04分子生物学实验(四)
分子生物学实验技术实验内容讲解
2006年《分子生物学实验技术》实验内容一、RT-PCR（一）总RNA的提取实验安排：每两人抽提一管。
为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。
操作步骤：1、将100μl液体样品加入1.5ml Ep管中，再加入900μl冰预冷的LS-Biotragents TM（苯酚和异硫氰酸胍的混合物）。
2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。
3、加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。
4、在4℃条件下，以10000×g离心15min。
5、将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。
6、在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。
7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。
8、将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-Free Water）将RNA溶解并于-20℃保存。
注意事项：1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC水浸泡过夜。
3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。
（二）反转录实验安排：每人做一管。
反应体系（20μl）：按下列顺序加样反应条件：42℃ 1h注意事项：1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。
如在一般的PCR反应体系中，应先加水、Buffer、dNTPs、引物，最后加酶和模板。
2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。
3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。
分子生物学实验
分子生物学实验（1）琼脂糖凝胶电泳进行DNA分离原理琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。
DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。
具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。
相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子泳动速度不一样。
最前沿的是SCDNA,其后依次是L DNA和OC DNAEB（溴化乙锭）的作用是染色剂，可以插入到DNA的双链中，在紫外线的作用下，会发出白光电泳缓冲液的PH在6~9之间，离子强度0.02~0.05最合适，琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，。
（2）SDS法提取植物基因组DNA的原理利用含高浓度SDS的抽提缓冲液在较高温度（55~65度）条件下裂解植物细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后提高盐浓度（KAc）和降低温度（冰上保温）的办法沉淀除去蛋白质和多糖（在低温下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
（3）DNA回收试剂盒回收DNA原理从琼脂糖凝胶中回收DNA片段．可得到大小一致的DNA片段。
先使凝胶被溶胶液溶解，然后DNA与HiBindTM DNA柱子结合，再从HiBindTM DNA柱子中洗脱出DNA片段。
HiBindTM DNA柱子可以在某种适宜的情况下高效而可逆地结合DNA/RNA，除去蛋白质及其他杂质，而被结合的核酸能很容易地被去离子水或低盐缓冲液洗脱出来。
（4）利用PCR扩增目的基因原理利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的扩人工复制，在很短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需的遗传物质不再受限于活的生物体。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
分子生物学基础试验
03
分子生物学基础试验的种类
DNA提取和检测
目的：从生物样本中提取DNA，并进行检测 原理：利用DNA的物理和化学性质进行提取和检测 步骤：包括样品处理、DNA提取、DNA检测等 应用：广泛应用于基因克隆、基因诊断、基因治疗等领域
基因克隆和表达
基因克隆：将目的基因从原基因组中分离出来，并插入到载体中
定义：分子生物学基础试验是研究细胞内分子结构和功能的实验方法，包括DNA、RNA、蛋白质等。
目的：了解细胞内分子结构和功能，为疾病诊断、治疗和药物研发提供科学依据。
分子生物学基础试验的重要性
研究基因表达和调控机制
探索生命现象的本质和规律
推动生物技术、医药、农业等 领域的发展
提高人类对疾病的认识和治疗 水平
单击此处添加副标题
分子生物学基础试验
汇报人：
目录
01 02 03 04 05 06
添加目录项标题
分子生物学基础试验概述
分子生物学基础试验的种类
分子生物学基础试验的应用 分子生物学基础试验的实验步骤和
注意事项 分子生物学基础试验的发展趋势和
未来展望
01
添加目录项标题
02
分子生物学基础试验概述
分子生物学基础试验的定义和目的
分子生物学基础试验的基本原理
基因表达：基因通过转录和翻译过程，将遗传信息转化为蛋白质
基因突变：基因在复制过程中发生错误，导致遗传信息改变
基因重组：基因在遗传过程中发生交换，导致遗传信息重新组合
基因调控：基因表达受到多种因素的调控，如转录因子、表观遗传修 饰等
基因工程：通过基因重组技术，将外源基因导入到宿主细胞中，实现 遗传信息的转移和表达
步骤：包括样品 制备、分离、纯 化和鉴定等步骤
分子生物学的实验技巧
分子生物学的实验技巧分子生物学作为生物科学的重要分支，主要研究生物分子的结构、功能及其相互作用关系。
合理的实验技巧对于分子生物学的研究至关重要。
下面将介绍几种常用的实验技巧及其操作方法。
一、PCR技术PCR（聚合酶链反应）是分子生物学研究中最常用的技术之一，它能够高效地扩增目标DNA序列。
PCR反应的关键步骤包括：DNA变性（Denaturation）、引物结合（Annealing）和DNA合成（Elongation）。
实验中，我们需要准备好所需的试剂和设备，确保实验台和试管清洁，以避免污染。
同时，掌握好反应温度、时间和引物浓度等重要参数的选择，能够确保PCR反应的成功。
二、凝胶电泳技术凝胶电泳是常用的DNA分子大小分析方法，能够通过电场作用将DNA样品分离出来。
在实验中，我们首先需要准备好凝胶，常用的有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
然后，根据需要选择合适的电泳缓冲液，并将待测样品与DNA标记物一同加入凝胶槽中。
接下来，通过给电极施加电压，使DNA在凝胶中迁移。
最后，通过染色或荧光检测等方法，可可视化目标DNA条带。
当我们操作凝胶电泳时，要注意电流的选择、运行时间和电泳条件的控制，以确保分离结果的准确性。
三、蛋白质SDS-PAGE技术蛋白质的分离与鉴定也是分子生物学研究中的重要内容之一。
其中，SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是最常用的方法之一。
在进行SDS-PAGE实验时，首先需要准备好聚丙烯酰胺凝胶，根据需要选择合适的凝胶浓度和电泳缓冲液。
接着，将蛋白样品与还原剂和SDS缓冲液混合，然后进行样品沸腾变性。
之后，将样品加载到凝胶孔中，施加电压进行电泳。
最后，可以通过染色或Western blot等方法对蛋白进行检测与分析。
四、基因克隆技术基因克隆技术是分子生物学研究中常用的技术之一，它可用于构建重组DNA分子。
在进行基因克隆实验时，需要首先将目标基因进行PCR扩增，然后进行限制性内切酶切割，得到目标基因的载体和酶切后的DNA片段。
分子生物学实训报告
一、实训背景分子生物学是研究生物大分子如蛋白质、核酸的结构与功能的一门学科。
随着生命科学技术的不断发展，分子生物学在医学、农业、环境保护等领域发挥着越来越重要的作用。
为了更好地理解和掌握分子生物学的基本理论和技术，我们开展了为期两周的分子生物学实训课程。
本次实训旨在通过实际操作，加深对分子生物学理论知识的理解，提高实验技能，培养科研素养。
二、实训目的1. 熟悉分子生物学实验室的基本操作规程和安全规范。
2. 掌握DNA提取、PCR扩增、酶切、电泳等分子生物学实验技术。
3. 理解基因克隆、基因表达、蛋白质分析等分子生物学实验原理。
4. 提高团队协作和沟通能力，培养科研素养。
三、实训内容1. 实验室基本操作与安全规范（1）熟悉实验室布局，了解各种仪器的使用方法。
（2）学习实验室安全操作规程，掌握实验室废弃物处理方法。
（3）进行实验前的准备工作，如配制试剂、消毒、无菌操作等。
2. DNA提取（1）了解DNA提取的原理和常用方法。
（2）学习酚-氯仿法提取DNA。
（3）对提取的DNA进行质量检测，如A260/A280比值、琼脂糖凝胶电泳等。
3. PCR扩增（1）了解PCR扩增的原理和步骤。
（2）设计PCR引物，进行PCR反应。
（3）对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
4. 酶切（1）了解酶切原理和酶切反应条件。
（2）学习限制性内切酶的用法。
（3）进行酶切反应，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
5. 电泳（1）了解电泳原理和电泳技术。
（2）学习琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等电泳技术。
（3）对DNA、蛋白质等生物大分子进行电泳分离和检测。
6. 基因克隆、基因表达、蛋白质分析（1）了解基因克隆、基因表达、蛋白质分析的基本原理。
（2）学习相关实验技术，如载体构建、重组表达、蛋白纯化等。
（3）对克隆的基因、表达的蛋白进行检测和分析。
四、实训过程1. 实验前准备（1）查阅相关文献，了解实验原理和操作步骤。
（2）配制实验试剂，确保实验用品齐全。
分子生物学第四章--基因工程常用工具酶
同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。
同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。
B．以切出片段末端性质不同可分，粘性末端和平末端。
粘性末端：（Cohesive Ends）两个突出末端可退火互补— — DNA是分子重组的基础
15
同裂酶
又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别 序列。 在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平 头末端，称为同识同切； 切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端， 称为同识异切。
第四章 基因工程常用工具酶
1
Manipulating Genes
- Transferring Genes
Restriction Ligation Extract DNA
Transformation
Selection
Culturing
2
重组DNA实验中常见的主要工具酶
3
我们的基本目的是：把外源基因与载体 连接在一起形成重组DNA分子，最少需要以 下两类工具酶：
23
如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时，
产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的
DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。
24
限制性内切酶的剪切方式
25
Yu Zheng, et al. Using shotgun sequence data to find active restriction enzyme genes. Nucleic Acids Res., 2009, 37: e1. Whole genome shotgun sequence analysis has become the standard method for beginning to determine a genome sequence. The preparation of the shotgun sequence clones is, in fact, a biological experiment. It determines which segments of the genome can be cloned into Escherichia coli and which cannot. By analyzing the complete set of sequences from such an experiment, it is possible to identify genes lethal to E. coli.
分子生物学实验
分子生物学实验在分子生物学领域，实验是非常重要的手段，可以帮助科学家们深入研究细胞和遗传信息的奥秘。
本文将介绍分子生物学实验的一般步骤和常见技术，为读者提供一个全面的了解。
实验准备在进行任何分子生物学实验之前，实验室必须准备好所有必需的试剂和器材。
这些试剂包括DNA酶、引物、缓冲液等，而器材则包括PCR仪、电泳仪、热循环仪等。
此外，实验室还需要保持清洁、有序，以确保实验结果的准确性和可重复性。
核酸提取在进行分子生物学实验时，研究人员通常需要提取目标细胞或组织中的核酸，如DNA和RNA。
这个步骤非常关键，因为核酸是遗传信息的载体，对后续实验至关重要。
PCR扩增PCR（聚合酶链反应）是一种常用的技术，可以在体外复制DNA片段。
通过PCR扩增，科学家们可以快速获得大量特定DNA序列，为后续实验提供充足的材料。
凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的分离和分析DNA片段的技术。
通过在凝胶电泳仪中施加电场，可以使DNA片段根据大小在凝胶中移动，从而实现分离和检测。
蛋白表达和纯化在分子生物学研究中，研究人员经常需要表达和纯化特定蛋白。
通过基因工程技术，科学家们可以将目标基因插入表达载体中，在宿主细胞中大量表达目标蛋白，并通过纯化步骤获得纯净的蛋白样品。
分子克隆分子克隆是将某一DNA片段插入到另一DNA分子中的过程，常用于构建重组DNA、重组蛋白等。
通过分子克隆技术，科学家们可以研究和改变生物体内的基因组成。
实验结果分析一旦实验完成，科学家们需要对实验结果进行分析和解读。
这通常涉及到数据处理、图表绘制、统计学分析等工作，以确保实验结论的准确性和可靠性。
结论与展望分子生物学实验在揭示生命的奥秘和解决重大疾病方面起着至关重要的作用。
随着技术的不断发展和创新，我们相信分子生物学实验将在未来展现出更广阔的发展前景，为人类健康和生活质量带来更多的希望。
希望本文能够帮助读者更好地了解分子生物学实验的基本原理和方法，激发更多人对分子生物学这一神奇领域的兴趣和热爱。
分子生物学实验复习题附答案（最新整理）
分⼦⽣物学实验复习题附答案（最新整理）分⼦⽣物学复习题实验⼀DNA的制备（1）为什么分⼦⽣物学实施时要担⼼EB？溴化⼄锭（Ethidium bromide）是DNA诱变剂，溴化⼄锭可以嵌⼊碱基分⼦中，导致错配。
具有⾼致癌性(接触致癌)（2）DNA加样缓冲液的⽤途是什么？由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产⽣不利的影响，在抽提缓冲液中需加⼊抗氧化剂或强还原剂(如巯基⼄醇)以降低这些酶类的活性。
线状DNA⼤⼩/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1（4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么DNA分⼦在pH值⾼于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。
DNA分⼦在电场中通过琼脂糖凝胶⽽泳动，除了电荷效应以外，还有分⼦筛效应。
由于DNA分⼦可⽚段的相对分⼦质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分⼦质量不同或构象不同的DNA分离。
DNA⽚段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反⽐，因此通过已知⼤⼩的标准物移动的距离与未知⽚段的移动距离时⾏⽐较，便可测出未知⽚段的⼤⼩。
但是当DNA分⼦⼤⼩超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。
此时电泳的迁移率不再依赖于分⼦⼤⼩，因此，就⽤琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分⼦⼤⼩不宜超过此值。
（5）琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？溴化⼄锭是⼀种⾼度灵敏的荧光染⾊剂,可插⼊DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成⼀种荧光络合物。
在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄⾊的荧光。
⽤溴化⼄啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA 含量。
（6）制备基因组DNA时⽤到的以下试剂分别起什么作⽤？CTAB等离⼦型表⾯活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋⽩，使核蛋⽩解聚，从⽽使DNA得以游离出来氯仿有机溶剂，能使蛋⽩质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)⽔溶性很强，经离⼼后即可从抽提液中除去细胞碎⽚和⼤部分蛋⽩质。
分子生物学实验报告全解（有图有真相）讲解
分⼦⽣物学实验报告全解（有图有真相）讲解分⼦⽣物学实验报告慕蓝有志班梦想学院⽬录实验⼀细菌的培养 (2)实验⼆质粒DNA的提取 (4)实验三琼脂糖凝胶电泳法检测DNA (7)实验四质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 (9)实验五聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA (11)实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 (14)实验七RNA分离与纯化 (17)实验⼋RT-PCR扩增⽬的基因cDNA (19)实验九质粒载体和外源DNA的连接反应 (21)实验⼗感受态细胞的制备及转化 (23)实验⼗⼀克隆的筛选和快速鉴定 (25)实验⼗⼆地⾼⾟标记的Southern杂交 (27)实验⼗三阿拉伯糖诱导绿⾊荧光蛋⽩的表达 (31)思考题 (32)分⼦实验⼼得总结 (33)实验⼀细菌的培养⼀、⽬的学习细菌的培养⽅法及培养基的配置。
⼆、原理在基因⼯程实验和分⼦⽣物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因⽂库的建⽴等都离不开细菌。
特别是常⽤的⼤肠杆菌。
⼤肠杆菌是含有长约3000kb的环状染⾊体的棒状细胞。
它能在仅含碳⽔化合物和提供氮、磷和微量元素的⽆机盐的培养基上快速⽣长。
当⼤肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进⼊⼀个滞后期。
然后进⼊对数⽣长期，以20~30min复制⼀代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速⽣长的浓度时，菌体密度就达到⼀个⽐较恒定的值，这⼀时期叫做细菌⽣长的饱和期。
此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。
培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。
实验室中最常⽤的是LB培养基。
三、实验材料、试剂与主要仪器（⼀）实验材料⼤肠杆菌（⼆）试剂1. 胰蛋⽩胨2. 酵母提取物3. 氯化钠4. 1mol/L NaOH5. 琼脂粉6. 抗⽣素（氨苄青霉素、卡那霉素等）（三）仪器1. 培养⽫2. 带帽试管3. 涂布器4. 灭菌锅5. ⽆菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌⽛签等）6. 恒温摇床四、操作步骤（⼀）LB培养基的配制配制每升培养基，应在950m1去离⼦⽔中加⼊：细菌培养⽤胰蛋⽩胨10g细菌培养⽤酵母提取物5gNaCl 10g摇动容器直⾄溶质完全溶解，⽤1mol/L NaOH调节pH位⾄7.0。
分子生物学实验方案
分子生物学实验方案实验目的：本实验旨在通过分子生物学技术，研究基因组中特定基因的表达，以及相关信号转导通路的调控机制。
实验原理：1. RNA提取：从细胞或组织中提取总RNA，利用RNA纯化试剂盒抽提RNA样本。
2. cDNA合成：通过逆转录酶反应，利用mRNA模板合成互补的cDNA，并去除RNA模板。
3. 实时定量PCR：使用合适的引物和荧光探针，通过荧光信号实时监测PCR增殖过程，分析特定基因的表达量。
4. 蛋白质免疫印迹：将细胞提取物或组织样本中的蛋白质，通过SDS-PAGE电泳分离，转移到膜上，用特异抗体与目标蛋白结合，再用二抗识别抗体结合，最后显色检测目标蛋白。
实验步骤：1. RNA提取- 准备待检测细胞或组织的样本。
- 使用RNA纯化试剂盒按照说明书进行RNA提取。
2. cDNA合成- 准备反应体系，包括RNA模板、逆转录酶、引物和dNTPs。
- 在PCR仪中进行cDNA合成反应，设定适当的温度和时间。
3. 实时定量PCR- 准备PCR反应体系，包括cDNA模板、引物、探针和荧光染料。
- 在实时荧光定量PCR仪中设定合适的温度程序和循环次数。
- 分析实时PCR数据，计算目标基因的表达量。
4. 蛋白质免疫印迹- 准备待检测细胞或组织的提取物。
- 使用SDS-PAGE分离细胞提取物中的蛋白质。
- 将蛋白质转移到膜上。
- 进行膜上抗体反应，并用二抗结合以增强信号。
- 检测目标蛋白的表达水平。
实验注意事项：1. 实验操作需在无菌环境下进行，以避免外源性RNA或蛋白的干扰。
2. 实验过程中，需使用质量可靠的试剂和仪器设备，确保实验结果准确可靠。
3. 操作时应注意个人防护，避免接触有害物质和受伤。
4. 实验中的样品处理需严格按照操作规程，以确保样品完整性和纯度。
实验结果与分析：通过以上实验方案，可以获得目标基因的表达水平及相关信号转导通路的调控机制。
实时定量PCR结果可用于定量分析目标基因在不同样本中的表达量的差异。
环境分子生物学诊断技术 04 采用生物芯片检测环境微生物
10
• 基因表达谱：指通过构建处于某一段、 定性、定量分析其mRNA群体组成，从而描绘该特定细胞或组 织在特定状态下的基因表达种类和丰度信息，这样编制成的 数据表就称为基因表达谱。
《生物芯片技术》，清华大学出版社
16
生物芯片（英语：biochip）是运用分子生物学、基 因资讯、分析化学等原理进行设计，以硅晶圆、玻璃 或高分子为基材，配合微机电自动化、或其他精密加 工技术，所制作之高科技元件，有如半导体芯片一般 能快速进行繁复运算；生物芯片具有快速、精确、低 成本之生物分析检验能力。在分子生物学，生物芯片 基本上是小型化的实验室，可以同时执行数百个或数 千个生化反应。生物芯片使研究人员能够快速筛选大 量的生物分析物用于各种目的，从疾病的诊断到生物 恐怖主义的检测。
18
生物芯片是采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量 生物大分子，如核酸片段、多肽分子、细胞、甚至组织切 片等生物样品有序的固定化于支持物（如玻片、硅片、聚 丙烯酰胺、尼龙膜等载体）的表面，组成密集的二维分子 列。
然后与已标记的待测生物样品中的靶分子进行杂交，通过 特定的仪器，如激光共聚焦扫描仪或电荷偶联摄像机对杂 交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判 断样品中靶分子的数量及质量。
然后与标记的样品进行杂交，通过检测 杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子 的数量和质量。
29
最早成熟和最先商品化的产品 固定支持物上是成千上万网格状的密集排列的基因
探针。 通过已知碱基顺序的DNA片段来结合碱基互补的单
分子生物学实验报告试剂
一、实验背景分子生物学是一门研究生物大分子如核酸、蛋白质等结构与功能的科学。
在分子生物学实验中，试剂的选择和使用对实验结果的准确性至关重要。
本实验报告将详细介绍分子生物学实验中常用的试剂及其作用。
二、实验试剂1. 核酸提取试剂（1）酚/氯仿：用于从细胞中提取DNA和RNA，具有强烈的蛋白变性作用。
（2）异丙醇：用于DNA的沉淀，降低DNA的溶解度。
（3）无水乙醇：用于RNA的沉淀，降低RNA的溶解度。
（4）RNA酶抑制剂：防止RNA降解，保证实验结果的准确性。
2. DNA提取试剂（1）Tris-HCl缓冲液：用于DNA的提取，调节pH值，保持酶的活性。
（2）EDTA：抑制金属离子与DNA结合，防止DNA降解。
（3）SDS（十二烷基硫酸钠）：用于蛋白质的变性，使蛋白质与DNA分离。
（4）蛋白酶K：降解蛋白质，去除蛋白质杂质。
3. DNA纯化试剂（1）琼脂糖凝胶：用于DNA的分离和纯化。
（2）DNA纯化试剂盒：用于DNA的纯化和回收。
4. DNA扩增试剂（1）PCR反应缓冲液：提供反应所需的pH值、盐浓度等。
（2）dNTPs（脱氧核苷三磷酸）：作为PCR反应的原料。
（3）引物：用于PCR反应的特异性扩增。
（4）Taq酶：DNA聚合酶，负责DNA的合成。
5. DNA检测试剂（1）溴化乙锭（EB）：用于DNA的染色，便于在紫外光下观察。
（2）琼脂糖凝胶电泳缓冲液：用于DNA的电泳。
（3）DNA标记物：用于DNA的定量分析。
6. 蛋白质提取试剂（1）裂解缓冲液：用于蛋白质的提取，保证蛋白质的完整性。
（2）蛋白酶抑制剂：防止蛋白质降解。
（3）SDS：使蛋白质变性，便于与核酸分离。
7. 蛋白质纯化试剂（1）柱层析：用于蛋白质的纯化。
（2）凝胶过滤：用于蛋白质的纯化。
8. 蛋白质检测试剂（1）考马斯亮蓝G-250：用于蛋白质的定量分析。
（2）BCA法：用于蛋白质的定量分析。
（3）SDS-PAGE凝胶：用于蛋白质的分离和纯化。
《分子生物学》实验指导书
《分子生物学》实验指导书实验学时：32学时适用专业：生物科学、生物技术实验目录实验一质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定 (1)实验二聚合酶链式反应扩增DNA片段 (3)实验三大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化 (4)实验四植物基因组DNA提取及电泳 (6)实验五植物基因组RNA提取及电泳 (7)实验一质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定实验项目类型：综合性一、实验目的1. 学习质粒的相关基本知识，掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法。
2. 学习和掌握限制性内切酶的特性、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。
二、实验原理碱裂解法提取质粒DNA的原理是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的结构差异来实现分离的。
在pH12-12.5时，线性DNA被彻底变性，但共价闭环质粒DNA虽然氢键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。
当在溶液体系中加入pH4.8的KAC时，溶液恢复中性，质粒DNA迅速复性，染色体DNA则由于变性而相互混乱缠绕，不能复性，从而离心即可以把变性的染色体DNA沉淀和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。
三、实验仪器与材料1. 材料：含pSV的E.coli JM109菌株、1.5ml塑料离心管、离心管架、EB、酚、氯仿、异丙醇、乙醇、琼脂糖、吸头等。
2. 溶液或试剂：LB培养基、溶液Ⅰ、溶液II（0.4mol/L NaOH、2%SDS用前等体积混合）、溶液Ⅲ、分离液：酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1、无水乙醇、70%乙醇等。
3. 仪器或其他用具：微量移液器(20μl,200μl,1000μl)、恒温振荡摇床、高压蒸汽灭菌锅、涡旋振荡器、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、恒温培养箱、制冰机等。
四、操作步骤质粒DNA的提取步骤：1. 用灭菌的牙签挑取白色单菌落接种于另外已制备好的LB琼脂平板上，保存菌种，并把牙签放入盛3 ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
分子生物学实验讲义(2020版-)
《分子生物学》实验讲义实验一分子生物学实验基础知识及常用仪器介绍实验二质粒DNA分离纯化实验三琼脂糖凝胶电泳实验四聚合酶链反应(PCR)检测质粒DNA实验五限制酶切鉴定质粒DNA实验一分子生物学实验基础知识及常用仪器介绍一、实验目的了解分子生物学实验特点，了解分子生物学实验室常用设备及基本实验操作。
二、实验内容1.分子生物学实验知识⑴严格操作规程分子生物学实验一般比较复杂，如所用试剂多、操作步骤多、实验时间长等，因此为保证实验效果，在实验室中一定要有整体观念，严格按照操作规程进行。
⑵耐心细致操作实验中不能急于求成，特别是对于初入门者，应反复操作，积累经验。
⑶习惯微量操作在分子生物学实验中，试剂的用量往往很少，常常细到1ul液体、ug或ng固体，这是平常肉眼很难看到的，所以刚刚接触实验的人往往感到不习惯，总是担心要取的东西能否看到、准不准确，操作的样品会不会丢失，总是想加大反应体积，以为越多越好。
这些观念都是错误的。
只有定时定量加入液体，才能保证实验成功，所以平时应加以练习，逐渐建立微量操作的观念才能解决好问题。
⑷防止实验污染分子生物学实验的对象主要是核酸，不同生物材料的DNA和DNA之间，不同的样品之间，核酸酶等蛋白酶与核酸之间，产物与反应物之间都有可能造成污染，最终导致实验的失败。
故要从所用试剂、仪器设备、耗材及操作人员等方面进行防止污染的操作。
⑸正确处理试剂分子生物学实验中对试剂的要求十分严格，包括试剂的等级、配制、除菌储备等各方面均有严格要求。
⑹注意实验安全分子生物学实验中，操作者常会接触一些对人体有害的试剂，必须实验安全要求进行实验操作，否则会给实验室甚至整个人类带来巨大的危害。
2.分子生物学实验常用仪器介绍⑴微量取液器⑵水纯化装置（离子交换器、超纯水装置）⑶离心机（低速、高速、超速）⑷电泳装置（电泳仪、电泳槽）⑸灭菌设备（高压蒸汽灭菌锅、过滤除菌器）⑹超净工作台⑺PCR仪⑻凝胶成像系统（紫外分析仪、核酸凝胶电泳图谱的记录）⑼温度控制设备（冷冻设备、培养箱、水浴箱、烤箱）⑽其它设备（紫外可见分光光度计、微波炉、凝胶干燥器、真空干燥仪）3.分子生物学基本实验操作⑴基因组DNA的分离与纯化（核酸浓度和纯度测定）⑵真核细胞mRNA的分离与纯化⑶质粒DNA的提取⑷PCR基因扩增实验⑸限制性内切酶酶切实验⑹DNA重组技术⑺DNA转移技术⑻DNA测序：化学法、双脱氧链终止法⑼核酸探针的制备技术：末端标记、PCR法制探针、非放射性探针⑽分子杂交技术：Southern印迹、Northern印迹和Western印迹4.微量移液器的使用可调节微量移液器标准操作程序（适用的液体：水、缓冲液、稀释的盐溶液和酸碱溶液）：⑴调节数字至所需体积；⑵装上吸嘴（不同规格的移液器用不同的吸头），注意气密性）；⑶按到第一档，垂直进入液面几毫米；⑷缓慢松开控制按钮（否则液体进入吸头过速会导致液体倒吸入移液器内部吸入体积减少）；⑸停顿1s后将吸嘴提离开液面；⑹平稳按压打出液体。
分子生物学第四章 基因与基因组的结构与功能
4.2 基因命名法
但是在研究不同生物的同一遗传机制时，往往会产生一些混淆，如 在研究酿酒酵母和粟米酵母的细胞周期有关基因的命名中。此外， 许多基因在不同实验中从相同组织被分离出好几次而具有不同命名： 重要的果蝇的发育基因torpedo便是其中一例——它在筛选不同表 型的过程中三次被鉴定并被命名三种不同名称。果蝇提供了关于遗 传命名的最为丰富的例子，特别是在发育生物学中这种趋势也扩展 至脊椎动物中。
总之：顺反子学说打破了“三位一体”的基 因概念，把基因具体化为DNA分子上特定的 一段顺序--- 顺反子，其内部又是可分的， 包含多个突变子和重组子。 近代基因的概念：基因是一段有功能的DNA序 列，是一个遗传功能单位，其内部存在有许 多的重组子和突变子。 突变子：指改变后可以产生突变型表型的最 小单位。 重组子：不能由重组分开的基本单位。
（三）DNA是遗传物质：1928年Griffith 首先发现了肺炎球菌的转化，证实DNA 是遗传物质而非蛋白质；Avery用生物 化学的方法证明转化因子是DNA而不是 其他物质。 （四）基因是有功能的DNA片段 20世纪40年代Beadle和Tatum提出一个 基因一个酶的假说，沟通了蛋白质合成 与基因功能的研究 1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋 结构模型，明确了DNA的复制方式。
病毒(+)股RNA为2个拷贝,基本结构为:
５＇帽－R－U5－PB － －DLS－－gag－pol－env－ (onc－)－ C－PB＋－U3－R－poly(A)n 病毒颗粒中有两条相同的正股RNA+两条来自宿主细胞的 tRNA
A：编码区:所有逆转录病毒均含有3个基本结构基因
gag: pol: 病毒核心蛋白 肽链内切酶,一个逆转录酶,一个与前病毒整 合相关的酶 env: 包膜蛋白 B：非编码区: 与基因组复制和基因表达有关 A: B: C: R区: 两端的重复序列,与cDNA合成有关 引物结合区(primer binding site, PB) U区: U3 含强启动子,起始转录RNA. U5 与转录终止和加polyA有关 D: DLS--C区: DLS:两条病毒(+)RNA链结合位点 : 包装信号:RNA装入病毒颗粒 C: 调控区.
分子生物学与细胞生物学实验实训
3
细胞生物学实验
细胞培养与观察
细胞培养：原 理、方法、注
意事项
细胞观察：显 微镜的使用、 样品制备、观
察技巧
ห้องสมุดไป่ตู้
细胞生长曲线： 绘制方法、分
析意义
细胞分化与增 殖：观察方法、
结果分析
细胞增殖与凋亡检测
细胞增殖：细胞分裂、生长和分化的过 程
细胞凋亡：细胞程序性死亡的过程
检测方法：荧光显微镜、流式细胞仪、 免疫组化等
数据收集的方 法：随机抽样、 系统抽样、分
层抽样等
数据整理的步 骤：数据清洗、 数据转换、数
据合并等
数据整理的工 具：Excel、 SPSS、R语言
等
数据分析方法
描述性统计分析：包括平均值、中位数、 众数、标准差等
假设检验：包括t检验、方差分析、卡方 检验等
回归分析：包括线性回归、多元回归、逻 辑回归等
参考文献引用规范
引用格式：作者姓 名、出版年份、文 章标题、期刊名称、 卷数、页码
引用顺序：按照引 用文献在文章中出 现的顺序进行排列
引用数量：一般不 超过20篇，除非 必要
引用准确性：确保 引用的文献与文章 内容相关，避免误 导读者
THANKS
汇报人：XX
实验步骤：细胞培养、细胞固定、细胞 染色、细胞计数等
结果分析：观察细胞形态、细胞周期、 细胞凋亡率等
实验应用：癌症研究、药物开发、细胞 治疗等
细胞信号转导研究
信号转导途径：G蛋白偶联受 体、离子通道受体、酶联受体 等
信号转导分子：蛋白质、脂质、 糖类等
信号转导过程：受体激活、信 号放大、信号转导、效应器激 活等
应用：药物研发、 生物制药、食品
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
教
周 月 次 日 4/24 十 4/25 4/26 4/27 4/28 十 一 十 二 十 三 十 四 十 五 十 六 十 七 十 八 十 九 二 十
学
进
度
理 论
星 期 节次
课 内容
实
教 月星 节 师 期 次
日
验 课 内容
教 师
一 二 三 四 五
6-14
6-14 6-14 6-14 6-14
RT-PCR 产物电泳 2、 DNA 连接 6 转化 6、 western blot2 蛋白质等点聚焦 7、挑克隆 1 质粒 DNA 提取、鉴定 8 原位杂交 6 考试 2
课 时
张萍 徐荣婷 周晓明 程枫 徐让
教
周 月 次 日
学
进
度
理 论
星 期 节次
课 内容
实
教 月星 节 师 期 次
日
验 课 内容
教 师
一
二
三
四
五
六
七
八
九 4/17 4/18 4/19 4/20 4/21
一 二 三 四 五
6-14
6-14 6-14 6-14 6-14
DNA 抽提 8 酶切、电泳、转移 8 标记、杂交 8 洗膜、RNA 抽提 8 RNA 电泳，RT-PCR8
系（部）主任 制表人
（签章）
教研室主任
（签章） 16 日
（签章） 制表日期： 2006 年 1 月
上海交通大学医学院
本学期总学时 80
教师
专业 05 级 硕士生 大班（共 4 个小班）教学日历
，实验课
课 时 28 17 22 2 11物学实验
；其中理论课 实 验 课 人数/ 职称 教室 小班 3/6 楼 助教 29/1 3/6 楼 高级实验员 29/1 29/1 讲师 3/6 楼 高级实验员 分部 203 29/1 讲师 3/6 楼 80 。主讲教师 徐让 实 验 课 人数/ 职称 教室 小班 。