酯酶同工酶电泳技术

酯酶同工酶电泳

酯酶是催化酯类化合物水解的酶系，目前已发现的酯酶至少有20种。植物酯酶同工酶的分离技术多采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，主要操作步骤介绍如下。

一、试剂

按表1配制贮液和工作溶液---表1 贮液和工作溶液配制用量

注：贮液放在冰箱中一般可保存1～2月，3号贮液只能保存1周。

Acr=丙烯酰胺，Bis=甲叉双丙烯酰胺，TEMED=四甲基乙二胺，Tris=三羟甲基氨基乙烷。

二、制胶

1、由于电泳槽的构造因厂家不同而有所差异，可按电泳槽所附说明书组装好胶板。

2、按上表配制好分离胶工作液，快速混匀，立即用带长针头的注射器吸取一定量的胶液，沿着玻璃板壁加入胶板间，至板顶3cm即可；然后沿着玻璃板壁缓慢加入3～5mm蒸馏水层。刚加水时看出有界面，后逐渐消失；等到再看到界面时表明凝胶已经聚合（一般约30分钟）；再静置30分钟使聚合完全。

3、用注射器吸去分离胶上的水层，用滤纸条吸去残留的水液。按上表配制好浓缩胶工作液，快速混匀，立即用带长针头的注射器吸取一定量的胶液，沿着玻璃板壁加入胶板间以冲洗分离胶的顶部。迅速吸出，立即灌注浓缩胶，当灌至凹型玻璃口3mm处停灌，立即插入样品梳，使凝胶液面高出玻璃1～2mm。然后在距日光灯管10cm处照射进行光聚合。当看到浓缩胶显乳白色（一般6～7分钟），表明聚合开始。继续半小时，使聚合完全。

三、电泳

1、样品提取

取烟苗0.2克，加0.5毫升提取缓冲液（含0.075M Tris-HCl，pH7.5，0.01M KCl，0.01M MgCl

，0.001EDTA，5%蔗糖，0.1%巯基乙醇，5%PVP-

2

聚乙烯基吡咯烷酮），冰块上研磨成匀浆，低温下12000rpm离心15分钟，取上清液置于冰箱中备用。提取缓冲液种类较多，这里介绍的提取缓冲液本实验室曾采用过，可据需要参看其他提取方法。

2、点样

拔出样品梳，吸取样品槽中的水分。用微量移液器加入适量样品液（一般50微升左右）。用移液器缓慢加入电极缓冲液，以覆盖样品。

3、电泳

按说明书在电泳槽上下两极加入适量电极缓冲液，连接到电泳仪上。先调节电压120V；1小时后调高到240V。待指示剂迁移到距分离胶边缘1cm处停止电泳。条件允许时，最好置于冰箱中电泳。

四、染色

卸板，剥下凝胶，放入染色液中进行染色。染色液的配制：称0.15克固兰RR盐溶于150ml 0.1M、pH6.4的磷酸缓冲液中，过滤后加70%内含0.1克醋酸-1-萘酯、0.05克醋酸-1-萘酯的丙酮溶液5 ml。37℃下染色至条带清晰（约1小时），然后加入7%醋酸溶液中脱色、固定。染色液配制并不局限于这里所介绍的方法，可据需要参看其他方法。

用玻璃纸或干胶仪制成干胶永久保存。酯酶活性高低可据酶带的强弱进行描述，如分为强、中、弱；还可利用专门的图像处理系统进行扫描，通过观察其峰值高低来度量。