实验四 动物细胞的传代培养

实验四动物细胞的传代培养

1. 实验目的

（1）了解动物细胞培养的基本知识。

（2）了解体外培养细胞的的基本形态类型；学会通过镜检判定体外细胞生长的状态。

（3）掌握动物细胞的传代培养法。

2.实验背景与原理

2.1 动物细胞培养的基本概念

（1）组织培养：把来自机体内的细胞、组织或器官放在类似于体内的外环境中，使之成活、生长和繁殖。严格又分为细胞培养、组织培养和器官培养。值得注意的是和植物组织培养不同，目前动物组织培养在一般培养条件下难以维持组织的结构和功能，常最终转变成为细胞培养，所以动物细胞与组织培养并无严格区别。（2）原代培养：直接从供体取来的细胞，组织或器官进行的初次培养。通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。

（3）传代培养：原代培养物长成单层细胞，达到一定密度时，营养消耗殆尽，需要补充营养，分开扩大培养，使之继续增殖。注意的是传代的这个“代”与细胞分裂的一个世代不同，一代细胞约分裂3~5次，不要混淆。

（4）细胞系：原代培养后的细胞经传代即可成为细胞系。若其形态均一，生长增殖稳定，生物性状明确，即可称之为已鉴定的细胞（Certified Cells）。不同种类的细胞成系的难易程度也不同，一般胚胎、更新组织的细胞如造血、上皮等以及

癌细胞较容易成系，而神经等细胞则较难成系。按照其生存期可分为有限细胞系（生存期有限的正常二倍体细胞）和无限细胞系（生存期无限的癌细胞、转化细胞等，大多异倍体）

2.2 动物细胞培养的基本条件

体外培养细胞的条件总原则就是要尽可能模拟细胞在体内生长的环境，因此必要的营养、适宜的胞外环境以及严格的无菌条件是主要的三个方面。

（1）营养：早期培养主要采用天然的生物性液体，但其成分不确定，难以控制营养成分。现广泛使用的是化学成分明确的各种商品化的合成培养基，其主要成分包括各种氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等必要的营养物质。培养基中还含有酚红指示剂，使培养基的颜色可显示细胞生长状态。随着细胞数目的增长，酸性代谢物增多，培养基变黄。污染的培养物也会使培养基迅速变黄。

培养基在使用前还要加血清，它的主要作用有三点：一是提供生长因子、激素、酶等营养；二是中和有毒物质，对细胞起着保护作用，尤其可中和培养中使用的胰蛋白酶的毒性。第三是提供黏附和伸展因子，是贴壁细胞附壁生长所必不可少的。所以，血清的品质对细胞的生长有很大影响，通常换用新的批次的血清要预先进行血清的筛选实验。一般进口的胎牛血清更有利于细胞的生长，但价格较昂贵，可根据培养细胞的要求选用。另外，有些细胞培养中还需要添加谷氨酰胺（Gln）。

（2）胞外环境条件：主要是温度、气体和pH条件。这些胞外环境条件应该符合细胞在体内的生长环境。哺乳动物适宜的培养温度是37℃，鸟类是39℃，爬行类是22~25℃等；大多动物细胞适宜的pH条件都是7.2~7.4，以不超过pH6.8~7.6为宜。在动物细胞培养过程中随着代谢产物的积累，酸性产物增多，

培养基的pH会下降。因此实验室通常使用CO

2

气体体积占5%的空气作为细胞

培养的气体条件，以使CO

2溶解在溶液中形成NaHCO

3

和H

2

CO

3

的缓冲体系，

维持pH的稳定。另外，培养基中加入HEPES（羟乙基哌嗪乙烷磺酸）可更有效的维持体系的pH。

（3）无菌：组织培养成功的关键因素之一就是要避免污染，要树立无菌操作观念，从实验用品、培养基和试剂、操作环境的灭菌消毒到超净台下的实验操作，每一步都应该严谨规范。

2.3培养细胞的形态

(1) 倒臵显微镜：培养细胞用倒臵显微镜观察。倒臵显微镜（inverted microscope）组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统在载物台之下。倒臵显微镜优点为物镜与目镜之间工作距离较长，可直接将培养皿，培养瓶等臵显微镜操作台上进行观察或显微注射等工作，这样物镜可以很接近样品而不会受样品厚度的限制。通常具有相差物镜。

(2) 培养细胞的形态特点：体外培养细胞绝大多数都是贴壁生长的。在培养中大部分细胞都经历由最初脱离机体或瓶壁的立体球形到最终的具有突起的延展细胞所形成平面单层的形态变化过程。细胞分裂增殖时同样也经历此变化过程，才能附壁继续生长。

培养细胞的形态变化示意图

健康的体外培养细胞的标准是细胞折光性好，透明；胞质中颗粒少；细胞形态完整，饱满；伸展性好。当细胞刚刚污染时，会发现细胞形态不饱满，细胞反差变大，胞质中颗粒变多，细胞延展性差。随着污染的加重，贴壁细胞脱落，培养基中杂质多，培养液很快变黄，且混浊。当细胞因未及时传代而缺乏营养时，细胞也会“变瘦”，变圆脱落增多，培养液变黄。

(3) 体外培养细胞的形态类型: 细胞在体外培养时由于培养条件比较单一稳定，缺乏体内的生理调节和动态平衡，细胞常失去原有组织细胞的形态特点，趋于单一性，出现“返祖”现象。根据它们是否贴附于支持物生长的特征，可分为贴附型生长和悬浮型生长两大类。而贴壁生长又主要分为成纤维样，上皮样，多形样等。成纤维样细胞形态与体内成纤维细胞的形态相似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞也呈本类形态生长。上皮样细胞具有扁平不规则多角形特征，细胞紧密相连单层膜样生长。起源于内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等组织细胞培养时，皆呈上皮型形态生长。悬浮样细胞主要是血液或淋巴液中的悬浮生长的细胞类型。

2.4 细胞传代培养的一般方法

以单层细胞方式生长的细胞分泌细胞外基质和黏蛋白以附着于生长表面。不但不同的细胞系附着于表面的黏附程度有差异，不同状态的细胞这种黏附也有差异。比如衰老的二倍体细胞通常比年轻的二倍体细胞黏附得更牢固。绝大多数的贴壁细胞需要用胰蛋白酶优先催化碱性氨基酸与邻近氨基酸羧基间的肽键水解，从而分解粘蛋白、糖蛋白，使细胞脱壁；有些细胞系贴壁不强，只要用吸管吹打即可使细胞脱落分散，而不需要使用胰蛋白酶；还有些细胞贴壁能力很强需要使用其他的蛋白酶，比如弹性蛋白酶、链霉素的酶等。为保障胰蛋白酶的最佳活性，在进行胰蛋白酶处理前应去除血清、Ca2+及Mg2+离子。值得注意的是过度的胰蛋白酶处理可导致细胞的裂解和活力的丧失。

悬浮生长细胞的传代一般只需简单的稀释操作即可。若需完全更换培养液只需要离心收集细胞后传代即可。

3. 实验材料与试剂

（1）材料：MCF-7细胞。

培养箱，超净工作台，高压灭菌锅，过滤（2）设备与用品：倒臵显微镜，CO

2

器及0.22μm的水相滤膜，细胞培养瓶，移液管，吸管，小试管，酒精灯，试管架等。

（3）药品与试剂：RPMI-1640培养基；小牛血清；0.25%胰蛋白酶（w/v, PBS 缓冲液或D-Hanks缓冲液配制，pH7.4）。

强酸洗液的配制：先用约200mL蒸馏水充分加热溶解重铬酸钾63克，再缓缓加入1L浓硫酸并不断搅拌，充分混合溶解。洗液腐蚀性较强，操作时注意做