泳现象：带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(简称EP )。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生物化学反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
影响电泳的主要因素：若将带静电荷q的粒子放入电场，则该粒子所收到的引力F引可用数学式表示如下： F引=E·q （1）式中E为电场强度，单位为“伏特/厘米”，表示电场中单位距离上的电位差。
如果这种情况发生在真空中，则带电粒子会朝着电极加速前进并且最后与电极相撞。
但在溶液中，由于电场的牵引力F引与加速运动的粒子和溶液之间产生的阻力F引相对抗，故上述现象不会发生。
根据Stokes公式，阻力的大小取决于粒子的大小和形状以及所在介质的粘度： F阻=6πγηv （2）式中F阻是球形粒子所受的阻力，γ是球形粒子的半径，η是溶液的浓度，v是粒子移动的速度。
在溶液中，由电场而产生的加速力被阻力所对抗，因此：E·q=6πγηv （3）整理可得： v= E·q6πγμ（4）由此可以看出，粒子移动速度（v）与电场强度（E）和粒子所带电荷量（q）成正比，而与粒子的大小（γ）和溶液的粘度（η）成反比。
不难想象，非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子的形状有关。
由于带电粒子的泳动速度受场强影响，使得同一带电粒子在不同电场里泳动速度不同。
为了便于分析比较，常用迁移率（泳动度）代替泳动速度表示粒子的泳动情况，迁移率（泳动度）的定义是：带电粒子在单位电场强度下的泳动速度，若以m表示迁移率，则：m=v/E （5）将（4）代入（5）式得： m=q/6πγη（6）由上式可看出，迁移率（泳动度）m仅与带电粒子所带电荷的数量、粒子大小及形状和溶液度有关，而与电场强度无关了。
由于氨基酸、蛋白质、酶等的电离度α随溶液pH变化而变化，所以在实际电泳中，我们常使用有效迁移率这个概念，有效迁移率（μ）定义为迁移率（m）和当时条件下电离度α的乘积。
即：μ=m·α（7）将（6）代入（7）式：μ=q·α/6πγη（8）由（8）式可看出，凡能影响溶液粘度η的因素如温度，影响分子带电量q 及电离度α的因素如pH值的改变，均会对有效迁移率产生影响。
因此，电泳尽可能在恒温条件下进行，并选用一定pH的缓冲液。
同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好。
这样，在外部条件基本稳定的情况下，各种成分将按其自身特有的性质在电泳中得到很好的分离。
以上讨论的基本上是在溶液中进行的自由电泳的情况。
而在实际应用中，为了便于分析、鉴定、保存结果或制备的需要，我们往往使用适宜的载体。
电泳时应避免选用高电渗物质作支持介质。
适宜的支持介质是电泳技术成败的关键。
最后要考虑选用离子强度适宜的溶液，一般最适的离子强度在0.02-0.2之间。
在稀溶液中，离子强度I可用下式计算：I=0.5∑M i Z i²（9）式中：M i为离子的克分子浓度，Z i为离子的价数。
聚丙烯酰胺凝胶的形成与特点：这种凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂N,N'-甲叉双丙烯酰胺，在催化剂的作用下聚合而成的。
Acr和Bis 在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤，但在具有自由基团体系时，它们就聚合，引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。
化学聚合的引发剂是过硫酸铵，催化剂是N,N,N'N'-四甲基乙胺（TEMED）。
在催化剂TEMED作用下，由过硫酸铵（Ap）形成氧的自由基，从而引起聚合作用。
TEMED在低pH时失效，会使聚合作用延迟，冷却也可使聚合速度变慢。
一些金属抑制聚合，分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用，这些因素在实际操作时应予以控制。
光聚合以光敏感物核黄素作为催化，痕量氧存在下，不太稳定，所以用它制备大孔痕的浓缩胶较为合适，采用化学聚合形成的凝胶孔径较小，而且重复性好，常用来制备分离胶。
聚丙烯酰胺的基本结构，为丙烯酰胺单位构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联在一起。
链的纵横交错，形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛性质，网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。
此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶。
该结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。
这些特点，使得聚丙烯酰胺特别适于作区带电泳的支持介质。
聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。
每100ml凝胶溶液中含有的单体（Acr）和交联剂（Bis）总克数称为凝胶浓度。
用T%表示。
凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的百分数称为交联度，用C%表示，改变凝胶浓度和交联度，可获得不同密度、粘度、弹性、机械强度和孔径大小的凝胶，以便适应各种样品的分离。
一般常用7.5%浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，可骼2.4%的分离核酸。
但根据蛋白质与核酸分子量不同，适用的浓度也不同。
凝胶系统：本实验采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶系统，分离小麦苗过氧化物酶的同工酶，系统的不连续性表现在以下几个方面：（1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。
上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。
本实验采用碱性系统。
电极缓冲液为pH8.3的Tris-Gly缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。
而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。
（3）由于pH不连续，在电场中形成了不连续的电位梯度。
在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。
下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用：（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。
（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。
这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。
（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。
其原因如下：A.由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。
使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。
B.在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。
HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl－布满整个胶板。
待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。
电泳一开始，有效泳动率最大的Cl－迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。
在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％的甘氨酸（pI = 6.0 ）有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。
这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。
在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。
由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区，即低电导区。
因为电位梯度V、电流强度I和电导率S之间有如下关系：V=I/S所以在电流恒定条件下低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。
这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子。
本来夹在快慢离子之间的酶蛋白区带，在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。
这就是所谓的浓缩效应。
在此区带中，各种酶蛋白又按其电荷而分成不同层次，在进入分离胶前被初步分离，形成若干条离得很近但又不同的“起跑线”。
当酶蛋白和慢离子都进入分离胶后，pH从6.7变为8.9，甘氨酸解离度剧增，有效迁移率迅速加大，从而赶上并超过所有酶蛋白分子。
此时，快慢离子的界面跑到被分离的酶蛋白之前，不连续的高电位梯度不再存在。
于是，此后的电泳过程中，酶蛋白在一个均一的电位梯度和pH条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。
与连续系统相比，不连续系统的分辨率大大提高，因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。
8.样品的检出及分析鉴定和保存仪器试剂：材料：小麦幼苗仪器：电泳仪一套（稳压电源及垂直板电泳槽）北京六一仪器厂微量进样品，100μl 上海医用激光仪器厂试剂：2%琼脂、分离胶缓冲液pH8.9、浓缩胶缓冲液pH6.7、过硫酸铵溶液、电极缓冲液pH8.3、pH4.7乙酸缓冲液、样品提取液、0.5%溴酚蓝溶液、联大茴香胺染色液、TEMED(四甲基乙二胺)实验步骤：1.贮液配制（已配好）2.凝胶的制备（1）将贮液由冰箱取出，待与室温平衡后再配置工作液（2）安装电泳槽。
安装时，注意旋紧螺丝时，需均衡用力，以免夹碎玻璃片（3）用2%的琼脂糖封底，以防漏胶（4）按下表所示配制分离胶贮液号 2 4 15 6名称分离胶缓冲液分离丙胶H2O TEMED 过硫酸铵1.32.7 6.0 0.040 0.7用量（ml）在小烧杯中混匀后，立即灌胶，灌胶时，将电泳槽略微倾斜，用于扶稳，将小烧杯尖端抵在长玻璃片顶端中央某点，小心估倒入两玻璃片之间，灌至距短玻璃片顶端2厘米左右即可，放平电泳槽，立即用滴管在胶的上层小心轻缓地覆盖约2-3毫米厚的水层；灌注水层时要均匀轻缓，以防在胶顶部产生漏洞，影响结果，刚加水时，可看出界面，后逐渐消失，等到再出现界面时，表明分离胶已聚合，再静置一会儿，便可将水倒出，可用滤纸条从一侧略微吸浸，注意不要碰毁胶面，然后准备灌注浓缩胶。
（5）按下表所示配制浓缩胶贮液号 3 5 15 6名称浓缩胶缓冲液浓缩丙胶H2O TEMED 过硫酸铵用量0.5 1.0 2.2 0.02 0.3（ml）配制均匀后，立即灌胶，操作同分离胶的灌注，当胶面达到距短玻璃片0.5厘米左右即可，然后立即插入样品槽模板（梳子）。