嗅鞘细胞及睫状神经营养因子在视神经损伤治疗中的协同作用
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［结果］
一、成功进行ＯＥＣｓ体外原代培养和纯化 应用原代培养技术，并用差速贴壁、阿糖胞苷抑制和Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ．ＳＰＥ营养物 处理，从２．５月成年大鼠的嗅球分离、培养和纯化ＯＥＣｓ。根据ｐ７５ ＮＧＦＲ免疫细胞 荧光染色及Ｈｏｅｃｈｓｔ细胞核标记染色分析了所得细胞的纯度并对不同培养时期的 细胞活性进行比较。成年大鼠来源的ＯＥＣｓ纯化周期为ｌＯｄ，所得纯度可达９５％以上， 纯化后１２—１４ｄ左右细胞活力开始下降。成年大鼠来源的ＯＥＣｓ所得纯度较高，有利
学位论文作者张扣苛
日期：
锄张
日期：
砂矿罗年多月２日
加罗年／月３日
嗅鞘细胞与睫状神经营养因子在视神经损伤治疗中的协同作用
摘要
嗅鞘细胞与睫状神经营养因子在 视神经损伤治疗中的协同作用
［目的］视神经损伤后难以再生，至今尚未找到促进损伤视神经完全修复的方法。 近来研究证明，嗅鞘细胞及睫状神经营养因子均可有效促进损伤神经修复再生。 本研究首次将尚处于实验阶段的嗅鞘细胞移植术和已进入临床应用的睫状神经 营养因子（ＣＮＴＦ）玻璃体内注射联合应用，以期达到更理想的治疗视神经损伤的
ｓｅｒｕｍ
神经营养因子
马血清
ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ
ｓｅｒｕｍ
胎牛血清
ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａFra Baidu bibliotekｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ
乙二胺四乙酸依地酸 二甲基亚砜
聚左旋赖氨酸
Ｐｏｌｙ——Ｌ——ｌｙｓｉｎｅ Ａｖｉｄｉｎ—ＦＩＴＣ Ｈｏｅｃｈｓｔ ＤＭＥＭ ＰＢＳ ＦＤＡ ＨＲＰ Ｂｒｄ－Ｕ ＰＩ ＢＰＥ ｄｕｌｂｅｃｃｏ’Ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌ ｉ ｎｅ
嗅鞘细胞
睫状节神经细胞营养因子
ｖｉｓｉｏｎ—‘ｅｖｏｋｅｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔ ｉｎｏｇｒａｍ ｆｌｕｏｒｏｇｏｌ ｄ ｃｈｏｌｅｒａｔｏｘｉｎ Ｂ ｂｉｏｐｉｎｙｌａｔｅｄ ｄｅｘｔａｎ ａｍｉｎｅ
视觉诱发电位 视网膜电图
荧光金 霍乱毒素Ｂ亚单位
生物素化葡聚糖胺
阿糖胞苷
ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｈｏｒｓｅ
葡聚糖胺（ｄｉｏｐｉｎｙｌａｔｅｄ
ｄｅｘｔａｎ
ａｍｉｎｅ，ＢＤＡ）逆行示踪技术评价ＯＥＣｓ和ＣＮＴＦ
对视网膜神经节细胞存活和视神经轴突再生的影响。通过计算视网膜上相同视野 下视网膜神经节细胞即神经元的存活数、神经元的突起长度和密度进行方差分析 和多元线性回归分析，评价ＯＥＣｓ和ＣＮＴＦ对视网膜神经节细胞及其轴突的逆行性保 护作用，比较ＯＥＣｓ、ＣＮＴＦ单独应用及联合应用对损伤视神经修复再生的影响，验 证二者的协同作用。
缩略词表
ＯＮ ＲＧＣｓ ＣＮＳ ＯＥＣｓ ＣＮＴＦ ＶＥＰ ＥＲＧ ＦＧ ＣＴＢ ＢＤＡ Ａｒａ－Ｃ ＮＴＦ ＨｏＳ ＦＢＳ ＥＤＴＡ ＤＭＳ０ ｏｐｔｉｃ
ｎｅｒｖｅ
视神经 视网膜神经节细胞 中枢神经系统
ｒｅｔｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｉｓ ｃｅｎｔｒａｌ
ｎｅｒｖｏｕｓ
ｓｙｓｔｅｍ
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ ｃｅｌ ｌｓ ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ
于进一步研究。
二、ＯＥＣｓ和ＣＮＴＦ对大鼠视神经损伤后神经元的保护作用 建立成年ＳＤ大鼠视神经吸断伤模型，将体外培养纯化的ＯＥＣｓ植入视神经吸断 处鞘膜下，同时玻璃体注射ＣＮＴＦ。按治疗手段不同，将实验大鼠分为对照组、ＣＮＴＦ
第二军医大学硕士学位论文
组、ＯＥＣｓ组和ＯＥＣｓ＋ＣＮＴＦ联合应用组。４ｗ后，通过计算视网膜上相应象限视网膜 神经节细胞即神经元的存活数、神经元的突起长度和密度进行方差分析和线性回 归分析，评价ＯＥＣｓ和ＣＮＴＦ对视网膜神经节细胞及其轴突的逆行性保护作用。与正 常眼大鼠视网膜神经节细胞数量相比，对照组损伤眼神经元明显减少。各治疗组 视网膜神经节细胞存活数明显多于对照组，且神经元轴突长度及密度也均大于对 照组。ＯＥＣｓ组的视网膜神经节细胞存活数高于ＣＮＴＦ组，证明ＯＥＣｓ保护视神经元作
亲和素一异硫氰酸荧光素 烟酸己可碱 ｍｅｄｉｕｍ达尔伯克（氏）需基本培养基 磷酸盐缓冲液
双醋酸荧光素
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ ｈｏｒｓｅｒａｄｉ ｓｈ ｐｅｒｏｘ ｉ ｄａｓｅ
辣根过氧化物酶 ５一溴一２一脱氧尿苷
碘化丙啶
牛垂体提取物
．６．
独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的 研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示谢意。本人承担本声明的法律责任。
效果，为临床救治视神经乃至中枢神经损伤提供新思路及实验依据。
［方法］本研究应用我校神经生物学教研室的ＯＥＣｓ原代培养技术，体外培养纯化 ＯＥＣｓ。然后建立成年ＳＤ大鼠视神经吸断伤模型：本实验采取经眶上缘暴露视神经 的方法制作视神经吸断伤模型，将体外培养纯化的ＯＥＣｓ植入球后视神经鞘膜下视 神经轴突的吸断处，同时玻璃体内注射ＣＮＴＦ。按治疗手段不同，将实验大鼠分为 对照组、ＣＮＴＦ组、ＯＥＣｓ组并ＩＯＥＣｓ＋ＣＮＴＦ联合应用组。术后４ｗ，采用霍乱毒素Ｂ亚单 位（ｃｈ０１ｅｒａｔｏｘｉｎ Ｂ，ＣＴＢ）顺行示踪技术及荧光金（ｆｌｕｏｒｏｇｏｌｄ，ＦＧ）、生物素化
学位论文作者签名：刁尹哥萍
日期：
砂。尸年／月≥日
学位论文版权使用授权书声明
本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规 定，第二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文 的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军 医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）
用强于ＣＮＴＦ。
三、ＯＥＣｓ和ＣＮＴＦ在视神经损伤修复过程中具有协同作用 在观测、统计上述各视神经损伤指标时发现，与ＣＮＴＦ或ＯＥＣｓ单用组相比，ＣＮＴＦ 和ＯＥＣｓ联合应用组对视神经损伤的修复作用最强。提示ＣＮＴＦ和ＯＥＣｓ在视神经损伤 修复治疗中具有协同作用。 ［结论］局部应用外源性ＯＥＣｓ并ｌＪ玻璃体注射ＣＮＴＦ均能减轻视神经损伤引起的逆行 性神经元损害，ＯＥＣｓ保护视神经元的作用优于ＣＮＴＦ。ＯＥＣｓ与ＣＮＴＦ联合应用保护视 神经元效果更加显著，两者合用产生了协同作用。
一、成功进行ＯＥＣｓ体外原代培养和纯化 应用原代培养技术，并用差速贴壁、阿糖胞苷抑制和Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ．ＳＰＥ营养物 处理，从２．５月成年大鼠的嗅球分离、培养和纯化ＯＥＣｓ。根据ｐ７５ ＮＧＦＲ免疫细胞 荧光染色及Ｈｏｅｃｈｓｔ细胞核标记染色分析了所得细胞的纯度并对不同培养时期的 细胞活性进行比较。成年大鼠来源的ＯＥＣｓ纯化周期为ｌＯｄ，所得纯度可达９５％以上， 纯化后１２—１４ｄ左右细胞活力开始下降。成年大鼠来源的ＯＥＣｓ所得纯度较高，有利
学位论文作者张扣苛
日期：
锄张
日期：
砂矿罗年多月２日
加罗年／月３日
嗅鞘细胞与睫状神经营养因子在视神经损伤治疗中的协同作用
摘要
嗅鞘细胞与睫状神经营养因子在 视神经损伤治疗中的协同作用
［目的］视神经损伤后难以再生，至今尚未找到促进损伤视神经完全修复的方法。 近来研究证明，嗅鞘细胞及睫状神经营养因子均可有效促进损伤神经修复再生。 本研究首次将尚处于实验阶段的嗅鞘细胞移植术和已进入临床应用的睫状神经 营养因子（ＣＮＴＦ）玻璃体内注射联合应用，以期达到更理想的治疗视神经损伤的
ｓｅｒｕｍ
神经营养因子
马血清
ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ
ｓｅｒｕｍ
胎牛血清
ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａFra Baidu bibliotekｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ
乙二胺四乙酸依地酸 二甲基亚砜
聚左旋赖氨酸
Ｐｏｌｙ——Ｌ——ｌｙｓｉｎｅ Ａｖｉｄｉｎ—ＦＩＴＣ Ｈｏｅｃｈｓｔ ＤＭＥＭ ＰＢＳ ＦＤＡ ＨＲＰ Ｂｒｄ－Ｕ ＰＩ ＢＰＥ ｄｕｌｂｅｃｃｏ’Ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌ ｉ ｎｅ
嗅鞘细胞
睫状节神经细胞营养因子
ｖｉｓｉｏｎ—‘ｅｖｏｋｅｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔ ｉｎｏｇｒａｍ ｆｌｕｏｒｏｇｏｌ ｄ ｃｈｏｌｅｒａｔｏｘｉｎ Ｂ ｂｉｏｐｉｎｙｌａｔｅｄ ｄｅｘｔａｎ ａｍｉｎｅ
视觉诱发电位 视网膜电图
荧光金 霍乱毒素Ｂ亚单位
生物素化葡聚糖胺
阿糖胞苷
ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｈｏｒｓｅ
葡聚糖胺（ｄｉｏｐｉｎｙｌａｔｅｄ
ｄｅｘｔａｎ
ａｍｉｎｅ，ＢＤＡ）逆行示踪技术评价ＯＥＣｓ和ＣＮＴＦ
对视网膜神经节细胞存活和视神经轴突再生的影响。通过计算视网膜上相同视野 下视网膜神经节细胞即神经元的存活数、神经元的突起长度和密度进行方差分析 和多元线性回归分析，评价ＯＥＣｓ和ＣＮＴＦ对视网膜神经节细胞及其轴突的逆行性保 护作用，比较ＯＥＣｓ、ＣＮＴＦ单独应用及联合应用对损伤视神经修复再生的影响，验 证二者的协同作用。
缩略词表
ＯＮ ＲＧＣｓ ＣＮＳ ＯＥＣｓ ＣＮＴＦ ＶＥＰ ＥＲＧ ＦＧ ＣＴＢ ＢＤＡ Ａｒａ－Ｃ ＮＴＦ ＨｏＳ ＦＢＳ ＥＤＴＡ ＤＭＳ０ ｏｐｔｉｃ
ｎｅｒｖｅ
视神经 视网膜神经节细胞 中枢神经系统
ｒｅｔｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｉｓ ｃｅｎｔｒａｌ
ｎｅｒｖｏｕｓ
ｓｙｓｔｅｍ
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ ｃｅｌ ｌｓ ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ
于进一步研究。
二、ＯＥＣｓ和ＣＮＴＦ对大鼠视神经损伤后神经元的保护作用 建立成年ＳＤ大鼠视神经吸断伤模型，将体外培养纯化的ＯＥＣｓ植入视神经吸断 处鞘膜下，同时玻璃体注射ＣＮＴＦ。按治疗手段不同，将实验大鼠分为对照组、ＣＮＴＦ
第二军医大学硕士学位论文
组、ＯＥＣｓ组和ＯＥＣｓ＋ＣＮＴＦ联合应用组。４ｗ后，通过计算视网膜上相应象限视网膜 神经节细胞即神经元的存活数、神经元的突起长度和密度进行方差分析和线性回 归分析，评价ＯＥＣｓ和ＣＮＴＦ对视网膜神经节细胞及其轴突的逆行性保护作用。与正 常眼大鼠视网膜神经节细胞数量相比，对照组损伤眼神经元明显减少。各治疗组 视网膜神经节细胞存活数明显多于对照组，且神经元轴突长度及密度也均大于对 照组。ＯＥＣｓ组的视网膜神经节细胞存活数高于ＣＮＴＦ组，证明ＯＥＣｓ保护视神经元作
亲和素一异硫氰酸荧光素 烟酸己可碱 ｍｅｄｉｕｍ达尔伯克（氏）需基本培养基 磷酸盐缓冲液
双醋酸荧光素
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ ｈｏｒｓｅｒａｄｉ ｓｈ ｐｅｒｏｘ ｉ ｄａｓｅ
辣根过氧化物酶 ５一溴一２一脱氧尿苷
碘化丙啶
牛垂体提取物
．６．
独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的 研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示谢意。本人承担本声明的法律责任。
效果，为临床救治视神经乃至中枢神经损伤提供新思路及实验依据。
［方法］本研究应用我校神经生物学教研室的ＯＥＣｓ原代培养技术，体外培养纯化 ＯＥＣｓ。然后建立成年ＳＤ大鼠视神经吸断伤模型：本实验采取经眶上缘暴露视神经 的方法制作视神经吸断伤模型，将体外培养纯化的ＯＥＣｓ植入球后视神经鞘膜下视 神经轴突的吸断处，同时玻璃体内注射ＣＮＴＦ。按治疗手段不同，将实验大鼠分为 对照组、ＣＮＴＦ组、ＯＥＣｓ组并ＩＯＥＣｓ＋ＣＮＴＦ联合应用组。术后４ｗ，采用霍乱毒素Ｂ亚单 位（ｃｈ０１ｅｒａｔｏｘｉｎ Ｂ，ＣＴＢ）顺行示踪技术及荧光金（ｆｌｕｏｒｏｇｏｌｄ，ＦＧ）、生物素化
学位论文作者签名：刁尹哥萍
日期：
砂。尸年／月≥日
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用强于ＣＮＴＦ。
三、ＯＥＣｓ和ＣＮＴＦ在视神经损伤修复过程中具有协同作用 在观测、统计上述各视神经损伤指标时发现，与ＣＮＴＦ或ＯＥＣｓ单用组相比，ＣＮＴＦ 和ＯＥＣｓ联合应用组对视神经损伤的修复作用最强。提示ＣＮＴＦ和ＯＥＣｓ在视神经损伤 修复治疗中具有协同作用。 ［结论］局部应用外源性ＯＥＣｓ并ｌＪ玻璃体注射ＣＮＴＦ均能减轻视神经损伤引起的逆行 性神经元损害，ＯＥＣｓ保护视神经元的作用优于ＣＮＴＦ。ＯＥＣｓ与ＣＮＴＦ联合应用保护视 神经元效果更加显著，两者合用产生了协同作用。