色谱法讲义

色谱法讲义第七章色谱分析基础一、概述（一）色谱发展概况最早创立色谱法的是俄国植物学家Tswett。

他在研究植物叶子的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。

当时Tswett把这种色带叫做“色谱”（Chromatographie，Tswett于1906年发表在德国植物学杂志上用此名，英译名为Chromatogra- phy），在这一方法中把玻璃管叫作“色谱柱”，碳酸钙叫作“固定相”，纯净的石油醚叫作“流动相”。

在Tswett提出色谱概念后的20多年里没有人关注这一伟大的发明。

直到1931年德国的Kuhn 和Lederer才重复了Tswett的某些实验，用氧化铝和碳酸钙分离了α-，β-，和γ-胡萝卜素，此后用这种方法分离了60多种这类色素。

Martin和Synge在 1940年提出液液分配色谱法（Liquid－Liquid Partition Chromatography），即固定相是吸附在硅胶上的水，流动相是某种有机溶剂。

1941年Martin和Syngee提出用气体代替液体作流动相的可能性，11年之后James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液色谱方法（Gas－Liquid Chromatography），因而获得了1952年的诺贝尔化学奖。

在此基础上，1957年Golay开创了开管柱气相色谱法（Open－Tubular Column Chromatography），习惯上称为毛细管柱气相色谱法（Capillary Column Chromatography ）。

1956年Van Deemter等在前人研究的基础上发展了描述色谱过程的速率理论，1965年Giddings总结和扩展了前人的色谱理论，为色谱的发展奠定了理论基础。

另一方面早在1944年Consden等就发展了纸色谱，1949年Macllean 等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法（TLC ）得以实际应用，而在1956年Stahl 开发出薄层色谱板涂布器之后，才使TLC得到广泛地应用。

在60年代末把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱，出现了高效液相色谱（HPLC）。

80年代初毛细管超临界流体色谱（SFC）得到发展，但在90年代后未得到较广泛的应用。

而在80年代初由Jorgenson等集前人经验而发展起来的毛细管电泳”（CZE），在90年代得到广泛的发展和应用。

同时集HPLC和CZE优点的毛细管电色谱在90年代后期受到重视。

到21世纪色谱科学将在生命科学等前沿科学领域发挥不可代替的重要作用。

1、色谱法在分析化学中的地位和作用色谱分析法的特点是它具有高超的分离能力，而各种分析对象又大都是混合物，为了分析鉴定它们是由什么物质组成和含量是多少，必须进行分离，所以色谱法成为许多分析方法的先决条件和必需的步骤。

2、色谱法的特点色谱法是以其高超的分离能力为特点，它的分离效率远远高于其它分离技术如蒸馏、萃取、离心等方法。

（1）分离效率高。

例如毛细管气相色谱柱（柱内径0.1-0.25μm），长30-50m其理论塔板数可以到 7万-12万。

而毛细管电泳柱一般都有几十万理论塔板数的柱效，至于凝胶毛细管电泳柱可达上千万理论塔板数的柱效。

（2）应用范围广。

它几乎可用于所有化合物的分离和测定，无论是有机物、无机物、低分子或高分子化合物，甚至有生物活性的生物大分子也可以进行分离和测定。

（3）分析速度快。

一般在几分钟到几十分钟就可以完成一次复杂样品的分离和分析。

近来的小内径（0.1mm）、薄液膜（0.2μm）、短毛细管柱（1-10 m）比原来的方法提高速度5-10倍。

（4）样品用量少。

用极少的样品就可以完成一次分离和测定。

（5）灵敏度高。

例如GC可以分析几纳克的样品，FID可达10-2g／s，ECD达10-3g／s；检测限为10-9 g／L和10-12 g／L的浓度。

（6）分离和测定一次完成。

可以和多种波谱分析仪器联用。

（7）易于自动化，可在工业流程中使用。

3、色谱法的分类色谱法或色谱分析（chromatography）也称之为色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别，当溶质在两相间做相对移动时，各物质在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离。

可完成这种分离的仪器即色谱仪。

色谱法的分类可按两相的状态及应用领域的不同分为两大类。

（1）、按流动相分气相色谱 gas chromatography (GC)–流动相是气体，固定相是固体吸收剂或液体（涂在固体上) 。

液相色谱 liquid chromatography (LC)–液体作为动流动相。

（2）、按分离机理分类吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法亲和色谱法（3）、按固定相的外形/相系统的形式分类柱色谱:填充柱色谱：固定相装于柱内的色谱法。

毛细管色谱法：采用内壁涂渍极薄而均匀的固定液膜的毛细管作为色谱柱的气相色谱法。

平板色谱: 固定相呈平板状的色谱法。

（4）、按使用领域不同对色谱仪的分类实验室用色谱仪分析用色谱仪便携式色谱仪流程色谱仪实验室用制备色谱仪制备用色谱仪工业用大型制备色谱仪色谱气相色谱(GC)液相色谱(LC)超临界色谱 (SFC)气固色谱 (GSC)气液色谱 (GLC)液固色谱液液色谱离子交换色谱空间排阻色谱反相分配色谱正相分配色谱柱色谱平板色谱电色谱薄层色谱 TLC纸色谱 TLC 亲合色谱毛细管柱电色谱毛细管电泳毛细管区带电泳毛细管凝胶电泳毛细管胶束电动色谱毛细管等电聚焦毛细管等速电泳平面层电色谱气固色谱：GC 是以气体作为流动相的一种色谱法。

利用不同物质在固体吸附剂上的物理吸附-解吸能力不同实现物质的分离。

应用范围：只适于较低分子量和低沸点气体组分的分离分析。

气液色谱：它是利用待测物在气体流动相和固定在惰性固体表面的液体固定相之间的分配原理实现分离。

二、色谱流出曲线及有关术语（一）、色谱流出曲线(The Chromatogram)1、色谱流出曲线(The Chromatogram)/色谱图（The Chromatogram ）在柱子的出口处，由检测器检测到的物质的浓度随时间变化的曲线。

或由检测器输出的电信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。

2、色谱峰（chromatographic peak ）色谱流出曲线上突起的部分。

当单个组份从柱中流出时，检测器响应信号的记录。

色谱峰的特点：如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线的线性范围内，色谱峰如果对称，可用Gauss 正态分布函数表示：⎥⎥⎦⎤⎢⎢⎣⎡⎪⎭⎫ ⎝⎛--=2021ex p 2σπσr t t c cc ：不同时间t 时某物质的浓度，σ：标准偏差，c0：进样浓度， t ：保留时间 3、色谱流出曲线的用途① 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组份的最少个数。

② 根据色谱峰的保留值(或位置）定性。

③ 根据峰面积（峰高）定量。

④ 色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据。

⑤ 色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（和流动相）选择是否合适的依据。

4、基线（baseline ）：在色谱分析中，当只有流动相通过而没有样品通过检测器时，记录所得到的检测信号随时间变化的曲线，应为一条直线。

5、峰高 ((peak height , h):色谱峰顶点与基线之间的垂直距离 （二）、保留值1、死时间(tM) :指不被固定相吸附或溶解的气体，从进样开始到柱后出现浓度最大值 时所需时间。

2、死体积(VM)= tM F0 指柱子在填充后，色谱柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间检测器的空间的总和。

3、保留时间 (tR) ：指被测组分从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需时间。

4、调整保留时间（tr ′）:扣除死体积后的保留体积 tr ′= 保留时间 ( tr ) － 死时间 （ t0 ）5、保留体积（Vr ）：指从进样开始到被测定组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相(载气)体积。

6、相对保留值（r2,1）:一种物质与另一种物质调整保留值之比。

()()的调整保留值前另一组分的调整保留值后某组分1212121,2===r r r r V V t t r1212121'2'1,2r r r r r r t t K K V V t t r ≠=== 意义：两组分热力学平衡分配的差别的度量。

影响因素：柱温（T ）、固定相的性质。

用途: 定性：一定色谱条件下，两组分的相对保留值是常数。

选择固定相： r2,1 值大，tr 大；r2,1 值小，tr 小。

（三）、区带宽度/区域宽度：（ Zone Broadening or Band Broadening ）数理统计用 s 来度量Gaussian 曲线的宽度。

表达方式：标准偏差,半峰宽度, 峰底宽度 1、标准偏差（s ）：0.607h 处一半的峰宽。

2、半峰宽度（ W1/2）: 峰高一半处的峰宽度W1/2 = 2s(2ln2)1/2 =2.354 s单位：mm或cm；时间min或s；体积。

3、峰底宽度（W）:色谱峰两侧的转折点所作切线在基线上的截距。

Y = 4s三、色谱分析的基本原理本节内容：色谱分析过程塔板理论（plate theory ）速率理论（rate theory ）色谱分离基本方程式流动相混合级组分进样分离信号信号转换和放大记录信号分离过程信号产生和处理过程（一）、色谱分析过程分离：基于物质溶解度、吸附能力、立体结构和离子交换等物化性质和结构上的微小差异，使其在流动相和固定相之间的作用力大小或强弱不同，当两相作相对运动时，组分在两相间进行连续多次分配，从而达到彼此分离的目的。

分析：利用组分的物理和化学性质(光学性质、电学性质、热学性质和化学显色反应等），设计各种检测器，对分离组分连续检测。

气固色谱：流动相是气体，固定相是固体，组分性质不同，吸附能力不同，差速运动气液色谱：流动相是气体，固定相是液体过程：载气+试样组分→溶解到固定相→载气流动→组分挥发→载气流动组分再溶解→ 载气流动→再挥发 →反复过程分配过程：组分在固定相和流动相之间发生的多次溶解挥发的过程 （二）、 气相色谱基本原理：在气液色谱中，被测物质各组分的分离是基于各组分在固定液中溶解度的不同。

当试样由载气携带进入色谱柱后，即被固定液所溶解。

随着载气继续流经色谱柱，溶解在固定液中的被测组分又从固定液中挥发出来到气相中去。

随着载气的流动，挥发到气相中的被测组分又会溶解在前面的固定液中。

这样反复多次溶解、挥发，再溶解、再挥发。

由于各组分在固定液中的溶解能力不同，溶解度较大的组分较难挥发，逐渐移在后面；而溶解度较小的组分，则移在了前面，经过一段时间之后，各组分就彼此分离了。