实验3 酵母蔗糖酶的制备
酵母蔗糖酶的提取实验报告
酵母蔗糖酶的提取实验报告一、实验目的本实验旨在学习酵母蔗糖酶的提取方法，并掌握其酶活力的测定方法。
二、实验原理酵母蔗糖酶是一种重要的生物催化剂，广泛应用于食品工业、医药工业等领域。
其提取方法主要包括细胞破碎法和超声波法。
细胞破碎法是将酵母细胞经过离心、洗涤后，在低温下使用高压均质机或超声波仪器进行破碎，使得蛋白质与其他杂质分离。
而超声波法则是将细胞悬液经过超声波处理，使得细胞壁裂开，释放出内部的蛋白质。
三、实验步骤1. 酵母菌体培养：将活性酵母菌体接种到含有10%蔗糖和0.5%酵母粉的液体培养基中，在30℃下静置48小时。
2. 细胞破碎：将培养好的菌体通过离心后洗涤两次，然后在低温下使用高压均质机进行破碎，使得蛋白质与其他杂质分离。
3. 超声波处理：将菌体悬液经过超声波处理，使得细胞壁裂开，释放出内部的蛋白质。
4. 酶活力测定：取一定量的提取液，加入含有蔗糖的缓冲液，在37℃下反应30分钟后用硫酸铜试剂测定还原糖的含量。
四、实验结果通过细胞破碎和超声波法两种方法提取酵母蔗糖酶，测得其酶活力分别为10.5 U/g和12.8 U/g。
五、实验分析1. 细胞破碎法和超声波法都可以用于酵母蔗糖酶的提取，但是超声波法更加快速、高效。
2. 酵母菌体培养条件对于酵母蔗糖酶的产生有较大影响，应该注意培养基成分和温度等因素。
3. 酵母蔗糖酶的测定方法可以采用硫酸铜法，但是也可以采用其他方法，如比色法和光度法等。
六、实验结论本实验通过细胞破碎和超声波法两种方法提取酵母蔗糖酶，并测定了其酶活力。
结果表明，超声波法更加高效。
同时，酵母菌体培养条件对于酵母蔗糖酶的产生有较大影响，应该注意调整培养条件。
最后，硫酸铜法可以用于测定酵母蔗糖酶的活力。
酵母蔗糖酶的提取实验报告
酵母蔗糖酶的提取实验报告酵母蔗糖酶的提取实验报告1. 引言酵母蔗糖酶是一种重要的酶，在许多生物过程中起着关键作用。
通过提取酵母蔗糖酶，我们可以深入了解其结构和功能，以及其在实际应用中的潜力。
本实验旨在通过一系列步骤，从酵母细胞中提取酵母蔗糖酶，并评估其活性和效果。
2. 方法和材料2.1 材料- 新鲜酵母菌浆液- 蒸馏水- 磷酸缓冲液- 蔗糖溶液- 高速冷离心机- 低速冷离心机- 离心管- 离心管架- 塑料吸管- 双室温度计- 分光光度计- 试管2.2 实验步骤步骤1：制备酵母酶提取液a) 将10ml新鲜酵母菌浆液倒入离心管中，并以1500rpm的速度在低温下离心10分钟。
b) 将上清液转移至另一个离心管中，再次进行高速离心，以去除细胞碎片。
步骤2：沉淀酵母蔗糖酶a) 将上一步中得到的上清液倒入一个含有7ml蔗糖溶液的试管中。
b) 在室温下孵育搅拌2小时，让酵母蔗糖酶与蔗糖结合形成沉淀。
c) 用低速离心将沉淀分离。
收集上清液备用。
步骤3：测定酵母蔗糖酶活性a) 在分光光度计中设置波长为540nm。
b) 取1ml上清液和1ml磷酸缓冲液混合，作为空白对照。
c) 另取1ml上清液和1ml含20%蔗糖溶液的试管中，作为实验组。
d) 在不同时间点（例如0、1、2、3、4分钟）测定两个试管的吸光度，并记录数据。
e) 计算酵母蔗糖酶的活性。
3. 结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功地提取了酵母蔗糖酶，并可以测定其活性。
根据测定结果，我们观察到酵母蔗糖酶在一定时间范围内对蔗糖的降解表现出线性增加的趋势。
这表明酵母蔗糖酶在一定程度上具有稳定的催化作用。
通过本实验，我们还可以根据酵母蔗糖酶的活性表征其在不同条件下的稳定性、催化效率和适应性。
我们可以改变温度和pH值，观察对酵母蔗糖酶活性的影响，从而了解其最适宜的操作条件。
通过进一步的研究，我们还可以探索酵母蔗糖酶在生物制药、食品加工和能源生产等领域的应用潜力。
总结回顾：通过酵母蔗糖酶的提取实验，我们深入了解了酵母蔗糖酶的结构、功能和应用前景。
酵母蔗糖酶的提取方法
酵母蔗糖酶的提取方法酵母蔗糖酶是重要的糖分解酶，它可以被用来制造蔗糖、糖精、酒精、淀粉、葡萄糖以及蔗糖衍生物。
因此，它在化工、食品、制药行业中有着重要的应用价值。
本文介绍了从发酵酵母或发酵液中提取酵母蔗糖酶的方法。
一、原料准备首先，准备发酵酵母或发酵液。
发酵酵母可以使用乳酸乳杆菌培养基发酵培养，得到的酵母菌可以悬浮在一定的温度和 pH 下曝气发酵，以获得最大的效果。
发酵液可以采用蔗糖和氨基酸等制备，并需要调节合适的 pH温度，可以提高酶的活性。
二、提取酵母蔗糖酶1.发酵酵母或发酵液放入滤器，用中压过滤来滤出悬浮体；2.过滤得到的酵母蔗糖酶悬浮液中加入NaCl，来降低活性；3.溶液中的毛细管类蛋白分离出来，加入45%的乙醇萃取分离；4.溶液冷冻至冰点，冻干抽滤以获得纯化的蔗糖酶；5. 从冻干抽滤物中继续利用膜精制器以及离子交换柱等方式，将蔗糖酶高纯度分离出来；6.高纯度蔗糖酶经过适当稀释处理，可获得最终产品。
三、性能测试为了判定提取的酵母蔗糖酶的性能，需要进行一系列的性能测试，这些测试可以用来检测酶的活性、热稳定性、抗菌性以及稳定性等。
通过这些测试，可以确定提取的酵母蔗糖酶的性能，从而确保它能够满足采用的要求。
四、应用实践酵母蔗糖酶的提取方法在实际应用中几乎是必不可少的，它可以用来生产糖浆、糖精、酒精、淀粉、葡萄糖以及蔗糖衍生物等，常用于食品加工、精细化工、制药行业等。
此外，这种提取方法还可以应用于糖类合成、氨基酸修饰等方面，发挥着重要的作用。
综上所述，酵母蔗糖酶是一种重要的糖分解酶，用于生产糖类衍生物，它的提取方法包括发酵酵母或发酵液的原料准备、提取、性能测试以及应用实践等，是一项重要的工作。
只有抓住机会，把提取的酵母蔗糖酶用好，才能实现糖分解酶的高效利用。
酵母蔗糖酶的分离纯化
低温保持酶活性
蔗糖酶提取步骤
1.破碎细胞 10g左右的干酵母+20ml甲苯，研磨5分钟，加水
10-15ml，研磨5-10分钟，重复加水研磨，共加3 次水，离心12000rpm,4℃，5-10分钟。共分3层， 上层白色为甲苯及其抽提物，中间为水层(含酶)， 下层为细胞碎片沉淀(甲苯和水体积不用准确） 2.抽提(第一组分) 取中间水层于干净离心管，12000rpm, 4℃，510分钟，上清取出量体积并记为V1，然后留2ml保 存于冰上后面做检测，其余的样品（V1-2ml）继续 进行纯化
酵母蔗糖酶的分离纯化
生化技术综合系列实验(一)
原理
生物大分子 蛋白质 酶
生物大分子提取基本步骤
材料 破细胞
提取
检测
பைடு நூலகம்
纯化
酶是生物体内具有催化功能的蛋白质， 可据酶蛋白的结构和性质选择分离提纯条件 和含量测定方法。
酶分离提纯的总目标是提高纯度（或比 活力）及收率；依据在溶液中的性质（分子 大小、溶解度、电荷、吸附等）进行分离;
将留下的一、二、三组分样标记清楚后保存于-20 ℃ 冰箱中。
注意事项
1.低温 2.一、二、三组分的准确体积V1、V2、V3 3.标记 4.离心后弃、留 5.记录现象
3.热抽提(第二组分)
调pH约5.0(加5滴1M醋酸即可)，50℃，摇动或搅 拌20分钟，冰浴冷却3分钟， 12000rpm, 4℃，5-10 分钟，量取上清体积(V2)，留2ml保存于冰上检测。 其余样（V2-2ml)继续提纯。
4.乙醇沉淀(第三组分)
蔗糖酶生化实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 理解蔗糖酶的催化原理和特性。
2. 掌握蔗糖酶的提取、纯化方法。
3. 学习通过不同方法测定蔗糖酶的活力。
4. 分析影响蔗糖酶活性的因素。
二、实验原理蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。
本实验旨在通过提取、纯化蔗糖酶，并测定其活力，了解蔗糖酶的特性。
三、实验材料与试剂1. 材料：- 酵母细胞- 淀粉- 蔗糖- 还原糖试剂（如班氏试剂）2. 试剂：- 磷酸氢二钠溶液- 磷酸二氢钠溶液- 硫酸铵溶液- 硫酸铜溶液- 酒精- 氢氧化钠溶液- 丙酮- 酶提取缓冲液1. 蔗糖酶的提取：- 将酵母细胞用磷酸缓冲液洗涤，并悬浮于磷酸缓冲液中。
- 使用匀浆机破碎细胞，收集匀浆液。
- 将匀浆液离心，收集上清液即为蔗糖酶粗提液。
2. 蔗糖酶的纯化：- 将蔗糖酶粗提液用硫酸铵溶液进行盐析，收集沉淀。
- 将沉淀用磷酸缓冲液溶解，并使用凝胶过滤柱进行纯化。
3. 蔗糖酶活力的测定：- 将纯化后的蔗糖酶与蔗糖溶液混合，在适宜的温度下反应。
- 加入还原糖试剂，观察颜色变化，根据颜色变化判断蔗糖酶的活力。
五、实验结果与分析1. 蔗糖酶的提取：- 通过匀浆和离心，成功提取出酵母细胞中的蔗糖酶。
2. 蔗糖酶的纯化：- 通过盐析和凝胶过滤柱，成功纯化出蔗糖酶。
3. 蔗糖酶活力的测定：- 在适宜的温度下，蔗糖酶能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。
- 加入还原糖试剂后，溶液颜色发生变化，表明蔗糖酶具有活力。
4. 影响蔗糖酶活性的因素：- 温度：在一定范围内，温度升高，蔗糖酶的活力增加。
- pH值：在一定范围内，pH值升高，蔗糖酶的活力增加。
- 抑制剂：某些物质（如重金属离子）可以抑制蔗糖酶的活力。
1. 本实验成功提取和纯化了蔗糖酶，并测定了其活力。
2. 实验结果表明，温度和pH值是影响蔗糖酶活性的重要因素。
3. 在实际应用中，需要根据具体情况进行酶活性的调控，以获得最佳催化效果。
七、实验结论1. 蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。
酵母蔗糖酶实验报告
一、实验目的1. 学习酵母蔗糖酶的提取方法。
2. 掌握酶活力测定的原理和方法。
3. 了解酶的专一性及其影响因素。
二、实验原理酵母蔗糖酶是一种能够催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。
本实验通过提取酵母细胞中的蔗糖酶，并在一定条件下测定其活力，以了解其催化活性。
三、实验材料与仪器材料：1. 酵母粉2. 蔗糖3. 缓冲液4. 斐林试剂5. 旋光仪仪器：1. 电子天平2. 研钵3. 移液器4. 恒温水浴锅5. 烧杯6. 试管7. 离心机四、实验步骤1. 酵母蔗糖酶的提取- 称取适量酵母粉，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆。
- 将匀浆转移至离心管中，离心分离，收集上清液即为酵母蔗糖酶提取液。
2. 酶活力测定- 取适量提取液，加入含有蔗糖的缓冲液，置于恒温水浴锅中保温。
- 定时取样，用斐林试剂检测反应液中的还原糖含量。
- 根据还原糖含量计算酶活力。
3. 酶的专一性实验- 将提取液分别与蔗糖、淀粉等底物反应，观察酶的催化活性。
- 对比实验结果，分析酶的专一性。
4. 影响酶活力的因素实验- 分别在酸性、中性、碱性条件下进行酶活力测定，观察pH对酶活力的影响。
- 分别在不同温度下进行酶活力测定，观察温度对酶活力的影响。
五、实验结果与分析1. 酶活力测定- 酵母蔗糖酶提取液在37℃、pH 6.8条件下，酶活力最高，约为0.5单位/毫升。
2. 酶的专一性实验- 酵母蔗糖酶对蔗糖具有特异性催化作用，而对淀粉无催化活性。
3. 影响酶活力的因素实验- 酶活力受pH和温度的影响较大。
在pH 6.8、37℃条件下，酶活力最高；在酸性或碱性条件下，酶活力明显降低；在低温条件下，酶活力较低。
六、实验结论1. 成功提取了酵母蔗糖酶，并测定了其活力。
2. 酵母蔗糖酶具有特异性催化作用，对蔗糖具有高效催化活性。
3. 酶活力受pH和温度的影响较大，适宜的pH和温度有利于提高酶活力。
七、实验讨论1. 本实验中，酶活力的测定方法较为简单，但结果准确可靠。
浙江大学生物化学实验甲酵母蔗糖酶的提取原理
酵母蔗糖酶的制备原理一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于酵母中，如啤酒酵母、面包酵母，也存在于曲霉、青霉和毛霉等霉菌和细菌及植物中，可专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。
酵母蔗糖酶的分子量约270000D（因来源不同，分子量有差异），pI约5.6，最适pH4.6，耐酸和热，最适温度50℃。
耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。
二、酵母蔗糖酶的分离纯化本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：缓冲液抽提，加热纯化，乙醇分级沉淀，DEAE-Sepharose柱层析分离纯化。
㈠、前三步分离纯化的原理如下：㈡、离子交换DEAE-Sepharose柱层析分离纯化的原理1、离子交换柱层析分离混合物的基本原理离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种根据待分离物质的阳或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附而将溶液中各组分分开的一种技术。
离子交换层析是一种液-固相层析技术。
其中，液相称洗脱液，固相的惰性支持介质称离子交换剂。
在离子交换剂上具有带电基团，不同的交换剂所具有的带电基团的电荷性质不同，如交换剂上的带电基团带正电荷，则可结合溶液（液相）中的阴离子，这样的交换剂称为阴离子交换剂，如DEAE 纤维素（二乙胺基乙基-纤维素）、强碱型的离子交换树脂等。
反之，如交换剂上的带电基团带负电荷，则可结合溶液中的阳离子，这样的交换剂称为阳离子交换剂，如CM-纤维素、强酸性的离子交换树脂等。
离子与交换剂的静电结合作用具有如下特点：可逆性：在一定条件下，结合在交换剂上的离子可被其它离子取代而离开交换剂并随洗脱液流出层析柱。
选择性：离子所带的电荷越多，水合离子半径越小越易结合。
遵循质量作用定理：对某一特定离子，随离子浓度的增大，则遵循质量作用定理向与交 换剂结合方向进行。
浙江大学生物化学实验甲 酵母蔗糖酶的制备及其动力学性质分析
酵母蔗糖酶的制备及其动力学性质分析一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于植物和微生物体内，专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。
酵母蔗糖酶分子量约270000D，pI约5．0，最适pH4．6，耐酸和热，50℃保温30min 仍具有相当的活力，最适温度37℃。
耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。
二、酵母蔗糖酶的分离纯化本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：甲苯抽提。
加热纯化。
乙醇分级沉淀。
纤维素柱层析分离纯化。
㈠、前三步分离纯化的原理如下：甲苯石英砂离心上层（甲苯层）：脂溶性物质酵母细胞破细胞中层（水层）：蔗糖酶，可溶性糖等研磨下层（沉淀）：细胞碎片、变性蛋白等取中层50水浴中使热不稳定蛋白变性上清：蔗糖酶、可溶性糖等（水层）保温30分钟沉淀：变性蛋白取上清加乙醇使蔗糖酶沉淀上清：杂蛋白及可溶性糖等冰浴中20分钟沉淀：蔗糖酶、杂蛋白等㈡、纤维素柱层析分离纯化的原理1、离子交换柱层析分离混合物的基本原理离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种根据待分离物质的阳或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附而将溶液中各组分分开的一种技术。
离子交换层析是一种液-固相层析技术。
其中，液相称洗脱液，固相的惰性支持介质称离子交换剂。
在离子交换剂上具有带电基团，不同的交换剂所具有的带电基团的电荷性质不同，如交换剂上的带电基团带正电荷，则可结合溶液（液相）中的阴离子，这样的交换剂称为阴离子交换剂，如DEAE纤维素、强碱型的离子交换树脂等。
反之，如交换剂上的带电基团带负电荷，则可结合溶液中的阳离子，这样的交换剂称为阳离子交换剂，如CM-纤维素、强酸性的离子交换树脂等。
离子与交换剂的静电结合作用具如下特点：选择性：离子所带的电荷越多，离子半径越小，越易结合。
遵循质量作用定理：对某一特定离子，随离子浓度的增大，则遵循质量作用定理向与交换剂结合方向进行可逆性：在一定条件下，结合在交换剂上的离子可被其它）离子取代而离开交换剂并随洗脱液流出层析柱。
蔗糖酶提取实验报告
1. 掌握从酵母中提取蔗糖酶的基本方法。
2. 了解酶的提取、纯化及活力测定的原理和操作。
3. 掌握酶活性测定的方法。
二、实验原理蔗糖酶（Invertase）是一种能够催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。
本实验采用酵母作为原料，通过破碎细胞、离心、沉淀、透析等步骤提取蔗糖酶，并对其进行活力测定。
三、实验材料与仪器材料：1. 酵母（安琪酵母粉）2. 蔗糖3. 葡萄糖4. 果糖5. 磷酸盐缓冲液（pH6.0）6. 3，5-二硝基水杨酸（DNS）仪器：1. 电子天平2. 离心机3. 恒温水浴锅4. 分光光度计5. 试管6. 烧杯7. 移液器1. 酵母细胞的制备：- 称取1g酵母粉，加入10ml磷酸盐缓冲液（pH 6.0），搅拌均匀，置于37℃恒温水浴锅中保温30分钟。
- 将保温后的酵母悬液以3000r/min离心10分钟，收集上清液。
2. 酶液的提取：- 向上清液中加入等体积的50%饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀，置于4℃冰箱中过夜。
- 将沉淀物以3000r/min离心10分钟，收集上清液即为粗酶液。
3. 酶液的透析：- 将粗酶液置于透析袋中，置于磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中透析过夜，以去除硫酸铵等小分子杂质。
4. 酶液的活力测定：- 取1ml蔗糖溶液（2%蔗糖溶液），加入1ml透析后的酶液，置于37℃恒温水浴锅中保温30分钟。
- 取0.5ml反应液，加入2ml DNS试剂，沸水浴5分钟。
- 取出后，加入4ml蒸馏水，在540nm波长下测定吸光度。
五、实验结果与分析1. 酶液活力测定结果：- 通过DNS试剂显色，根据吸光度计算出酶的活力。
2. 结果分析：- 通过对比不同处理条件下的酶活力，分析提取、纯化过程中酶活力的影响因素。
六、实验结论1. 通过本实验，成功从酵母中提取了蔗糖酶。
2. 酶的提取、纯化过程中，酶活力受到pH、温度、离子强度等因素的影响。
3. 透析法是一种有效的酶纯化方法，可以去除小分子杂质，提高酶的纯度。
生化综合实验-酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究
酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究一、蔗糖酶的制备1、提取称取14.997g干酵母粉于250ml小烧杯中，少量多次地加入50ml蒸馏水，搅拌均匀。
成糊状后加入1.499g乙酸钠、25ml乙酸乙酯，搅匀。
再于35℃恒温水浴中搅拌30min，然后补加30ml蒸馏水，搅匀，盖好，于35℃恒温过夜。
之后，1000r/min离心10min，抽取酯层后再次离心，得到无细胞提取液。
用1M HCl将其PH调至5.0，即可得到级分Ⅰ。
（取出3ml于冰箱中保存）2、热处理（1）盛有粗级分Ⅰ的离心管放入50℃水浴中保温30min，在保温过程中不断轻摇离心管。
（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，1000r/min离心10min。
（3）上清液即为热级分Ⅱ。
（取出3ml于冰箱中保存）3、乙醇沉淀将热级分Ⅱ转入小烧杯中，放入冰浴，逐滴加入等体积预冷的95%乙醇，同时轻轻搅拌（此过程共需30 min）。
然后在冰浴中静置10 min，以沉淀完全。
然后4℃，1000r/min离心10min。
倾去上清，并滴干。
将沉淀保存于离心管中，冷冻保存，此即级分Ⅲ。
二、蔗糖酶的纯化将3ml级分Ⅲ加入洗脱柱中进行梯度洗脱。
及洗脱峰图如下：三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定（一）还原糖含量测定1、各级分稀释倍数的确定级分Ⅰ：取50μl稀释至1.5ml（30倍）级分Ⅱ：取50μl稀释至1.5ml（30倍）级分Ⅲ：取50μl稀释至15ml（300倍）取20μl稀释至2ml（100倍）释100倍。
在上述表格中，Glu含量是由标准曲线求得的，E'=Glu含量*稀释倍数/（10 min*0.6 ml）Units=0.6 ml/Glu平均含量/2/10min/稀释倍数由洗脱峰可知，第二个和第三个峰最有可能是目标蛋白（第一个峰一般情况下是杂蛋备注：由测定数据可知，第二个峰不是目标蛋白，第三个峰为目标蛋白。
（二）蛋白质含量测定1、各级分稀释倍数的确定由以上数据可知，级分Ⅰ和级分Ⅱ不需稀释，级分Ⅲ需稀释5倍。
酵母蔗糖酶的提取方法
酵母蔗糖酶的提取方法摘要：采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶，经质量分数50%的乙醇分级沉淀、MonoQ阴离子交换柱层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶。
比较了上述3种提取方法并对该酶的部分性质进行了研究。
纯化的酶经等电聚焦测定，等电点为5.6，SDS-PAGE鉴定其相对分子质量为60kD。
以蔗糖为底物测得酵母蔗糖酶的表观米氏常数Km为0.013mol／L。
结果显示3种提取方法各有优劣，冻融法和SDS抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。
其中SDS抽提法的效率最高，加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。
关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化蔗糖酶(Sucrase，EC 3．2．1．26)又称转化酶(Invertase)。
可作用于B一1，2糖苷键，将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。
由于果糖甜度高，约为蔗糖的1．36～1．60倍，在工业上具有较高的经济价值。
可用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。
目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多，以甲苯自溶法最为常见。
作者采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种不同的方法从酵母中提取蔗糖酶，将冻融法和SDS法提取的蔗糖酶进一步纯化，并对其基本性质进行了研究。
通过不同提取方法的比较，为酵母蔗糖酶在食品工业中的应用和蔗糖酶基因工程产品的下游技术开发，提供了实验依据。
1材料与方法1．1材料酵母，安琪酵母股份有限公司提供；MonoQ(10／10)阴离子交换层析柱、PhastGelIEF3-9胶，Amersham公司提供。
1．2主要化学试剂和仪器十二烷基硫酸钠(SDS)，Serva公司提供；等电点标准品，Amersham公司提供；其余试剂均为国产分析纯或生化试剂。
UV一2201型紫外可见光分光光度计，Shimadzu公司制造；Waters650型高级蛋白纯化系统，Waters公司制造；PhastSystem全自动快速水平电泳仪，Amersham公司制造；高速冷冻离心机，Hitachi公司制造；冷冻干燥器，Labconco公司制造；电泳仪，Bio-Rad公司制造；精密酸度计，Orion公司制造。
酵母蔗糖酶的分离提取
酵母蔗糖酶的分离提取作者：XX 指导老师：XX摘要：采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，即在一定PH和适当的温度下，利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎再通过乙醇的分级与透析，得到纯化的酵母蔗糖酶。
本实验也通过考马斯亮蓝G250染色法，测定蔗糖酶的活力和蛋白质浓度，对蔗糖酶的性质进行了研究。
最后的纯化倍数为2.8倍，所得产率为36.85%。
关键词：蔗糖酶，分离提取，酶活力，蛋白质含量前言：蔗糖酶又称转化酶，可作用于β-1，2糖苷键，将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。
蔗糖酶在工业上用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，还用来制造含果糖和巧克力的软心糖等。
蔗糖酶在畜牧方面，可防治禽兽的疾病，促进幼龄禽兽的发育，节约饲料和提高肉产量等；在农业方面可防治植物病害、刺激植物生长、提高作物产量；在工业上可用作鱼、肉、蔬菜和水果等食品的保鲜剂，同时也在植物的运输贮藏、碳水化合物代谢中发挥主要作用，并在渗透调节、抗逆性生长繁殖、以及信号传导方面也发挥着重要的作用。
目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多，以甲苯自溶法最为常见。
本实验采用自溶法从酵母中分离提纯蔗糖酶，通过测定得到的蔗糖酶的活力及蛋白质的含量。
1.材料与方法1.1试剂酵母粉（实验室提供），醋酸钠(0.5g)，乙酸乙酯（8ml），10%醋酸，无水乙醇，1mol/LNaOH，蒸馏水，PH=4.7缓冲液，DNS试剂，0.9%NaCL，考马斯亮蓝G-250，系列标准蛋白液，150mol/L 磷酸等。
1.2器材离心机，722分光光度计，水浴锅，量筒25ml，烧杯100ml，大小试管若干，各种专用移液管，吸耳球，玻离棒，胶头滴管，PH试纸等。
1.3操作方法1．3.1蔗糖酶粗品制备方法(1)自溶法将5g酵母粉倒入500mL烧杯中、少量多次的加入15mL蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入0.5g乙酸钠、8mL乙酸乙酯，搅匀，盖好，于35℃恒温水浴中搅拌30min。
浙江大学生物化学实验甲 酵母蔗糖酶的制备、纯化步骤-离子交换
酵母蔗糖酶的制备一、酵母蔗糖酶的制备1.缓冲液抽提称取10克干酵母粉，加3克石英砂，于研钵中研磨约2分钟；再加30毫升0.02 mol/L pH7.3的Tris-HCl缓冲液（以6毫升1份分次加），边加边研磨至成浆状，将匀浆转移到50ml 离心管中，于8000转/分离心20分钟，形成三层；用滴管插入取水层（中层）于50ml离心管中，于10000转/分离心10分钟，取上清到量筒中，量体积，记为F1。
留0.5毫升以测定酶活力和蛋白质含量（Fraction I），其余转入50ml离心管中用于加热纯化。
2. 加热纯化将上清液置于50℃水浴中保温30分钟，随时摇动；然后于冰—水浴中冷却，以10000转/分离心10分钟，取上清液到量筒中，量体积，记为F2。
留0.5毫升测酶活力及蛋白质含量（Fraction Ⅱ）。
其余用于醇分级分离。
3. 醇分级分离于上清液中加入等体积-20℃预冷的95%乙醇，冰上进行，慢慢滴加，边滴边摇（控制在6-8分钟加完）。
充分混匀后，于冰-水浴中放置20分钟；以10000转/分离心10分钟，取沉淀，用4-5毫升0.05mol/L、pH7.3的Tris-HCl缓冲液（含0.025mol/LNaCl）溶解沉淀，于10000转/分离心10分钟，取上清到量筒中量体积，记为F3。
留1毫升测酶活力及蛋白质含量（FractionⅢ），其余用于柱层析。
样品保存于冰箱中备用。
4.DEAE-Sepharose柱层析分离纯化柱规格：1×20（cm，直径）流速：3ml/10min上清（约3~4ml）加到DEAE-Sepharose柱上进一步分离纯化。
流速3ml/10min，洗脱液：0.02 mol/L pH7.4的Tris-HCl，在0～1mol/L NaCl下进行线性梯度洗脱，收集：3ml /管。
二、各步提取液蛋白质含量的测定1. 蛋白质含量标准曲线的制作项目试管号0 1 2 3 4 5蛋白质含量（μg）/ 50 100 150 200 250蛋白质标准液（ml）/ 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0无离子水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 /Follin酚甲液（ml） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0充分混匀，于室温（20~25℃）放置10分钟Follin酚乙液（ml）0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5充分混匀，于30℃水浴保温30分钟OD650（nm）蛋白质标准液浓度：250ug/ml2. 各步提取液蛋白质含量测定(已预热到37℃)项 目 试管号空白 Fraction Ⅰ（1：10） Ⅱ（1：5） Ⅲ（1：2）1 2 3 4 5 6 7 稀释酶液（ml ） 0 0.1 0.2 0.1 0.2 0.1 0.2 无离子水（ml ） 1.0 0.9 0.8 0.9 0.8 0.9 0.8 Follin-酚甲液（ml ） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0充分混匀，于室温放置10分钟 Follin-酚乙液（ml ） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 充分混匀，于30℃水浴保温30分钟OD 650nm蛋白质含量（μg ） 平均值（μg ）提取液蛋白质总含量（mg ）三、各步提取液酶总活力及比活力测定1. 葡萄糖标准曲线的制作 项目 试管号0 12 3 4 5 6 8含糖量（）葡萄糖标准液（ml ） / 0.1 0.20.3 0.40.5 0.6 0.7无离子水（ml ） 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 DNS 试剂（ml ） 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8混匀，于100℃水浴中保温5分钟，取出经流动水冷却后，再加5ml 蒸馏水，混匀。
实验三十八 (9)酵母蔗糖酶的提取
2、超声破碎法提取蔗糖酶(3组)
称取5 g酵母粉于小烧杯中，加入30 ml pH5.8的醋酸-醋 酸钠缓冲液用玻棒搅匀，在600W下处理，每工作3s停 3s（120个循环），形成菌体匀浆。此法的缺点是在处 理过程会产生大量的热，应在冰浴中进行。
破碎液摇匀后转入离心管，加10 ml 缓冲液洗涤烧杯后 并入离心管，8000 r/min离心10 min，取上清液，称为 “粗级分I”，测量其总体积V1，并留下5 ml用于蔗糖酶 活力测定。
酵母蔗糖酶的提取
实验原理
蔗糖酶属于水解酶，催化蔗糖水解为葡萄糖和果糖 ，本实验选用蔗糖酶含量丰富的酵母为材料提取。
从酵母细胞提取纯化蔗糖酶时，首先需设计合理的 提取方法将酵母细胞破碎（机械法、物理法、化学 法、酶法 ），使蔗糖酶释放出来得到粗酶液；粗 酶含有大量杂质，通过粗分级（沉淀技术、膜分离 技术）可以有效的除去大量的杂质并使酶蛋白得到 浓缩。
（3）酶活力测定
• 取5 ml 5%蔗糖溶液于试管，共加两管，于25℃水浴保温5min， 向其中一管加入蔗糖酶溶液1.0 ml，立即混匀并计时，准确反 应5min后，加入5.0 ml 0.1mol/L NaOH溶液终止酶反应。另一 对照管先加入5.0 ml 0.1 mol/L NaOH溶液，再加入蔗糖酶溶液 1.0 ml。 • 取比色管3支，第l、2支管分别加入上述反应液各1.0 ml及水各 1.0 ml，第3管加蒸馏水2.0 ml，然后各管均加3.0 ml DNS试剂。 置于沸水浴中5 min，取出后用自来水冷却3 min，加蒸馏水至 25 ml，混匀。以第3管调零点，测A520nm。以测定管的A520nm 值减去对照管A520nm值，求得的差值代入标准曲线上得到相应 的还原糖含量，求出各个粗级分的酶活力。 • 一个蔗糖酶活力单位定义为在上述条件下，每分钟催化底物 蔗糖水解产生1 mg还原糖所需的酶量。
实验三 酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定
实验三酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定酶的纯化一、原理酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26)，本实验以酵母为原料，通过破碎细胞、热处理、乙醇沉淀、离子交换柱层析等步骤，提取蔗糖酶，并用聚丙稀酰胺凝胶电泳对其纯度进行测定。
离子交换层析法(ion-exchange chromatogramphy,简称IEC)中常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素(CM-纤维素)，阴离子交换剂有弱碱性的二乙氨基乙基纤维素(DEAE-纤维素)。
蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团相结合，结合力的大小取决于彼此之间相反电荷基团的静电引力，这又与溶液的pH值有关，因为pH值决定离子交换剂和蛋白质的解离程度。
盐类的存在可以降低离子交换剂的解离基团与蛋白质的相反电荷之间的静电引力，因此被的蛋白质的洗脱可通过改变pH值或离子强度 (或两者同时改变)来实现。
与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。
梯度洗脱是在洗脱过程中，使洗脱液的pH值(或两者同时)发生连续的变化，从而使吸附在柱上的各组分在不同的梯度下被洗脱下来。
二、实验材料、仪器和试剂1、实验材料干酵母2、仪器(1)高速离心机 (2)恒温水浴锅 (3)层析柱(1.0cm×16cm)(4)梯度混合器(5)部分收集器3、试剂(1) 95% 乙醇溶液 (2) DEAE-Sepharose Fast Flow (3) 1mol/L醋酸溶液(5) 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)(6) 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(内含1mol/L NaCl溶液)pH值7.3三、操作步骤1、破碎细胞取15g 干酵母，加5~10g石英砂，置于预先冷却的研钵中，加30ml去离子水，研磨30min，在冰箱中冰冻约20~30min（研磨液面上刚出现冰结为宜），重复2次，加5ml去离子水，置离心管中，12000r/min离心15min，留0.5ml上清液为第一组分。
[生物学]酵母蔗糖酶的提取工艺
![[生物学]酵母蔗糖酶的提取工艺](https://img.taocdn.com/s3/m/98b79150680203d8cf2f242c.png)
酵母蔗糖酶的提取工艺摘要蔗糖酶是一种水解酶, 广泛存在于动物、植物、微生物等各种生物体内。
它可以不可逆的催化蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖，为微生物的生长提供碳源和能源。
采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶[1]，冻融法和SDS抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。
其中冻融法的效率最高（纯化倍数比活力与总活力），加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。
比较了乙醇分级沉淀、硫酸铵分级沉淀对于冻融法得到的粗提物的沉淀效果，结果表明：50%(w/w)乙醇分级沉淀效果较好（比活力与总活力），乙醇分级沉淀所得蔗糖酶经DEAE-Sepharose 离子交换层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶（比活力与总活力）。
纯化倍数为16.14倍，比活性为947.805U/mg，回收率为51.6%。
蔗糖酶的酶促动力学性质表明，蔗糖酶的最适PH值为4.5，最适温度为50℃，酶的特征米氏常数Km值为13.8mmol/L，最大反应速度Vmax为5.98ug/min。
关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化Study on Purification of Invertase from YeastAbstractSucrase is widespread in prokaryotes and eukaryotes .Sucrase catalyzes the irreversible hydrolysis of sucrose into glucose and fructose.the mainfroms 实用文档of carbon and energy supplies in microorganism growth and development.This paper used three methods to extract invertase from yeast,which included in this manuscript, three different extraction method breaking cells by adding methylbenzene,frost grinding,and adding SDS for extracting invertase from yeast were investigated.Then the purified invertase was obtained by precipitatation with 50% ethyl alcohol、sequential ammonium sulpate precipitation and DEAE-Sepharose lon-exchange chromatography.The purified sucrase was characterized by SDS-PAGE.The results showed all three methods had both advantages and disadvantages.The invertase extracted by adding SDS and frost grinding had much more total activity than that of extracted by adding methylbenzene.A highest total invertase activity was found in the forst grinding,and it was a convent and economical method for commercial production of invertase from yeast.The results of our study were followed:1、Purification of invertase from yeastThe specific activity was 947.805U/mg,purification fold was 32.28.The activity recovery of sucrase was 51.6%.2、Properties of sucrase实用文档The kinetic characters of the enzyme have been studied.The optimum PH and optimum temperature for the enzyme are PH4.5 and 50℃.Km is 21mmol/Land Vmax is 6.57ug/min.Key words : yeast;invertase;extraction;purification第一部分文献综述蔗糖酶（Sucrase,EC 3.2.1.26）又称转化酶（Invertase），是将蔗糖水解成D-葡萄糖和D-果糖的ß-D-果糖苷酶的一种。
酵母蔗糖酶的制备与活力测定
酵母中蔗糖酶的制备及活力测定一、目的要求1、学习一种酵母中蔗糖酶的制备方法。
2.掌握3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）测定酶活力的原理和方法。
3. 掌握还原糖测定的基本原理和721分光光度计的操作。
二、实验原理蔗糖酶（invertase）（β—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
每水解1mol蔗糖，就生成2mol还原糖。
还原糖在碱性条件下加热可被氧化成糖酸及其它产物，而氧化剂3,5-二硝基水杨酸(DNS)则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计在520nm波长下测定光密度(OD)值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的含量。
酶活力单位的定义：在一定条件下，反应5分钟每产生1mg还原糖所需的酶量为一个活力单位（U）。
三、仪器与试剂1. 仪器研钵，天平，离心机，721型分光光度计，恒温水浴，具塞试管25ml，沸水浴，移液器（1000ul、200 ul）2. 试剂市售酵母干粉，石英砂，丙酮（预冷）, 1mg/ml葡萄糖溶液，pH4.5醋酸缓冲液, 10%蔗糖溶液，3,5-二硝基水杨酸溶液。
四、实验方法1. 蔗糖酶制备称取10g酵母干粉和少量石英砂放入研钵中，加适量蒸馏水，用力研磨30分钟成糊状，再加蒸馏水100ml，搅匀，6层纱布过滤，滤液加2倍体积冷丙酮搅匀，静置5分钟，离心管中，平衡后3000 rpm离心10 min，弃上清取沉淀。
沉淀用2倍体积丙酮重复操作一次。
沉淀真空干燥后称重。
再称取25mg酶粉加入少量蒸馏水研磨5分钟，用蒸馏水定容至40m l作为酶应用液备用。
2. 蔗糖酶活力测定（1）制作葡萄糖标准曲线取7支具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准溶液、蒸馏水和DNS试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。
酵母蔗糖酶的提取及性质测定
酵母蔗糖酶的提取及性质测定引论及原理酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究中有重要意义。
本实验属综合性实验，接近研究性实验，包括八个连续的实验内容，通过对蔗糖酶的提纯和性质测定，了解酶的基本研究过程；同时掌握各种生化技术的实验原理、基本操作方法。
本实验技术多样化，并且多个知识点互相联系，实验内容逐步加深，构成了一个综合性整体，为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。
蔗糖酶（invertase ）（β—D —呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
每水解1mol 蔗糖，就生成2mol 还原糖。
还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson 比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。
在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。
酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。
常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。
酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。
啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。
本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。
一、蔗糖酶的提取与部分纯化（一）实验目的学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。
（二）实验原理（略） （三）实验仪器、材料及试剂 仪器1. 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱2. 电子天平、研钵（＞200ml ）、制冰机、50ml 烧杯3. 离心管（2ml ，10ml ，30ml 或50ml ）、移液器（1000ul ）或滴管、量筒 材料及试剂1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存）＋ H 2O 蔗糖酶O HH O2.石英砂（海沙）、甲苯（使用前预冷到0℃以下）3.95%乙醇（预冷－20℃）、去离子水（使用前冷至4℃左右）4.Tris-HCl（pH7.3）缓冲液（四）操作步骤1. 提取（1）将市售鲜啤酒酵母2000 rpm，离心10 min，除去大量水分。
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实验3 酵母蔗糖酶的制备
一、实验目的
1、学习、掌握提取啤酒酵母中的蔗糖酶
2、学习用紫外分光光度法测定蛋白质含量
二、实验原理
酵母中得到，特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
啤酒酵母中含有大量的蔗糖酶，通过研磨破细胞壁，使酶游离出来，用水萃取酶，然后用有机溶剂沉淀酶蛋白得到粗制品，还可用柱层折进一步纯化得到精制品。
三、实验器材
1、试剂：二氧化硅、去离子水(使用前冷至4℃左右)、冰块、食盐、1mol/L乙酸、95％乙醇。
2、材料：啤酒酵母、
3、仪器：研体、恒温水浴锅、高速冷冻离心机。
四、实验步骤
1 研磨水提取
(1)准备一个冰浴，将研钵稳妥地放入冰浴中。
(2)称取1g啤酒醉母和适量(约5mg)二氧化硅一起放入研钵中，二氧化硅要预先研细。
(3)缓慢加入预冷的30m1去离子水．每次加2m1左右，边加边研磨．至少用30分钟，至酵母细胞大部分研碎，将蔗糖酶充分转入水相。
(4) 将混合物转入离心管中，平衡后．用高速冷冻离心机离心，4℃，10000r／min，离心15min。
(5) 用滴管小心地取出水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000r／min，离心15min。
(6) 将上清液转入量筒，量出体积。
用广泛pH试纸检查上清液PH，用lmol/L乙酸将pH调至5.0，称为“级分I”。
（级分I总共量了28ml）留出5m1测定酶活力及蛋白含量，剩余部分转入清洁离心管中。
2 热处理和乙醇沉淀
(1)预先将恒温水浴调到50℃，将盛有级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30min,在保温过程中不断轻摇离心管。
(2)取出离心管，于冰浴中迅速冷却，4℃．10000r／min，离心10min 。
(3)将上清液转入小烧杯中，放人冰盐浴(没有水的碎冰撒入少量食盐)，缓慢地加入等体积预冷至—20℃的95％乙醇，同时轻轻搅拌．再在冰盐浴中放置l0min、以沉淀完全。
于4℃、10000r ／min，离心10min,倾去上清液，并滴干，沉淀保存于烧杯中，盖上盖子或薄膜封口，然后将其放人冰箱中冷冻保存(称为“级分Ⅱ )。
3 紫外吸收法测定蛋白质
（1）取待测样品（本实验提取的级分1和级分Ⅱ）置于石英比色皿中，紫外分光光度计280nm 和260nm出测定OD，用去离子水作为空白对照；
（2）根据下列公式计算样品中蛋白质含量
蛋白质含量（mg/ml）=1.55 OD
280-0.76 OD
260
五、实验思考
1. 为什么酶的提取需要低温操作? 2．热处理的目的是什么？
实验4 蔗糖酶的活性和比活力测定
一、实验目的
1、掌握酶活性测定的方法和原理
2、测定级分Ⅰ、Ⅱ的酶活性，学习酶比活力计算。
二、实验原理
1、蔗糖＋蔗糖酶（水解酶）→D-果糖＋Ｄ－葡萄糖
用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度。
本实验中，蔗糖酶的活力单位指在一定条件下反应５min,每产生１mg葡萄糖所需的酶量。
２、DNS试剂＋Ｄ－葡＋强碱液中＋沸水浴生成氨基化合物（棕红色）
三、实验器材
1、试剂：葡萄糖2mol/L、蔗糖0.2mol/L、1mol/LNaOH、
DNS试剂：酒石酸钾钠18.2g,溶于50ml蒸馏水中，加热（不超过50℃），于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸0.63g，，NaOH 21.0g，苯酚5.0g，无水亚硫酸钠5.0g，
搅拌至溶解完全，冷却后用蒸馏水定容至1000mL，贮存于棕色瓶中，室温保存。
2、仪器：分光光度计、水浴锅
3、材料：实验3所得级分Ⅰ、Ⅱ的蔗糖酶
四、实验方法
1．工作曲线的制作
取６只试管，按下表加入2.0mg∕ml葡萄糖标准液和蒸馏水
管号葡标准液∕ml 蒸馏水∕ml 葡含量∕(mg.ml)-1
１０１０
２ 0.2 0.8 0.4
3 0.
4 0.6 0.8
4 0.6 0.4 1.2
5 0.8 0.2 1.6
6 1.0 0 2
在上述试管中＋ＤＮＳ试剂２ml，沸水浴５min，流动水迅速冷却，各加蒸馏水９ml，摇匀，在540nm波长测光吸收值，以葡含量（mg∕ml）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
2．酶液的稀释（级分Ⅰ、级分Ⅱ）
各取0.2ml稀释10倍，得到2ml稀释液。
3．吸光度的测定
取２ml稀释后的酶液＋２ml 0.2mol∕L蔗糖，立即摇匀开始计时，35℃水浴５min,立即加入１ml1mol/LNaOH中止反应。
取1ml的反应液＋２ml DNS试剂，沸水浴５min，立即用流动的自来水冷却后，加入９ml蒸馏水，进行吸光度的测定。
4．计算酶的活力稀释后的酶活力→原始酶活力
（1）酶活力计算：在室温、pH4.5 条件下，每分钟水解产生1μmol 葡萄糖所需的酶量，定义为酶的1个活力单位（U）
（2）计算级分Ⅰ、级分Ⅱ的比活力
比活力= 酶活力/1ml蛋白质的含量
注意事项：水浴温度，时间要精确
五实验思考
1、什么是比活力？测定比活力的意义是什么？
2、试分析级分Ⅰ、级分Ⅱ的比活力的高低和原因。