快速建立LC—MS／MS分析生物样品的方法

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【CN110111859A】一种高通量准确建立生物样本中甘油三酯LCMSMS数据库的方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910146123.9(22)申请日 2019.02.27(71)申请人嘉兴迈维代谢生物科技有限公司地址 314113 浙江省嘉兴市嘉善县大云镇上海人才创业园D1幢101室(72)发明人唐堂　张永明　(74)专利代理机构湖北武汉永嘉专利代理有限公司 42102代理人钟锋　徐晓琴(51)Int.Cl.G16C 20/62(2019.01)G16C 20/10(2019.01)(54)发明名称一种高通量准确建立生物样本中甘油三酯LC-MS/MS数据库的方法(57)摘要本发明属于应用化学领域，具体涉及一种高通量准确建立生物样本中甘油三酯LC -MS/MS数据库的方法。

所述方法包括：1)理论推导生物样本中甘油三酯化合物的分子量；2)根据甘油三酯化合物在较低能量下的质谱裂解规律，以及酯质化合物在反相色谱上表现出的规律，推测出生物样本中各甘油三酯化合物相应的保留时间；3)进一步通过甘油三酯化合物在较高能量下的质谱裂解规律，验证保留时间；最终建立甘油三酯化合物的LC -MS/MS数据库。

本发明所述方法快速简单，且耗费少、适用性强，既可以用于不同生物样本中甘油三酯化合物的分析，也可以用于其他类型酯质或酯质类似物的高通量分析。

权利要求书2页说明书4页附图4页CN 110111859 A 2019.08.09C N 110111859A权　利　要　求　书1/2页CN 110111859 A1.一种高通量准确建立生物样本中甘油三酯LC-MS数据库的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)理论推导生物样本中甘油三酯化合物的分子量：已知甘油三酯含三条酯肪酸链，每条酯肪酸链的表示形式为n:m，其中n代表碳原子个数，m代表双键个数，n:m共计20种选择，三三组合，理论上构成了20*20*20/6共1000个甘油三酯化合物；根据已知的甘油三酯化合物的精确分子量，利用不同甘油三酯化合物之间碳原子个数和双键个数的差别，推导出其他所有未知分子量的甘油三酯化合物的分子量；(2)推测生物样本中甘油三酯化合物的保留时间：根据甘油三酯化合物在较低能量CE ＝30eV下的质谱裂解规律，推导得到生物样本中的甘油三酯化合物在MRM模式下对应的1800个Q1/Q3离子对信息；设定CE＝30eV，输入1800个Q1/Q3离子对信息，将生物样本上机测试获得相应谱图，根据酯质化合物在反相色谱上表现出的规律，推测出生物样本中各甘油三酯化合物相应的保留时间；(3)验证保留时间：利用甘油三酯化合物在较高能量CE＝60eV下的质谱裂解规律，获得生物样本中的甘油三酯化合物在MRM模式下对应的1800个Q1/Q3离子对信息；设定CE＝60eV，输入1800个Q1/Q3离子对信息，将生物样本上机测试获得相应谱图，根据酯质化合物在反相色谱上表现出的规律，再次推测生物样本中各甘油三酯化合物相应的保留时间，所得推测结果用于与步骤(2)推测所得保留时间结果进行比较验证；(4)进一步验证保留时间：选取若干个生物样本中常见甘油三酯化合物的标准品，设定CE＝30eV，上机测试相应的保留时间，将该结果与步骤(2)推测所得甘油三酯化合物的保留时间进行比较、并对谱图上其他甘油三酯化合物的保留时间进行校正；最终得到了有效的离子对及相应的保留时间信息；(5)生物样本中甘油三酯化合物LC-MS/MS数据库的建立：当一个甘油三酯分子中有两个或三个酯肪酸链相关的离子对出峰时，默认检测到了该物质，通过这种推算方法，最终建立了甘油三酯化合物的LC-MS/MS数据库。

lcmsms的开发流程

lcmsms的开发流程
LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱法）的开发流程概括如下：
1. 方法设计：根据待测物性质选择合适的液相色谱条件，如色谱柱类型、流动相体系、梯度洗脱程序等；同时确定质谱参数，如离子源类型、母离子及子离子的选择、碰撞能量等。

2. 标准品制备：配制含有待测物的标准溶液系列，用于绘制校准曲线和方法的线性范围、灵敏度、准确度、精密度验证。

3. 方法优化：通过反复实验调整液相色谱和质谱条件，优化待测物的分离度和离子化效率，确保最佳检测性能。

4. 方法验证：按照法规或实验室标准，对方法进行特异性、线性、准确度、精密度、检测限和定量限等各项性能验证。

5. 样品前处理：制定样品提取、净化、浓缩等步骤，并验证前处理方法的回收率和干扰消除效果。

6. 应用与验证：在实际样品中应用开发的方法进行分析，确认方法在复杂基质中的适用性及可靠性。

整个流程需结合实验数据反馈不断迭代优化，最终建立稳定的LC-MS/MS分析方法。

检测细胞中1—磷酸鞘氨醇含量的LC—MS／MS分析方法的建立

检测细胞中1—磷酸鞘氨醇含量的LC—MS／MS分析方法的建立目的建立并确证可以检测1-磷酸鞘氨醇（S1P）快速、灵敏、特异的LC-MS/MS定量分析方法。

方法采用C17-S1P作为内参，甲醇一步法进行蛋白沉淀，随后进行正相电喷雾离子化LC-MS/MS分析。

流动相为甲醇-0.1%甲酸水（95∶5，v/v），流速0.2 mL/min，每个样品的分析时间为4 min。

细胞经TNF-α处理后S1P含量显著增加；而经DMS处理后S1P含量显著下降。

结果S1P的标准曲线线性范围为0.1～10 ng/mL。

如何利用LC-MSMS,更快更好的建立生物样品分析方法

如何利用LC-MS/MS，更快更好的建立生物样品分析方法?前言：以前曾在实验室的seminar上，做过一次关于如何建立生物样品分析方法的工作报告。

时隔两年，恰逢仪器信息网举办第一届网络原创作品大奖赛，在这里将这几年来对于生物样品分析的一点点感受总结一下，与大家交流、分享。

首先明确一下文中提到的“生物基质”，主要指的是血浆、血清、唾液、尿液或者器官组织等。

药物透过机体的各种生理屏障，进入到这些基质中，就是我们所说的“生物样品” (Biosample)。

生物样品中的药物浓度极低，我们如何利用灵敏度高的仪器如LC-MS/MS，更好的建立测定生物样品中药物浓度的分析方法呢？下面我主要从以下四个方面进行阐述：一、色谱-质谱条件的确立1、质谱条件的确立当使用液质联用仪对某一个化合物进行定量分析时，我们就需要建立一个质谱分析方法。

虽然仪器的型号不尽相同，但原理却是一致的，基本原理如图所示。

我们在确定方法时，主要考虑以下几个因素：（1）化合物的性质：包括化合物的结构、化合物的极性及化合物的pKa值。

首先了解化合物的结构，我们可以大概的推断其碎片离子的断裂方式，选择较为稳定的碎片离子作为定量反应的子离子，也可以根据经验判断选用哪种source更为合适；根据化合物的极性大小，我们可以选择一种或几种恰当的溶剂作为溶媒，既能保证完全将样品溶解，又能提高化合物的质谱响应；而清楚化合物的pKa值，有助于我们选择流动相的添加剂及其pH值，从而提高质谱响应。

（2）流动相添加剂的选择：在液相-紫外检测中，我们使用的添加剂的种类繁多，可以是挥发性的酸或者碱（如甲酸、乙酸和氨水等），也可以是不易挥发的缓冲盐（如磷酸二氢钠-磷酸缓冲液、磷酸二氢钾-磷酸缓冲盐）。

但是在液质分析中，基于质谱检测的原理，我们只能使用可挥发的酸碱或缓冲盐，那么种类就会受到极大的限制。

在日常分析中使用到的添加剂主要有甲酸、乙酸、三氟乙酸、氨水和甲酸铵、乙酸铵等缓冲盐，见图一。

lc-MS-MS分析样品

百泰派克生物科技lc-MS-MS分析样品液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）技术是一种可以对目标化合物（或分析物）进行物理分离并监测其质量的分析技术。

虽然相对较新，但其优良的灵敏度、宽泛的选择性以及良好的准确性使其成为检测微克甚至纳克量的各种分析物的首选技术，包括生物大分子、药物代谢物、农药和食品掺假物以及天然产品提取物等。

液相色谱（LC）实现了液体样品或固体样品溶液中分析物的物理分离。

尽管各种不同技术和灵敏度的检测器已经与液相色谱联用，用于分析不同类型的样品，但质谱仪已经成为一种选择性的、灵敏的和通用的检测器。

通过连接两个串联运行的质量分析仪，即LC-MS-MS，可以进一步提高样品识别和精确定量的准确性。

三重四极杆质谱仪（QQQ或TQMS）和四极杆飞行时间质谱仪（QTOF）是最常用的串联质谱仪，这些精密的配置为样品分析提供了更多的可能性。

液相色谱-串联质谱已广泛应用于分析不同基质中的小分子和大蛋白质分子，如: 蛋白质组的定量；活性药物成分中遗传毒性杂质的定量；生物液体中药物代谢物的定量；食品原料和膳食补充剂中掺杂物的检测等。

LC-MS-MS适用于极性和非极性化合物以及不耐热分子的分析，这些化合物的分子质量范围可以从m/z值< 1000 Da的低分子量分析物到m/z值> 100，000 Da的超高分子量蛋白质。

由于只能将液体样品注入色谱柱，固体样品必须溶解在合适的溶剂中，或者必须从样品中提取分析物。

因此，通过液-液萃取或固相萃取等技术制备样品对于从血浆、食物和土壤等复杂样品中提取目标分析物至关重要。

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台，结合Nano-LC色谱，提供基于LC-MS-MS的蛋白质组学分析服务技术包裹，您只需要将您的实验目的告诉我们并将您的细胞寄给我们，我们会负责项目后续所有事宜，包括细胞培养、细胞标记、蛋白提取、蛋白酶切、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析，欢迎免费咨询。

快速建立LC_MS_MS分析生物样品的方法

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析仪器
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快速建立 # ! N&! 1 ! 1 分析生物样品的方法
张娟红 # 王 # 荣 # 谢 # 华 # 贾正平 + # 张 # 强
" 兰州军区兰州总医院临床药理基地 #兰州 # $ I H , , . ,
液相色谱质谱联用技术取得了较大进展 # 该技术可对药物及其体内代谢产物进行定性 % 定量 ## 摘 # 要 # 近年来 # 分析 # 在药物代谢研究中得到广泛应用 & 然而 # 如何更快更好地建立生物样品分析方法还有待进一步研究 &本文对 !! 如何制备样品以减小基质效应 # 以及仪器维护的经验等 # N& ! 1 1 分析生物样品时如何优化质谱条件和流动相 # 问题进行探讨 # 总结出若干快速建立 # !! N& ! 1 1 分析生物样品的方法 & 关键词 # # !! N& ! 1 1 生物样品分析 # 基质效应
在液质定量分析中 " 由于质谱检测中所采用多反应监测 # 方法" 要求准确选择好被检测化合物 !O!$ 的母离子和子离子 " 因此" 它具有很高的专属性" 基于这点 " 在对多个化合物同时进行检测时 " 不需要彼此间达到完全分离就可以对他们进行定量分析 ! 但由于生物样品中大量基质的存在会需要强调的是 " 严重的干扰和影响化合物的测定 " 因而需要利用色谱方法将化合物与基质分开 " 从而降低基质效应的
/ ,( 影响 " 即降低离子抑制 ’ !

lcms代谢组学方法

lcms代谢组学方法
液相色谱-质谱联用（LC-MS）代谢组学方法是一种用于分析生物体内代谢产物的技术。

它结合了液相色谱的分离能力和质谱的高灵敏度、高分辨率特性，可以对复杂生物样本中的多种代谢产物进行同时分析。

LC-MS 代谢组学方法的基本流程包括以下几个步骤：
1. 样品制备：将生物样本（如血液、尿液、细胞提取物等）进行预处理，如去除蛋白质、沉淀杂质等，以提高分析的准确性。

2. 液相色谱分离：将预处理后的样品注入液相色谱系统，利用色谱柱对代谢产物进行分离。

根据不同的分离模式（如反相、正相、离子交换等），可以将不同性质的代谢产物分离开来。

3. 质谱检测：在色谱分离的同时，将分离出的代谢产物引入质谱仪进行检测。

质谱仪通过测量代谢产物的质荷比（m/z）和离子强度，提供代谢产物的结构信息和相对丰度。

4. 数据分析：通过对质谱数据进行处理和分析，可以识别和鉴定出不同的代谢产物，并进行定性和定量分析。

常用的数据分析方法包括质谱数据库比对、代谢途径分析、统计学分析等。

LC-MS 代谢组学方法具有高灵敏度、高分辨率、高通量等优点，可以同时分析数百种甚至数千种代谢产物。

它在生物医学研究、药物研发、环境监测等领域具有广泛的应用前景，可用于研究生物体内代谢产物的变化与疾病发生、药物作用、环境暴露等之间的关系。

LCMSMS农药一齐分析法(Ⅱ)

1. 适用范围适用于LC/MS/MS农药的一齐分析法（Ⅱ）中农药的检测。

2. 编制依据依据日本厚生劳动省《LCMS农药一齐分析法Ⅱ》编制。

3. 方法原理水果、蔬菜、加工产品中的农药残留经乙腈提取，提取溶液经净化、浓缩用50%的甲醇定容后，LC/MS/MS测定，用外标法定量。

4. 试剂4.1 乙腈：色谱级4.2 丙酮：色谱级4.3 正己烷：色谱级4.4 乙酸乙酯：色谱级4.5 无水硫酸钠：分析纯4.6 甲苯：色谱级4.7甲醇：色谱级4.8 氯化钠：分析纯4.9 0.01M 盐酸：8.29ml浓盐酸定容至1000ml5. 仪器设备5.1 Waters UPLC TQD5.2 食品加工器5.3菜刀，案板5.4电子天平5.5均质机5.6布氏漏斗，分液漏斗，普通漏斗，滤纸5.7梨形瓶（250ml，100ml）5.8 锥形瓶（200ml，100ml）5.9 C18固相萃取柱（1G 6ml）5.10氨基复合柱（Carbon/NH2 500mg 6ml）5.11硅胶柱Silica （500mg 6ml）5.12旋转蒸发仪5.13 氮吹仪5.14 玻璃离心管（10mL）5.15 分液漏斗振荡器5.16 真空泵5.17 移液枪（1mL，200μL）6. 分析步骤6.1 试料的制备：（除不加样品外，试剂空白与样品同步处理）将送交实验室的不少于500克的样品于食品加工器搅细（对于大块状的样品可先用水果刀切成小块，再放于食品加工器中搅细）。

粉碎后的样品装于一次性的塑料袋中备用。

6.2 提取6.2.1 准确称取10.0g（精确到0.1g）搅细的样品（原料称取20.0g）于均质杯中，加入70ml乙腈，在高速组织捣碎机中均质5min。

6.2.2 将样品减压抽滤，用30ml乙腈冲洗均质杯，也过滤，合并滤液。

6.2.3 将滤液倒入装有7gNaCl的300ml分液漏斗中，用20mL0.01M 盐酸冲洗三角瓶，也倒入分液漏斗中，在分液漏斗震荡器上剧烈震荡10min，静置10min，使乙腈相和水相分层。

LCMSMS农药一齐分析法

LCMSMS农药一齐分析法简介：LC-MS/MS是一种基于液相色谱联用串联质谱的分析技术，广泛应用于农药残留监测领域。

它具有高灵敏度、高选择性和高效率的优点，可以实现多种目标物同时检测和定量。

LC-MS/MS农药一齐分析法的原理：该分析方法首先通过液相色谱将样品中的目标物进行分离，然后经过串联质谱仪的产物离子扫描模式进行检测和定量。

在这种分析方法中，每个目标物都有一个特定的质谱图，通过与事先建立的质谱库中的标准谱进行比对，可以确定每个目标物的含量。

方法的步骤：1.样品的制备：将样品加入适量的溶剂中，并通过固相萃取或液-液萃取等方法将目标物提取出来。

然后使用气相色谱或高效液相色谱等方法对提取物进行净化和预处理。

2.样品的进样：将制备好的样品注入液相色谱系统中，通过自动进样器进行进样。

3.液相色谱的分离：使用液相色谱系统进行目标物的分离。

选择合适的色谱柱和流动相进行优化，以达到理想的分离效果。

4.串联质谱的检测：将液相色谱分离得到的目标物进入串联质谱仪进行检测和定量。

在质谱检测中，使用多反应监测（MRM）模式进行目标物的筛选和定量。

5.数据处理和结果分析：使用专业的数据处理软件对得到的质谱数据进行处理和分析，计算出每个目标物的浓度，并与质谱库中的标准谱进行比对确定目标物的含量。

LC-MS/MS农药一齐分析法的优点：1.高灵敏度：LC-MS/MS技术可以在低浓度下检测和定量目标物，其灵敏度通常比传统的色谱方法高几个数量级。

2.高选择性：通过质谱仪的选择离子模式和多反应监测模式，可以有效地排除样品中的干扰物，提高分析的选择性。

3.高效率：LC-MS/MS技术可以实现多种目标物的一齐分析，大大提高分析效率和样品通量。

4.宽线性范围：LC-MS/MS技术的线性范围通常较宽，可以适应不同浓度范围内目标物的测定需求。

总结：LC-MS/MS农药一齐分析法是一种高效、高灵敏度和高选择性的分析技术，在农药残留监测和食品安全领域具有重要的应用价值。

LC-MSMS定量分析流程与经验

LC-MSMS定量分析流程与经验LC-MS/MS定量分析流程与经验第一步： Q1 SCAN——确定母离子的质荷比●根据待测化合物性质，选择分析的极性(＋/－)、离子化方式(ESI/APCI)，根据分子量选择扫描范围和时间●确定母离子的质荷比，准确到小数点后一位。

参数设置：扫描方式：Q1 Scan质量范围：Parameter Range，100～MW+30，t=1～2secCenter Width，MW±5Da，t=0.5sec通过手动调节DP、GS1，使喷雾平稳、有效第二步：Product Ion Scan ——确定子离子的质荷比●得到高质量的MS2图，母离子的强度为图谱中基峰强度的1/3到1/4为宜●平滑后选择子离子质荷比，确定到小数点后一位参数设置扫描方式：Product Ion Scan质量范围：Parameter Range，50～MW+10，t=1～2sec通过手动调节CE第三步：优化化合物参数●根据前面选出的母、子离子，组建MRM离子对●选择多个离子对时，应合理分配每一对的分析时间●用“Ramp”，优化Compound项下各参数，以及Source项下CAD参数。

各离子对应分别设定。

●初步建立MRM方法●一般优化两次，以得到比较确切的结果第四步：方法转化：将连续进样方法→LC-MS方法●关掉所有质谱分析界面，将现有质谱体系灭活，激活液相色谱、质谱设备。

●单击Acquire中Build Acquire Method，打开上面保存过的MRM方法，添加设备：色谱泵、自动进样器等。

●设置色谱同步。

●设置色谱参数，分析时间一般为0.6～1min，流动相组成和流量与实际样品分析时相同；修改质谱分析时间，与色谱参数一致；设置GS1、GS2、TEM初始值为40、40、400左右，保存方法，例如：LC-MRM.dam。

第五步：FIA-优化Source参数●将前面用过的样品溶液稀释100～1000倍。

lc-ms-ms定量检测原理

lc-ms-ms定量检测原理
LC-MS-MS（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Mass Spectrometry）是一种高效液相色谱质谱检测技术。

其定量检
测原理分为前处理、色谱分离和质谱检测三个主要步骤。

1. 前处理：样品通常需要进行前处理步骤，如样品提取、富集和纯化等，以提高目标分析物的检测限和减少干扰物的影响。

2. 色谱分离：前处理后的样品通常会通过液相色谱技术进行分离。

在液相色谱柱中，样品中的不同分析物会根据其化学性质和亲合性以不同速率流动，并在色谱柱中被分离。

3. 质谱检测：分离后的化合物由色谱柱连接至质谱仪进行检测和定量。

在质谱仪中，分子离子会通过电荷分离和加速器分离进入质谱仪中的两个质量分析器之一，如四极杆（quadrupole）或飞行时间质谱仪（time-of-flight）。

通过在质谱仪中引入特
定质荷比的离子或离子对，可以选择性地检测目标分析物。

定量的原理是基于目标分析物的浓度与其在质谱检测器中产生的离子信号强度之间的关系。

通过测量目标分析物的峰面积或峰高，通过校准曲线或内标法可以确定目标分析物的浓度。

内标法通常使用一个已知浓度的化合物作为内标，通过内标的信号对目标分析物的信号进行校正，提高定量的准确性和精度。

LC-MS-MS定量检测原理可应用于多种领域，如药物代谢研究、毒理学研究和环境分析等。

它具有高灵敏度、高选择性和
较宽的线性范围，因此被广泛应用于药物研发、临床检测和环境监测等领域。

LC-MSMS在临床中的方法开发和验证

液质联用(LC/MS): LC为液相色谱仪；MS为一种能够生成离子，在气态中根据质荷比的不同将其分离并进行检测的仪器。

LC/MS以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，因而兼具有液相色谱高分离度与质谱高灵敏度的特点。

分析的样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。

方法开发的过程包括：文献检索、质谱方法建立、液相方法建立和前处理方法建立四大步。

第一、准备方法开发所需检测仪器、辅助设备、相关耗材及试剂等。

其中，对于分析方法需要关注以下内容：（1）样品前处理方法：样品类型、样品量、处理方法的选择，需要考虑样品处理的效果、试剂、耗材及时间成本；（2）质谱方法：离子化方式、质量分析器的选择、仪器型号、扫描方式的选择、离子检测通道及相应质谱参数；（3）液相色谱方法：色谱柱的选择、流动相的组成、洗脱方式、进样量。

第二、质谱方法建立。

质谱方法建立需完成以下步骤：1.配制纯标准溶液进行质谱扫描，根据目标分析物的极性大小选择合适的离子化方式（ESI、APCI、APPI等），并确定正负离子模式；2.确定定性定量离子对，在实现分析方法特异性和灵敏度要求的基础上，最好选择两个以上质谱响应高、选择性好、稳定性好的特征碎片离子分别作为定量和定性离子；临床LC-MS/MS方法大多为定量检测，通常采用多反应监测（MRM）或选择性反应监测（SRM）扫描方式；3.确定合适的离子源参数和扫描参数。

第三，建立液相色谱方法建立。

液相色谱方法的建立需要考虑以下内容：1.色谱柱的选择，包括填料类型（非极性固定相C18、C8、C4、苯基柱等，极性固定相氰基、硅胶、氨基等）、色谱柱可耐受PH值范围（分析物的酸碱性质）；2.流动相的选择，包括流动相的纯度（超纯水、色谱级溶剂）、流动相的种类（甲醇、乙腈、水等）；3.流动相添加剂的选择，使用挥发性添加剂（甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵等），尽量不要使用不挥发性添加剂（硫酸盐、磷酸盐等），防止影响离子化效率，损坏仪器；4.洗脱方式的优化，包括采用等度洗脱还是梯度洗脱、起始溶剂的比例、运行时间、柱温、进样体积等；考虑到临床样本基质的复杂性，尽量选择梯度洗脱模式。

生物样品分析方法建立的一般步骤

生物样品分析方法建立的一般步骤
《建立生物样品分析方法》
生物样品分析是一项重要的研究，它包括分类、识别、测定和其他生物的观察方法。

建立生物样品分析方法的步骤将帮助我们准确、快速地进行研究。

首先，要建立一个正确的生物样品，我们需要确定此类样品的特征，并进行正确的采样。

采样的数量必须满足研究的要求，以便收集足够的信息进行分析。

接下来，我们可以使用特定的观察和检测技术对样品进行分析，比如发光定量PCR、流式细胞分析仪等。

我们可以使用实验和数据处理来确定样品的比较特征，并抽取与此类样品相关的相关参数。

在收集生物样品之后，首先要准备一个清洁的工作室，以保证样品的清洁度并减少污染。

接下来，我们需要采用适当的快照技术进行样品处理，如取样、湿化和固定等，以便为后续的分析提供有效的样品。

最后，考虑总的样品特点，可以制定适用于此类样品的适当分析方法。

综上所述，建立生物样品分析方法的一般步骤是：确定样品的特征并采样，使用观察和检测技术进行分析，准备一个干净的工作室，使用快照技术处理样品，根据此类样品的特征制定合理的分析方法。

这些步骤将帮助我们准确、快速地进行研究。

质谱(lc-ms)方法开发指南

质谱（LC-MS）方法开发指南一、概述质谱（LC-MS）是一种强大的分析技术，广泛应用于生物医药、食品安全、环境监测等领域。

然而，开发一个可靠、灵敏的LC-MS方法并非易事，需要仔细的实验设计和严谨的操作。

本文旨在提供一份LC-MS方法开发的指南，帮助研究人员高效地完成LC-MS方法的开发工作。

二、样品准备1. 样品的选择：LC-MS分析的样品应具有一定的纯度和稳定性，避免样品中含有大量的杂质或不稳定的成分。

2. 样品的前处理：对于复杂样品，需要进行适当的前处理，如固相萃取、液-液萃取等，以提高分析的准确性和灵敏度。

三、色谱条件的选择1. 色谱柱的选择：根据样品性质和分析需求选择合适的色谱柱，如C18柱、C8柱等。

2. 流动相的选择：优化流动相的组成、pH值和流速，以提高分离效果和信号强度。

3. 温度控制：对于一些温敏感化合物，需要对色谱柱进行恒温控制，以避免样品分解或形成不稳定的反应物。

四、质谱条件的选择1. 离子源的选取：根据样品的性质选择合适的离子源，如电喷雾离子源（ESI）或化学电离源（APCI）等。

2. 探测器的选择：选择适当的探测器，如飞行时间质谱仪（TOF-MS）、三重四极杆质谱仪（Q-TOF）、四极杆质谱仪等。

3. 离子监测条件的优化：优化离子源的参数和质子化/去质子化离子片段的监测条件，以获得清晰的质谱图谱。

五、方法验证1. 灵敏度的验证：进行样品的定量限、检出限和线性范围的验证，以确保LC-MS方法的灵敏度满足分析要求。

2. 选择性的验证：对可能干扰的成分进行测试，验证LC-MS方法的选择性和特异性。

3. 精密度和准确度的验证：进行重复性和回收率的验证，评估LC-MS 方法的精密度和准确度。

六、实验操作的注意事项1. 仪器的维护和校准：定期对LC-MS仪器进行维护和校准，保证仪器的稳定性和准确性。

2. 样品的处理和储存：严格按照操作规程对样品进行处理和储存，避免样品受到污染或降解。

佥测细胞中1-磷酸鞘氨醇含量的LC—MS／MS分析方法的建立

ｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｃｅｌｌｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＴＮＦ— ｗｈｅｒｅａｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎｃｅｌｌｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＤＭＳ．ＲｅｓｕｌｔｓＳｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｓｗｅｒｅ
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血清样品中类固醇的快速LCMSMS测试方法

血清样品中类固醇的快速LC/MS/MS 测试方法本文概述了在AB SCIEX QTRAP ® 5500、Triple Quad™ 5500或API 5000™ LC/MS/MS 系统上，运用iMethod™类固醇类方法包进行检测满足实验要求，即一次进样即可同时分析血清样品中11种类固醇类化合物。

本方法分析以下11种类固醇类化合物：脱氢表雄酮硫酸盐（DHEAS ）、脱氢表雄酮（DHEA ），皮质醇、皮质酮、11-脱氧皮质醇，雄烯二酮、睾酮、17-羟基-黄体酮、黄体酮、雌二醇和25-羟基维生素D3。

同位素内标：雌二醇-d3、皮质醇-d4、睾酮-d3、DHEA-d2、皮质酮-d8、11-脱氧皮质醇-d2、17-羟基-黄体酮-d8、孕酮-d9和25-羟基维生素D3-d6。

将200 µL 人血清样品进行蛋白沉淀后，上清液经稀释后直接进行LC-APCI/MS/MS 分析，色谱柱为：PhenomenexKinetex,2.6 µC18,100×3.00mm ，分析时间为17分钟。

标准曲线利用经活性炭净化的血清空白样本配制成一系列浓度的标准溶液，建立校正工作曲线。

根据临床样本的浓度高低确定标准曲线的范围。

由于分析物存在内源性本底，在实验前需对空白血清样本进行检测。

各个化合物校正曲线浓度见表1。

图1. 人血清基质加标色谱图，浓度为：校正曲线定量上限（见表1）表1. 标准曲线浓度（ng/mL ）Compound 中文名称STD 1STD 2STD 3STD 4STD 5STD 6STD 7Androstenedione雄烯二酮5 2.5 1.250.250.1250.050.025Cortisol 皮质醇10005002505025105Corticosterone皮质脂酮1052.50.50.250.10.05以下为其中四种类固醇的校准曲线，线性范围为：0.1~20 ng/mL 。

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迅速发展，液相色谱一串联质谱联用（ＣＭＳＭＳＬ／／）
技术是目前公认的选择性最好的复杂样品分析技术之一＿。其次，ｌ］在药代动力学研究中，常需要对经生物样品中的微量乃至痕量成分进行定量分析，常规的分离检测技术难以满足复杂介质中痕量成分准确定量的要求，ＣＬ —ＭＳＭＳ以其高灵敏度和高选／
问题进行探讨，结出若干快速建立Ｌ — ／总ＣＭＳＭＳ分析生物样品的方法。
关键词Ｌ — ／ＣＭＳＭＳ生物样品分析基质效应
１前言
生命分析化学的重点在于为生命科学研究提供高效、简便、确的分析手段，求分析化学与生物、准要生化等相关学科更加紧密地结合；生命分析化学而所面临的最大挑战之一，分析工作必须在极其复是杂的样品基质中进行＿；命分析化学面向的对象１生
组分的分析。如何在如此复杂的基质中高灵敏度、
质谱条件、流动相、品制备方法等如何进行优化以样减小基质效应、器保护以及工作中的经验等问题仪
的探讨，总结出若干快速、敏和可靠的Ｌ —ＭＳ灵Ｃ／ＭＳ方法，用于快速分析生物样品。可
往往是成分、态复杂的生物样品，如组织提取形例
效应（ｔｉｆｅｔ是指标本中除分析物以外的其ｍａｒｅｆｃ）ｘ
他成分对分析物测定值的影响，扰了分析方法准干
确测定分析物的能力。简单的说，质效应就是样基
分析，药物代谢研究中得到广泛应用。然而，在如何更快更好地建立生物样品分析方法还有待进一步研究。本文对
Ｌ — ／ＣＭＳＭＳ分析生物样品时如何优化质谱条件和流动相，何制备样品以减小基质效应，如以及仪器维护的经验等
高选择性、高准确性和高通量地分析待测组分，生是
命分析化学急需解决的重要问题。目前，要有两 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ主
２优化质谱分析条件
２１化合物的性质．
个途径：第一，取多种前处理手段，大限度除去采最杂质，化基质，样品能够符合分析的要求。第简使二，采用高选择性分析手段和分析方法，以实现对生
２１年第３００期
分析仪器
２５
快速建立ＬＭＳＭＳ分析生物样品的方法Ｃ— ／
张娟红王荣谢华贾正平张强
（州军区兰州总医院临床药理基地，州，３００兰兰７０５）
摘
要
近年来，液相色谱质谱联用技术取得了较大进展，技术可对药物及其体内代谢产物进行定性、量该定
作者简介：张娟红，，９５年出生，士研究生，要从事体内药物分析研究工作。Ｅｉａｇｏｇ６（６．ｏ女１８硕主ｍａｌ：ｗｎｒｎ一９￣１３ｃｍ
品中的共流出物对待测物离子化过程的影响，为分离子抑制和离子增强两种，响了待测物的准确定影
量］。
本文通过对生物样品Ｌ — ／ＣＭＳＭＳ分析测定中
液、液、液等。这类样品不仅需要费时、血尿费力的前处理过程以使其转化为易分析的形态，而且往往含有成千上万种化合物，这些杂质大大干扰了待测
据化合物的ｐ值，Ｋａ有助于我们选择流动相的添加
剂及其ｐ值，而提高质谱响应＿］Ｈ从８。同时应注意药物在体内的存在形式及血浆蛋白结合率数值，以
择性，在这一领域的应用日益广泛并趋于常规化［。４］但是在生物样品的分析测定中，质效应是一个重基要的影响因素，约了该项技术的迅速发展。基质制
便采取适宜的预处理方法，高质谱响应值ｒ。提ｌ。。
２２质谱离子源的选择．
充分掌握离子源的特性，据被分析化合物的根
基金项目：国家科技部重大项目（０８Ｘ－００４００２０ＺＴ－９１ — １）
子作为定量反应的子离子，可以根据经验判断选也用哪种离子源更为合适；根据化合物的极性大小，可以选择一种或几种恰当的溶剂作为溶媒，既能保证完全将样品溶解，能提高化合物的质谱响应；根又而
物样品的定量分析。而上世纪９Ｏ年代随着大气压离子化（Ｃ）电喷雾离子化（Ｓ）ＡＰＩ及ＥＩ等接口技术的
首先了解化合物性质，化合物的结构、性及对极ｐ值必须清楚。根据化合物的结构，以大概推Ｋａ可断其碎片离子的断裂方式，择较为稳定的碎片离选