酶法提取枸杞多糖的研究

Ｎｏ．８．２００７［６］食品卫生检验方法理化部分（二）ＧＢ／Ｔ５００９．１０１￣２０３－２００３［Ｓ］．北京：中国标准出版社，２００４［７］中国食品工业标准汇编．乳制品和婴幼儿食品卷（第二版）［Ｓ］．北京：中国标准出版社，２００５［８］ＧＢ／Ｔ１７３７７－１９９８．动植物油脂脂肪酸甲酯的气相色谱分析［Ｓ］．中华人民共和国质量监督检验检疫总局，１９９８［９］格根图，张勇，刘丽君．冷冻干燥对牛乳脂肪酸及异构体成分的影响［Ｊ］．食品科技，２００６，（７）：９５－９６［１０］食品卫生微生物学检验ＧＢ／Ｔ４７８９．１￣３１－２００３［Ｓ］．北京：中国标准出版社，２００４枸杞（ＬｙｃｉｕｍＣｈｉｎｅｎｓｅ），俗称苟杞子、甜枸子、血枸子、红果子等，属茄科枸杞属植物，是驰名中外的名贵药材。

枸杞子中富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、粗纤维、胡萝卜素、核黄素，ＶＣ、维生素Ｂ族、Ｃａ、Ｆｅ、Ｓｅ等人类所需的微量矿物质元素以及１８种氨基酸，此外，还含有含量较高的枸杞多糖等具有保健药效的物质［１］。

枸杞性平、味甘，传统医学认为枸杞具有滋补肝肾、益精明目的功能。

现代医学表明：枸杞子具有调节机体免疫力、抑制肿瘤生长、延缓衰老、降血脂、保肝等方面的药理作用［２］。

对于枸杞子的上述功能起重要作用的因子，一般认为与枸杞子中存在的枸杞酶法提取枸杞多糖的研究吴素萍１，徐建宁２（１．宁夏大学农学院，银川７５００２１；２．青海省粮油检测防治所，西宁８１００００）摘要：研究了纤维素酶提取枸杞多糖的最佳工艺条件。

以提取率为指标，分别考虑了加水量、酶解ｐＨ、酶解温度、酶解时间、加酶量对纤维素酶酶解反应的影响。

试验确定了纤维素酶酶解工艺的最佳条件为加水量５０ｍＬ、ｐＨ５．０、酶解温度５０℃、酶解时间６０ｍｉｎ、加酶量０．５％。

在这种条件下，枸杞多糖的得率为１１．２％。

关键词：纤维素酶；枸杞多糖；浸提中图分类号：ＴＳ２０１．１文献标识码：Ａ文章编号：１００５－９９８９（２００７）０８－０１１４－０４收稿日期：２００６－０４－１２作者简介：吴素萍（１９６３－），女，教授，主要从事粮油食品、保健食品等方面的教学和科研工作。

ＳｔｕｄｙｏｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｌｙｃｉｕｍｂａｒｂａｒｕｍｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｂｙｗａｔｅｒｅｎｚｙｍａｔｉｃｍｅｔｈｏｄＷＵＳｕ－ｐｉｎｇ１，ＸＵＪｉａｎ－ｎｉｎｇ２（１．ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅｏｆＣｏｌｌａｇｅＮｉｎｇｘｉａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｉｎｃｈｕａｎ７５００２１；２．ＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎＡｇｅｎｃｙｏｆＧｒａｉｎｓａｎｄＯｉｌｏｆＱｉｎｇｈａｉ，Ｘｉｎｉｎｇ８１００００）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｌｙｃｉｕｍｂａｒｂａｒｕｍｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｐｒｅｔｒｅａｔｅｄｌｙｃｉｕｍｂａｒｂａｒｕｍｂｙｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙ－ｄｒｏｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅａｌｓｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｃｏｎｄｉ－ｔｉｏｎｓｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅｗｅｒｅａｌｓｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｅｎｚｙｍｅ０．５％，ｐＨ５．０，ｂｕｆｆｅｒｔｏｒａｗｍａｔｅｒｉａｌｒａｔｉｏｎ５０ｍＬ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ５０℃，ｒｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ６０ｍｉｎ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｓｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｗａｓ１１．２％．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｅｌｌｕｌａｓｅ；ｌｙｃｉｕｍｂａｒｂａｒｕｍｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ工艺技术Ｎｏ．８．２００７多糖、β－胡萝卜素、甜菜碱等化学成分有关。

因此，本文应用酶法提取枸杞多糖的研究，对于枸杞的综合开发利用及提高其经济价值具有实际的意义。

枸杞因其具有独特的药理价值和丰富的营养价值，而被认为是开发功能性食品的最佳原料。

特别是其明显的降血糖、降血脂、抗衰老、护肝等作用都和枸杞多糖有关［３－４］。

近２０年来，由于分子生物学的发展，人们逐渐认识到糖及其复合物分子具有极其重要的生物功能，多糖与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等，都有着密切的关系。

近年来又发现多糖的糖链在分子生物学中具有决定性作用。

此外它还能控制细胞的分裂和分化、调节细胞的生长和衰老［６］。

多糖在食品工业、发酵工业及石油工业上也有着广泛的应用。

近几年来，对枸杞多糖的提取工艺已经有了不少的研究，枸杞多糖在高温下稳定性差，在加工过程中易发生变性，形成大量絮状物和沉淀物，造成有效成分的大量损失，并且枸杞多糖的活性也降低。

酶技术具有快速、高效、反应时间温和、反应过程明确、易于控制等诸多优点。

１材料与方法１．１试验材料宁夏中宁枸杞：市售，将非枸杞类杂质剔除；纤维素酶：宁夏盛夏酶制剂公司，活力为２０００～４０００ｕｇ／ｍｇ．ｓ；其余试剂均为国产分析纯试剂。

１．２试验仪器与设备电子天平，电热恒温水浴箱，ＵＶ－２０００分光光度计，离心分离器，ＨＬ－２０３１打浆机，１０００Ｗ调温电炉，恒温干燥箱，分析天平。

１．３试验原理纤维素酶法提取枸杞多糖，主要是利用纤维素酶水解纤维素，使组成枸杞细胞的细胞壁破裂，释放细胞壁内的枸杞多糖，多糖释放的多少和纤维素酶的加入量有直接的关系，除此之外，还和酶解温度、酶解时间、ｐＨ、以及稀释枸杞的倍数有直接的关系。

本试验则是利用次原理，通过加酶的方法得到枸杞多糖的提取率，以次证明酶法提取枸杞多糖的优越性（说明：此试验所得多糖中有少量的蛋白质和淀粉为粗多糖）。

１．４水浸法提取枸杞多糖工艺流程枸杞→预处理→浸泡→打浆→过滤→浸提→离心分离→浓缩→乙醇（沉淀）→干燥→称量１．５水酶法提取枸杞多糖工艺流程枸杞→预处理→浸泡→打浆→过滤→酶解→灭酶→浸提→离心分离→浓缩→乙醇（沉淀）→干燥→称量１．５．１预处理及浸泡剔除发霉、变质等不合格的枸杞及其杂质后，将筛选过的枸杞用温水（水温４５℃、５０ｍＬ）浸泡３０ｍｉｎ，然后用打浆机进行打浆，用纱布过滤得到浆液。

１．５．２酶解及灭酶加入纤维素酶酶解结束后，将水浴温度迅速升至８５℃进行灭酶，之后浸提２ｈ。

１．５．３离心分离、浓缩及干燥用离心分离机将浸提后的浆液离心分离２０ｍｉｎ，然后进行浓缩。

之后加入乙醇进行沉淀，用恒温干燥箱进行干燥。

并用分析天平进行称量。

１．６分析方法１．６．１多糖得率的测定多糖得率（％）＝多糖含量／干枸杞质量×１００１．６．２对吸光度的说明本试验的吸光度是在５２０ｎｍ下测得的，多糖是水溶性的，其浓度越大，用分光光度计测得的数值越大。

所以本试验采用吸光度来说明不同条件下枸杞多糖的得率。

２结果与讨论２．１加水量对枸杞多糖提取率的影响将酶解条件设定为ｐＨ４．０、温度６０℃、时间２ｈ，加酶量（纤维素酶）０．５％（此酶加量相对于枸杞干物质质量１０ｇ而言，以下同），分别选取加水量为１０ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、６０ｍＬ，酶解之后迅速升温至８５℃灭酶，然后热水浸提２ｈ后，经离心，用分光光度计在５２０ｎｍ下测得吸光度，从而比较多糖含量的提取率（如图１所示）。

随着浸提剂倍数的增大，反应体系中的水分会增加，从而降低了反应产物的浓度，减少了产物对酶促反应的反馈抑制作用，多糖的提取率会增加。

但随着反应体系中水分的增加，酶的浓度会相应的下降，这时多糖的提取率就会相应的下降。

如图１可知，多糖提取率在加水量５０ｍＬ时，多糖得率达到最大，加水量继续提高，多糖提取率略有下降这可能是反应体系中酶浓度的下降影响了多糖提取率进一步提高，因此选定加水量为５０ｍＬ。

２．２ｐＨ对枸杞多糖提取率的影响１００１０２０３０４０５０加水量（ｍＬ）０．９０．８０．７０．６０．５０．４０．３０．２０．１吸光度６０７０图１加水量对纤维素酶提取多糖的影响工艺技术１１５Ｎｏ．８．２００７图２ｐＨ值对纤维素提取多糖的影响１００ｐＨ值０．８０．６０．４０．２吸光度１２３４５６７将酶解条件设定为，加水量５０ｍＬ，加酶量（纤维素酶）０．５％，ｐＨ选择３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０，在６０℃下保温酶解２ｈ，然后迅速升温至８５℃灭酶，热水浸提２ｈ，经离心后，用分光光度计在５２０ｎｍ下测得吸光度，从而比较多糖含量的提取率（如图２所示）。

ｐＨ影响酶活力，是通过静电作用，维持了酶活性中心的最佳三维构象，促进酶与底物结合，此外ｐＨ还会影响酶催化速度，ｐＨ值不同，酶及作用底物所带电荷不同，酶的立体构象以及酶与底物的亲和力不同，催化速度也就不同。

由图２可知，当ｐＨ小于５．０时，多糖的提取率随着ｐＨ增大而增加，当ｐＨ大于５．０时，多糖的提取率随着ｐＨ的增加而减少，只有在ｐＨ５．０时多糖的提取率达到了最大，所以纤维素酶提取枸杞多糖的最适ｐＨ应为５．０。

２．３酶解温度对枸杞多糖提取率的影响将酶解条件设定为，加水量为５０ｍＬ，ｐＨ５．０，加酶量（纤维素酶）０．５％，于４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃下分别保温酶解２ｈ，然后迅速升温至８５℃灭酶，热水浸提２ｈ，经离心后，用分光光度计在５２０ｎｍ下测得吸光度，从而比较多糖含量的提取率，（如图３所示）。

在酶催化反应中，温度是非常重要的参数之一，随着温度的升高，反应物的能量增加，使反应速度加快。

当超过其最适温度后，酶蛋白质变性，使得酶活力减弱，直至完全丧失活力，反应速度也会随着温度的升高迅速下降。

由图３可知，温度升高多糖提取率升高，达到最大值后继续升高温度，多糖提取率下降。

当达到５０℃时，纤维素酶体系中的多糖提取率达到最大，因此，纤维素酶的最适温度为５０℃。

２．４酶解时间对枸杞多糖提取率的影响将酶解条件设定为，加水量为５０ｍＬ，ｐＨ值５．０，加酶量（纤维素酶）０．５％，将纤维素酶体系置于５０℃保温酶解，经４５ｍｉｎ、５０ｍｉｎ、５５ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、６５ｍｉｎ、７０ｍｉｎ，然后升温至８５℃灭酶，热水浸提２ｈ，经离心后，用分光光度计在５２０ｎｍ下测得吸光度，从而比较多糖含量的提取率，见图４。

酶解反应时间和酶解进行程度有密切关系，反应时间太短，酶解不充分。

而当酶浓度达到一定值时，酶促反应时间的延长并不能显著增加浸提率，只有及时提高水的温度，才有利于多糖的溶出。

由图４可知，多糖的提取率随着时间提取时间的延长而增加，当超过６０ｍｉｎ的时候开始下降，可能是提取时间太长会引起糖结构的变化，甚至使碳环裂解，导致多糖含量降低，所以选择６０ｍｉｎ为纤维素酶的最佳提取时间。

２．５加酶量对枸杞多糖提取率的影响将酶解条件设定为，加水量为５０ｍＬ，ｐＨ５．０，加酶量分别为０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％，将纤维素酶置于５０℃保温酶解６０ｍｉｎ，然后升温至８５℃，热水浸提２ｈ，经离心后，用分光光度计在５２０ｎｍ下测得吸光度，从而比较多糖含量的提取率，结果见图５。