布鲁克液质联用操作规程

布鲁克液质联用仪操作规程

1操作前检查

1.1 检查液氮罐和高纯氮的出口压力，保证在正常范围

1.2检查洗针溶液和流动相

1.3流动相须现配并超声，缓冲盐溶液过0.22μm微孔滤膜（或者使用色谱纯的盐溶液和酸溶液）1.4 如使用溶融石英进样管，操作前应检查石英管是否拉长，确保其未超出ESI探针尖端。

1.5 检查系统真空度，电离真空计读数（分析仪区域）应小于5×10-6 Torr。

1.6 检查废液液位，及时清空废液。

1.7检查液氮罐和氦气钢瓶是否有一定压力，以便为测试样品提供符合流速和压力要求的氮气（喷雾气体和干燥气体）和氦气（碰撞气体）。

2操作步骤及注意事项

1．检查并打开干燥气(Dry gas) 和雾化气(Nebulizer Gas)所需的氮气源；

1) 如配备液氮罐，则需打开增压阀及供气阀阀门，使罐体压力保持在100 psi 以上，并调节减压阀出气口压力至0.6 Mpa；

2) 如配备氮气发生器，则提前半小时打开氮气发生器电源，以便使氮气能够达到99.99%以上的纯度，再调节氮气流量至20 L/min；

2．检查并打开碰撞气(Collision Gas) 高纯氮气N2或高纯氩气Ar钢瓶（纯度要求99.999%），并调节减压阀出气口压力至0.4 Mpa；

3．检查机械泵泵油的水平线，需在小窗口的1/2～2/3 之间；

4．打开计算机，显示器电源；

5．打开质谱仪主机电源（仪器左侧最下方）；

6．启动micrOTOFcontrol 控制软件，务必保持仪器一直处在shutdown状态，待真空度达到≤1×10e-6mbar后，才可切换至standby状态待机；为了保证良好稳定的实验结果，待真空度下降至

10e-7mbar以下后，再operate仪器开始测试。

2.2 新建液相方法

打开hystar软件，选择method，然后输入新建方法的名字，点击open，开始方法的新建。在弹出的对话框中选择edit，然后点击“wizard”进行设置。液相方法包括梯度、流速、柱温、样品盘温度、时间、进样针吸样速度等，可依次设置即可，全部设置好之后，将。

2.3新建质谱方法

方法一：

在otofcontrol中，打开method，按照自己待检测物的分子量范围及正负偏向性选择合适的质谱方法，小分子有对应的small molecular方法，蛋白质组有专门的proteomics方法。

方法二（非专业人员不推荐）：

在otofcontrol中，打开method，选择new，即可新建质谱方法。可以修改的参数包括以下几个方面：（1）mode中的Focus为active，line spectra calculation为use sum intensity，ion polarity 为pos或neg，mass range调到待检测物合适的分子量范围。

（2）source中capillarypos：4500V，neg：3500。Divert valve：source1-2进质谱；source1-6为discard to fluid

（3）Tune中collision RF 小分子调到1000-1500，大分子调到2000-2500；low mass视目标物分子量大小截留（例如目标分子为500，可调为300，去掉小分子区域的杂峰）。

（4）MS/MS中如果想检测二级，可以勾选auto MS/MS；precursor ions中cycle time 正常下为3s （5）chromatogram中选择BPC

根据待检测物的分子量大小和正负偏向性，先在软件自带的质谱方法中选择相应的方法，再在此方法的基础上进行优化及分段（如含盐的样品截掉前2-5分钟，1-6 waste）。

仪器在操作状态下稳定20-30 分钟后即可开始仪器质量准确度校正。

2.4仪器质量准确度校正

2.2.1. 药物和酶解多肽样品，选用甲酸钠溶液作为校正标准液。覆盖质量范围m/z90-1200；校正模式选用。

2.2.2. 蛋白质类样品选用三氟乙酸钠溶液作为校正标准液。覆盖质量范围m/z 200-2000；校正模式选用。

2.2.

3. 校正液配制

甲酸钠校正液：

溶剂：异丙醇:水溶液= 1:1 并含有0.2%甲酸

10mM 甲酸钠校正液：1ml 1M NaOH + 99ml 溶剂

三氟乙酸钠校正液：

溶剂：50%乙氰含有0.1%三氟乙酸钠(TFA)

2.2.

3. 校正界面

3.测样方式

3.1 直接进样测定

对于标准品或相对较纯或混合组分较少并且不含盐的药物样品，如果仅需要进行鉴定，可以采用直接进样方法测定。

3.1.1 样品用标准溶剂（50%H2O，50%乙腈或甲醇，0.1%甲酸）溶解或稀释

3.1.2 将配好的样品或标准品吸入进样器（针），将进样器（针）放置于进样泵中。注意：进样器（针）内不能有气泡

3.1.3 将进样器（针）直接与离子源连接（如图）

注意毛细管与注射器之间需紧密连接。进样器内不能有气泡

3.1.4 设置进样泵的流速为120～180 微升/小时。

3.2 液质联用（LC/MS）测定样品

采用常规液相色谱系统（色谱柱2.1x150mm；流速200-300uL/min）。启动Hystar 软件，打开hystar 软件，在sample table中选择相应的文件并打开，然后复制一个之前做过的样品，对复制后的新的一行进行文件名，存储路径和液相质谱方法的修改（改完之后再检查一遍）。

注：如果是新建sample table，可以打开一个新的复制一行粘贴到新建里，因为新建的自动进样的不对。