快速建立LC—MS/MS分析生物样品的方法

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【CN110111859A】一种高通量准确建立生物样本中甘油三酯LCMSMS数据库的方法【专利】

【CN110111859A】一种高通量准确建立生物样本中甘油三酯LCMSMS数据库的方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910146123.9(22)申请日 2019.02.27(71)申请人 嘉兴迈维代谢生物科技有限公司地址 314113 浙江省嘉兴市嘉善县大云镇上海人才创业园D1幢101室(72)发明人 唐堂 张永明 (74)专利代理机构 湖北武汉永嘉专利代理有限公司 42102代理人 钟锋 徐晓琴(51)Int.Cl.G16C 20/62(2019.01)G16C 20/10(2019.01)(54)发明名称一种高通量准确建立生物样本中甘油三酯LC-MS/MS数据库的方法(57)摘要本发明属于应用化学领域,具体涉及一种高通量准确建立生物样本中甘油三酯LC -MS/MS数据库的方法。

所述方法包括:1)理论推导生物样本中甘油三酯化合物的分子量;2)根据甘油三酯化合物在较低能量下的质谱裂解规律,以及酯质化合物在反相色谱上表现出的规律,推测出生物样本中各甘油三酯化合物相应的保留时间;3)进一步通过甘油三酯化合物在较高能量下的质谱裂解规律,验证保留时间;最终建立甘油三酯化合物的LC -MS/MS数据库。

本发明所述方法快速简单,且耗费少、适用性强,既可以用于不同生物样本中甘油三酯化合物的分析,也可以用于其他类型酯质或酯质类似物的高通量分析。

权利要求书2页 说明书4页 附图4页CN 110111859 A 2019.08.09C N 110111859A权 利 要 求 书1/2页CN 110111859 A1.一种高通量准确建立生物样本中甘油三酯LC-MS数据库的方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)理论推导生物样本中甘油三酯化合物的分子量:已知甘油三酯含三条酯肪酸链,每条酯肪酸链的表示形式为n:m,其中n代表碳原子个数,m代表双键个数,n:m共计20种选择,三三组合,理论上构成了20*20*20/6共1000个甘油三酯化合物;根据已知的甘油三酯化合物的精确分子量,利用不同甘油三酯化合物之间碳原子个数和双键个数的差别,推导出其他所有未知分子量的甘油三酯化合物的分子量;(2)推测生物样本中甘油三酯化合物的保留时间:根据甘油三酯化合物在较低能量CE =30eV下的质谱裂解规律,推导得到生物样本中的甘油三酯化合物在MRM模式下对应的1800个Q1/Q3离子对信息;设定CE=30eV,输入1800个Q1/Q3离子对信息,将生物样本上机测试获得相应谱图,根据酯质化合物在反相色谱上表现出的规律,推测出生物样本中各甘油三酯化合物相应的保留时间;(3)验证保留时间:利用甘油三酯化合物在较高能量CE=60eV下的质谱裂解规律,获得生物样本中的甘油三酯化合物在MRM模式下对应的1800个Q1/Q3离子对信息;设定CE=60eV,输入1800个Q1/Q3离子对信息,将生物样本上机测试获得相应谱图,根据酯质化合物在反相色谱上表现出的规律,再次推测生物样本中各甘油三酯化合物相应的保留时间,所得推测结果用于与步骤(2)推测所得保留时间结果进行比较验证;(4)进一步验证保留时间:选取若干个生物样本中常见甘油三酯化合物的标准品,设定CE=30eV,上机测试相应的保留时间,将该结果与步骤(2)推测所得甘油三酯化合物的保留时间进行比较、并对谱图上其他甘油三酯化合物的保留时间进行校正;最终得到了有效的离子对及相应的保留时间信息;(5)生物样本中甘油三酯化合物LC-MS/MS数据库的建立:当一个甘油三酯分子中有两个或三个酯肪酸链相关的离子对出峰时,默认检测到了该物质,通过这种推算方法,最终建立了甘油三酯化合物的LC-MS/MS数据库。

lcmsms的开发流程

lcmsms的开发流程

lcmsms的开发流程
LC-MS/MS(液相色谱-串联质谱法)的开发流程概括如下:
1. 方法设计:根据待测物性质选择合适的液相色谱条件,如色谱柱类型、流动相体系、梯度洗脱程序等;同时确定质谱参数,如离子源类型、母离子及子离子的选择、碰撞能量等。

2. 标准品制备:配制含有待测物的标准溶液系列,用于绘制校准曲线和方法的线性范围、灵敏度、准确度、精密度验证。

3. 方法优化:通过反复实验调整液相色谱和质谱条件,优化待测物的分离度和离子化效率,确保最佳检测性能。

4. 方法验证:按照法规或实验室标准,对方法进行特异性、线性、准确度、精密度、检测限和定量限等各项性能验证。

5. 样品前处理:制定样品提取、净化、浓缩等步骤,并验证前处理方法的回收率和干扰消除效果。

6. 应用与验证:在实际样品中应用开发的方法进行分析,确认方法在复杂基质中的适用性及可靠性。

整个流程需结合实验数据反馈不断迭代优化,最终建立稳定的LC-MS/MS分析方法。

检测细胞中1—磷酸鞘氨醇含量的LC—MS/MS分析方法的建立

检测细胞中1—磷酸鞘氨醇含量的LC—MS/MS分析方法的建立

检测细胞中1—磷酸鞘氨醇含量的LC—MS/MS分析方法的建立目的建立并确证可以检测1-磷酸鞘氨醇(S1P)快速、灵敏、特异的LC-MS/MS定量分析方法。

方法采用C17-S1P作为内参,甲醇一步法进行蛋白沉淀,随后进行正相电喷雾离子化LC-MS/MS分析。

流动相为甲醇-0.1%甲酸水(95∶5,v/v),流速0.2 mL/min,每个样品的分析时间为4 min。

细胞经TNF-α处理后S1P含量显著增加;而经DMS处理后S1P含量显著下降。

结果S1P的标准曲线线性范围为0.1~10 ng/mL。

相关系数r2均大于0.989。

结论该方法可以快速,灵敏,特异性地同时检测生物样品中S1P的含量。

标签:含量测定;1-磷酸鞘氨醇;液质联用鞘磷脂不仅是细胞膜的主要成分,也可作为信号分子调控多种细胞进程,包括细胞增殖,分化,存活,死亡以及一些细胞的炎症反应[1-2]。

几种磷脂类代谢物,特别是鞘氨醇(Sph)和1-磷酸鞘氨醇(S1P)被认为是具有显著生物活性的关键分子,控制着细胞生存和死亡。

S1P可以被S1P磷酸酶去磷酸化为Sph。

Sph作为负性调节因子,抑制细胞增殖和促进凋亡。

相反,S1P作为Sph的磷酸化产物,参与了促进细胞增殖和抑制凋亡过程[3]。

目前已有一些方法用于测定生物样品中低丰度的S1P含量。

这些方法包括放射性同位素掺入酶促反应实验[4],放射性受体结合实验[5],HPLC柱前衍生化[6-7],质谱[8-9]以及LC-MS/MS 等。

在本研究中,我们建立了一种快速,简便,灵敏的LC-MS/MS分析方法。

本方法成功地测定了HEK293细胞中S1P的含量。

1 仪器与试药Finnigan TSQ Quantum三重四极杆质谱仪(Thermo Electron,San Jose,CA,USA),色谱分析柱为Luna-RP C18色谱柱(150 mm L×2 mm i.d.,5 μm particle size and 100 ? pore size);外加C18保护预柱(4.0 mm L ×2.0 mm i.d.)(Phenomenex,Torrance,CA,USA)。

如何利用LC-MSMS,更快更好的建立生物样品分析方法

如何利用LC-MSMS,更快更好的建立生物样品分析方法

如何利用LC-MS/MS,更快更好的建立生物样品分析方法?前言:以前曾在实验室的seminar上,做过一次关于如何建立生物样品分析方法的工作报告。

时隔两年,恰逢仪器信息网举办第一届网络原创作品大奖赛,在这里将这几年来对于生物样品分析的一点点感受总结一下,与大家交流、分享。

首先明确一下文中提到的“生物基质”,主要指的是血浆、血清、唾液、尿液或者器官组织等。

药物透过机体的各种生理屏障,进入到这些基质中,就是我们所说的“生物样品” (Biosample)。

生物样品中的药物浓度极低,我们如何利用灵敏度高的仪器如LC-MS/MS,更好的建立测定生物样品中药物浓度的分析方法呢?下面我主要从以下四个方面进行阐述:一、色谱-质谱条件的确立1、质谱条件的确立当使用液质联用仪对某一个化合物进行定量分析时,我们就需要建立一个质谱分析方法。

虽然仪器的型号不尽相同,但原理却是一致的,基本原理如图所示。

我们在确定方法时,主要考虑以下几个因素:(1)化合物的性质:包括化合物的结构、化合物的极性及化合物的pKa值。

首先了解化合物的结构,我们可以大概的推断其碎片离子的断裂方式,选择较为稳定的碎片离子作为定量反应的子离子,也可以根据经验判断选用哪种source更为合适;根据化合物的极性大小,我们可以选择一种或几种恰当的溶剂作为溶媒,既能保证完全将样品溶解,又能提高化合物的质谱响应;而清楚化合物的pKa值,有助于我们选择流动相的添加剂及其pH值,从而提高质谱响应。

(2)流动相添加剂的选择:在液相-紫外检测中,我们使用的添加剂的种类繁多,可以是挥发性的酸或者碱(如甲酸、乙酸和氨水等),也可以是不易挥发的缓冲盐(如磷酸二氢钠-磷酸缓冲液、磷酸二氢钾-磷酸缓冲盐)。

但是在液质分析中,基于质谱检测的原理,我们只能使用可挥发的酸碱或缓冲盐,那么种类就会受到极大的限制。

在日常分析中使用到的添加剂主要有甲酸、乙酸、三氟乙酸、氨水和甲酸铵、乙酸铵等缓冲盐,见图一。

lc-MS-MS分析样品

lc-MS-MS分析样品

百泰派克生物科技lc-MS-MS分析样品液相色谱-串联质谱(LC-MS-MS)技术是一种可以对目标化合物(或分析物)进行物理分离并监测其质量的分析技术。

虽然相对较新,但其优良的灵敏度、宽泛的选择性以及良好的准确性使其成为检测微克甚至纳克量的各种分析物的首选技术,包括生物大分子、药物代谢物、农药和食品掺假物以及天然产品提取物等。

液相色谱(LC)实现了液体样品或固体样品溶液中分析物的物理分离。

尽管各种不同技术和灵敏度的检测器已经与液相色谱联用,用于分析不同类型的样品,但质谱仪已经成为一种选择性的、灵敏的和通用的检测器。

通过连接两个串联运行的质量分析仪,即LC-MS-MS,可以进一步提高样品识别和精确定量的准确性。

三重四极杆质谱仪(QQQ或TQMS)和四极杆飞行时间质谱仪(QTOF)是最常用的串联质谱仪,这些精密的配置为样品分析提供了更多的可能性。

液相色谱-串联质谱已广泛应用于分析不同基质中的小分子和大蛋白质分子,如: 蛋白质组的定量;活性药物成分中遗传毒性杂质的定量;生物液体中药物代谢物的定量;食品原料和膳食补充剂中掺杂物的检测等。

LC-MS-MS适用于极性和非极性化合物以及不耐热分子的分析,这些化合物的分子质量范围可以从m/z值< 1000 Da的低分子量分析物到m/z值> 100,000 Da的超高分子量蛋白质。

由于只能将液体样品注入色谱柱,固体样品必须溶解在合适的溶剂中,或者必须从样品中提取分析物。

因此,通过液-液萃取或固相萃取等技术制备样品对于从血浆、食物和土壤等复杂样品中提取目标分析物至关重要。

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台,结合Nano-LC色谱,提供基于LC-MS-MS的蛋白质组学分析服务技术包裹,您只需要将您的实验目的告诉我们并将您的细胞寄给我们,我们会负责项目后续所有事宜,包括细胞培养、细胞标记、蛋白提取、蛋白酶切、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析,欢迎免费咨询。

快速建立LC_MS_MS分析生物样品的方法

快速建立LC_MS_MS分析生物样品的方法
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析 仪 器
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快速建立 # ! N&! 1 ! 1 分析生物样品的方法
张娟红 # 王 # 荣 # 谢 # 华 # 贾正平 + # 张 # 强
" 兰州军区兰州总医院临床药理基地 #兰州 # $ I H , , . ,
液相色谱质谱联用技术取得了较大进展 # 该技术可对药物 及 其 体 内 代 谢 产 物 进 行 定 性 % 定量 ## 摘 # 要 # 近年来 # 分析 # 在药物代谢研究中得到广泛应用 & 然而 # 如何更快更好地建立生物样品分析方法还有待进一步研究 &本文对 !! 如何制备样品以减小基质效应 # 以及仪器维护的经验等 # N& ! 1 1 分析生物样品时如何优化质谱条件和流动相 # 问题进行探讨 # 总结出若干快速建立 # !! N& ! 1 1 分析生物样品的方法 & 关键词 # # !! N& ! 1 1 生物样品分析 # 基质效应
在液质定量分析中 " 由于质谱检测中所采用多反应 监测 # 方 法" 要求准确选择好被检测化合物 !O!$ 的母离子和子离 子 " 因 此" 它 具 有 很 高 的 专 属 性" 基 于这点 " 在对多个化合物同时进行检测时 " 不需要彼 此间达到完全分离就可以对他们进行定量分析 ! 但 由于 生 物 样 品 中 大 量 基 质 的 存 在 会 需要强调的是 " 严重的干扰和影响 化 合 物 的 测 定 " 因而需要利用色 谱方法将化合物与 基 质 分 开 " 从而降低基质效应的
/ ,( 影响 " 即降低离子抑制 ’ !

lcms代谢组学方法

lcms代谢组学方法

lcms代谢组学方法
液相色谱-质谱联用(LC-MS)代谢组学方法是一种用于分析生物体内代谢产物的技术。

它结合了液相色谱的分离能力和质谱的高灵敏度、高分辨率特性,可以对复杂生物样本中的多种代谢产物进行同时分析。

LC-MS 代谢组学方法的基本流程包括以下几个步骤:
1. 样品制备:将生物样本(如血液、尿液、细胞提取物等)进行预处理,如去除蛋白质、沉淀杂质等,以提高分析的准确性。

2. 液相色谱分离:将预处理后的样品注入液相色谱系统,利用色谱柱对代谢产物进行分离。

根据不同的分离模式(如反相、正相、离子交换等),可以将不同性质的代谢产物分离开来。

3. 质谱检测:在色谱分离的同时,将分离出的代谢产物引入质谱仪进行检测。

质谱仪通过测量代谢产物的质荷比(m/z)和离子强度,提供代谢产物的结构信息和相对丰度。

4. 数据分析:通过对质谱数据进行处理和分析,可以识别和鉴定出不同的代谢产物,并进行定性和定量分析。

常用的数据分析方法包括质谱数据库比对、代谢途径分析、统计学分析等。

LC-MS 代谢组学方法具有高灵敏度、高分辨率、高通量等优点,可以同时分析数百种甚至数千种代谢产物。

它在生物医学研究、药物研发、环境监测等领域具有广泛的应用前景,可用于研究生物体内代谢产物的变化与疾病发生、药物作用、环境暴露等之间的关系。

LCMSMS农药一齐分析法(Ⅱ)

LCMSMS农药一齐分析法(Ⅱ)

1. 适用范围适用于LC/MS/MS农药的一齐分析法(Ⅱ)中农药的检测。

2. 编制依据依据日本厚生劳动省《LCMS农药一齐分析法Ⅱ》编制。

3. 方法原理水果、蔬菜、加工产品中的农药残留经乙腈提取,提取溶液经净化、浓缩用50%的甲醇定容后,LC/MS/MS测定,用外标法定量。

4. 试剂4.1 乙腈:色谱级4.2 丙酮:色谱级4.3 正己烷:色谱级4.4 乙酸乙酯:色谱级4.5 无水硫酸钠:分析纯4.6 甲苯:色谱级4.7甲醇:色谱级4.8 氯化钠:分析纯4.9 0.01M 盐酸:8.29ml浓盐酸定容至1000ml5. 仪器设备5.1 Waters UPLC TQD5.2 食品加工器5.3菜刀,案板5.4电子天平5.5均质机5.6布氏漏斗,分液漏斗,普通漏斗,滤纸5.7梨形瓶(250ml,100ml)5.8 锥形瓶(200ml,100ml)5.9 C18固相萃取柱(1G 6ml)5.10氨基复合柱(Carbon/NH2 500mg 6ml)5.11硅胶柱Silica (500mg 6ml)5.12旋转蒸发仪5.13 氮吹仪5.14 玻璃离心管(10mL)5.15 分液漏斗振荡器5.16 真空泵5.17 移液枪(1mL,200μL)6. 分析步骤6.1 试料的制备:(除不加样品外,试剂空白与样品同步处理)将送交实验室的不少于500克的样品于食品加工器搅细(对于大块状的样品可先用水果刀切成小块,再放于食品加工器中搅细)。

粉碎后的样品装于一次性的塑料袋中备用。

6.2 提取6.2.1 准确称取10.0g(精确到0.1g)搅细的样品(原料称取20.0g)于均质杯中,加入70ml乙腈,在高速组织捣碎机中均质5min。

6.2.2 将样品减压抽滤,用30ml乙腈冲洗均质杯,也过滤,合并滤液。

6.2.3 将滤液倒入装有7gNaCl的300ml分液漏斗中,用20mL0.01M 盐酸冲洗三角瓶,也倒入分液漏斗中,在分液漏斗震荡器上剧烈震荡10min,静置10min,使乙腈相和水相分层。

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迅速 发展 , 液相 色谱 一 串联 质谱 联 用 ( C MS MS L/ / )
技术是 目前公 认 的选择 性最好 的复杂样 品分 析技术 之一_ 。其次 , l ] 在药 代 动力 学 研究 中 , 常 需要 对 经 生物样 品 中的微量 乃 至 痕 量成 分 进 行 定量 分 析 , 常 规 的分 离检测 技术难 以满 足复 杂介质 中痕 量成 分准 确定 量 的要 求 , C L —MS MS以其 高 灵 敏 度 和 高 选 /
问 题 进 行 探 讨 , 结 出若 干 快 速 建 立 L — / 总 C MS MS分 析 生 物 样 品 的方 法 。
关键词 L — / C MS MS生物 样 品 分析 基 质 效 应
1 前 言
生命 分 析化学 的重 点在 于为生命 科 学研究 提供 高效 、 简便 、 确 的分析手 段 , 求分 析化 学与生 物 、 准 要 生 化等相 关学科 更 加 紧 密地 结 合 ; 生命 分 析 化 学 而 所 面临 的最大挑 战 之 一 , 分 析 工 作 必须 在 极 其 复 是 杂 的样 品基 质 中进 行 _ ; 命 分 析化 学 面 向 的对 象 1生
组 分 的分 析 。如 何 在 如此 复 杂 的基质 中高 灵 敏度 、
质谱条 件 、 流动相 、 品制备 方法 等如何 进行优 化 以 样 减 小基 质效应 、 器 保护 以及 工 作 中 的经 验 等 问题 仪
的探讨 , 总结 出若 干 快 速 、 敏 和可 靠 的 L —MS 灵 C / MS方 法 , 用于快 速分 析生 物样 品 。 可
往往是 成分 、 态 复 杂 的生 物 样 品 , 如 组 织 提 取 形 例
效应 ( ti fet 是 指标 本 中除 分析 物 以外 的其 mar efc) x
他成分 对分 析物 测定 值 的影 响 , 扰 了分 析 方法 准 干
确测定 分析 物 的能 力 。简 单 的说 , 质 效 应就 是 样 基
分 析 , 药 物 代谢 研 究 中得 到广 泛 应 用 。然 而 , 在 如何 更 快 更 好 地 建 立 生 物 样 品分 析 方 法 还 有 待 进 一 步 研 究 。本 文 对
L — / C MS MS分 析 生 物 样 品时 如 何 优 化 质 谱 条 件 和 流 动 相 , 何 制 备 样 品 以减 小 基 质 效 应 , 如 以及 仪 器 维 护 的经 验 等
高选 择性 、 高准确 性 和高通 量地分 析待 测组 分 , 生 是
命分 析化学 急需 解 决 的 重要 问题 。 目前 , 要 有 两 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ主
2优 化 质 谱 分 析 条 件
2 1化 合 物 的 性 质 .
个途径 : 第一 , 取多 种 前 处 理手 段 , 大 限度 除去 采 最 杂质 , 化 基 质 , 样 品 能 够 符 合 分 析 的 要 求 。第 简 使 二, 采用 高选择 性分 析手 段和分 析方 法 , 以实现对 生
21 年第3 00 期
分 析 仪 器
2 5
快 速 建 立 L MS MS分 析 生 物样 品 的方 法 C— /
张 娟 红 王 荣 谢 华 贾 正 平 张 强
( 州 军 区 兰州 总 医 院 临 床 药 理基 地 , 州 , 3 0 0 兰 兰 705)


近年来 , 液相 色谱 质 谱 联 用 技 术 取 得 了较 大 进 展 , 技 术 可对 药 物 及 其 体 内代 谢 产 物 进 行 定 性 、 量 该 定
作者 简 介 :张娟 红 , ,9 5年 出 生 , 士 研 究 生 , 要 从 事 体 内药 物 分 析 研 究 工 作 。E i a go g6 ( 6 .o 女 18 硕 主 mal :w n rn 一9 ̄13 c m
品中 的共流 出物对 待 测 物离 子 化 过 程 的影 响 , 为 分 离 子抑制 和离 子增 强 两种 , 响 了待 测 物 的准 确定 影
量 ] 。
本 文通 过对 生物样 品 L — / C MS MS分 析测 定 中
液 、 液 、 液等 。这 类 样 品不 仅 需要 费 时 、 血 尿 费力 的 前处理 过程 以使其 转 化 为易 分 析 的形态 , 而且 往 往 含有成千 上万 种化 合 物 , 这些 杂质 大 大 干 扰 了待 测
据化合 物 的 p 值 , Ka 有助 于我 们选 择 流 动相 的添加
剂 及其 p 值 , 而提 高质谱 响应 _ ] H 从 8 。同时应 注意 药 物在 体 内的存在 形 式 及 血 浆蛋 白结 合 率数 值 , 以
择性 , 在这 一领域 的应 用 日益 广泛 并趋 于常 规化 [ 。 4 ] 但是 在生物 样 品的分 析 测 定 中 , 质 效应 是 一 个 重 基 要 的影响 因素 , 约 了该 项 技术 的迅 速 发 展 。基 质 制
便 采取适 宜 的预处 理方 法 , 高质谱 响应 值r 。 提 l。 。
2 2 质 谱离 子源 的选择 .
充分 掌 握 离子 源 的 特性 , 据 被 分析 化合 物 的 根
基 金项 目 :国家 科 技 部 重 大 项 目(0 8 X -0 0 4 0 0 20 Z T- 9 1 — 1 )
子作 为定 量反 应 的子 离 子 , 可 以根 据 经 验判 断 选 也 用 哪种离 子源 更为合 适 ; 根据化 合物 的极性 大小 , 可 以选 择一种 或几 种 恰 当 的溶 剂 作 为 溶媒 , 既能 保 证 完全将 样 品溶解 , 能提高 化合 物 的质 谱 响应 ; 根 又 而
物 样品 的定量 分 析 。而上 世 纪 9 O年 代 随着 大 气 压 离 子化 ( C ) 电喷 雾离 子化 ( S) AP I及 E I等接 口技 术 的
首先 了解化 合物性 质 , 化合 物 的结 构 、 性及 对 极 p 值 必须 清楚 。根 据 化 合 物 的结 构 , 以大概 推 Ka 可 断其碎 片离子 的断裂 方 式 , 择 较为 稳 定 的碎 片 离 选
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