PCR直接测序法与ARMS检测非小细胞肺癌EGFR基因突变
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・
３ ２ ８・
临床 与实验病理 学杂志
Ｊ Ｃ ｌ ｉ ｎ Ｅ ｘ ｐ Ｐ ａ ｔ ｈ ｏ ｌ ２ ０ １ ４ Ｍ ａ ｒ ； ３ ０ （ ３ ）
网 络 出版 时 间 ： ２ ０ １ ４— ３—２ ５ １ ３ ： ０ ６ 网络 出版 地 址 ： ｈ ｔ ｔ ｐ ： ／ ／ ｗ ｗ ｗ ． ｃ ｎ ｋ ｉ ． ｎ ｅ ｔ ／ ｋ ｃ ｍ ｓ ／ ｄ ｏ ｉ ／ ｌ Ｏ ． １ ３ ３ １ ５ ／ ｊ ． ｃ ｎ ｋ ｉ ． ｃ ｊ ｃ ｅ ｐ ． ２ ０ １ ４ ． ０ ３ ． ０ ２ ８ ． ｈ ｔ ｍ ｌ
行测序法和 Ａ Ｒ ＭＳ法检测 。其 中 ６ ５例 为 回顾 性病 例 ， 均为
测序法判断为无 突变 者 ； ８ ９例 为前 瞻 性病 例。手术 切 除标 本７ １ 例， 各种活检标本 ７ ９例 ， 包括纤维支气管镜 活检 、 肺穿
刺、 淋巴结活检 、 胸膜活 检等 ； 另 ４例为胸水 。
突变 率 高 。
检测 Ｎ Ｓ Ｃ Ｌ Ｃ
中Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ突变情 况 时 ， Ａ Ｒ ＭＳ法较 直接 测序 法操作 步骤 少 ，
关键词 ： 肺肿瘤 ； 非小 细胞肺 癌 ； 基 因突变 ； 测序 ； 蝎 形探针扩
增 阻滞突变系统
中图分类号 ： Ｒ ７ ３ ４； Ｒ ４ ４ ６ 文 献 标 志码 ： Ｂ 文章编号 ： １ ０ ０ １ — ７ ３ ９ ９ （ ２ ０ １ ４ ） ０ ３—０ ３ ２ ８— ０ ５
Ｐ Ｃ Ｒ直接 测 序 法 与 Ａ Ｒ ＭＳ检 测 ｔ ｉ ｅ ｄ ， 细胞肺癌 Ｅ ＧＦ Ｒ基 因突 变
宿 杰 阿克 苏。 ， 侯英勇 ， 刘亚 岚 ， 徐
摘要 ： 目的
晨 ， 张
新 ， 黄 洁
１ 材 料 与方 法
比较 Ｐ Ｃ Ｒ直 接测序 法 与蝎形 探针 扩增 阻滞 突
变系统 （ ａ ｍｐ ｌ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｒ ｅ ｆ ｒ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ｙ ｍ ｕ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍ，Ａ Ｒ ＭＳ ） 检 测 非小细胞 肺癌 （ ｎ ｏ ｎ — ｓ ｍａ ｌ ｌ ｃ ｅ ｌ ｌ ｌ ｕ ｎ ｇ ｃ ａ ｎ ｃ ｅ ｒ ，Ｎ Ｓ Ｃ Ｌ Ｃ） 中Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ
１ ． １ 一 般资料
选 取复 旦大 学 附属 中 山医院 病理科 ２ ０ １ ０
基 因突变 的敏感性 。方法
突变情况 。结果
用直接测 序发 与 Ａ Ｒ ＭＳ法 同时
年１ ０月 ～２ ０ １ １ 年 ３月行 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ检测 的患者 １ ５ ４例 ， 同时进
检测 １ ５ ４例 Ｎ Ｓ Ｃ Ｌ Ｃ中 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ基 因第 １ ８ 、 １ ９ 、 ２ ０ 、 ２ １外显 子 的 男性 ８ ４例 ， 女性 ７ ０例 ， 年龄 ３ ３～８ ６岁 ， 手术切 除标 本 ７ １例 、 活检 标 本 ７ ９例 ， 其 中鳞 状 细胞 癌 ２ ７ 例、 腺癌 １ ２ １例 、 腺鳞癌 ２例 ； 另 ４例为胸 水。测序 法 ３ ２例 突变 （ ３ ２ ／ １ ５ ４， ２ ０ ． ８ ％） ， Ａ Ｒ ＭＳ法 ５ ２例 突 变 （ ５ ３ ／ １ ５ ４ ， ３ ３ ． ８ ％） 。两种方法均检测到 突变 者 ２ ９例 ， 均无 突变 者 ９ ９例 ，
ｄ ｏ ｉ ： １０ ． １ ３ ３ １ ５ ／ ｊ ． ｃ ｎ ｋ ｉ ． ｃ ｊ ｃ ｅ ｐ ． ２ ０ １ ４ ． ０ ３ ． ０ ２ ８
３ ， 扩增 ２ ０号外显 子 ５ １ ３ ｂ ｐ ； ２ １号上 游引物 ５ 一 Ｇ Ａ Ｇ Ｃ Ｔ ｒ Ｃ Ｔ —
Ｔ Ｃ Ｃ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｔ Ｃ Ｔ ． ３ ． ， 下游 引物 ５ ， ＿ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ｇ Ｃ Ｔ Ｇ Ｇ Ｃ Ｔ Ｇ Ａ Ｃ —
Ｇ Ｃ Ｇ Ｔ Ａ Ａ Ａ Ｃ 一 ３ ， 下游弓 Ｉ 物５ 一 Ａ Ｔ Ｇ Ｇ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ｃ Ｔ Ｇ Ａ Ｔ 兀’ （ 一
直接测序法检测 到突变而 Ａ Ｒ Ｍ Ｓ法 阴性者 ３例 ， 反之 ２ ３例 ，
不一致率 差异有显著性 （ Ｐ＜ ０ ． ０ ０ ０ １ ） 。结论
Ｃ Ｔ Ａ Ａ Ａ Ｇ． ３， ． 扩增 １ １号外显子 １ ９ ９ ｂ ｐ ， 引物 由上海生 物公 司
肺癌是全球病死率较高 的恶性肿 瘤之一。近年 ， 以易瑞 沙（ ｉ ｒ ｅ ｓ ｓ ａ ） 为代 表 的表皮 生长 因 子受 体 酪氨 酸激 酶 抑制 剂
（ Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ — Ｔ Ｋ Ｉ ） 在非小细胞肺 癌 （ ｎ ｏ ｎ — ｓ ｍ ａ ｌ ｌ ｃ ｅ ｌ ｌ ｌ ｕ ｎ ｇ ｃ ｎｃ ａ ｅ ｒ ，
１ ． ２ 直 接 测 序 法 检 测 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ基 因第 １ ８ 、 １ ９ 、 ２ ０ 、 ２ １外 显
子 。从石蜡包埋 组织 或新 鲜 细胞 （ 胸水） 中提取 Ｄ Ｎ Ａ， Ｐ Ｃ Ｒ 扩增 ３ ５个循 环 ， 退火温 度 ６ ２℃。反应 所需 引物序 列如 下 ： 第 １ ８号 上游 引物 ５ 一 Ｇ Ａ Ｇ Ｇ Ｔ Ｇ Ａ ｃ ｃ ｃ Ｔ Ｔ Ｇ Ｔ ｃ Ｔ ｃ Ｔ Ｇ Ｔ Ｇ Ｔ ． ３， ． 下游 引物 ５ 一 Ｃ Ｃ Ｃ Ａ Ａ Ａ Ｃ Ａ Ｃ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ｔ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ｃ Ａ Ａ Ａ 一 ３ ， 特异扩增第 １ ８ 外 显子 ２ ４ ５ ｂ ｐ ； １ ９号 上游 引物 ５ 一 Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ Ａ Ｇ Ｔ Ｙ Ａ Ａ Ｃ Ｇ Ｔ Ｃ Ｔ Ｆ Ｃ Ｃ Ｔ — Ｔ Ｃ Ｔ － ３ ， 下游弓 Ｉ 物 ５ 一 Ｔ Ｇ Ａ Ａ ｃ Ａ ｒ ｒ Ｉ Ｔ Ａ Ｇ Ｇ Ａ Ｔ Ｇ Ｔ Ｇ Ｇ Ａ Ｇ Ａ Ｔ 一 ３ ， 扩 增１ ９号外显子 １ ９ ５ ｂ ｐ ； ２ ０号上游引物 ５ － Ａ ｃ ｒ Ｉ Ｔ Ｉ ’ ｃ Ａ ｃ Ａ Ｇ Ｃ ｃ Ｃ Ｔ —
３ ２ ８・
临床 与实验病理 学杂志
Ｊ Ｃ ｌ ｉ ｎ Ｅ ｘ ｐ Ｐ ａ ｔ ｈ ｏ ｌ ２ ０ １ ４ Ｍ ａ ｒ ； ３ ０ （ ３ ）
网 络 出版 时 间 ： ２ ０ １ ４— ３—２ ５ １ ３ ： ０ ６ 网络 出版 地 址 ： ｈ ｔ ｔ ｐ ： ／ ／ ｗ ｗ ｗ ． ｃ ｎ ｋ ｉ ． ｎ ｅ ｔ ／ ｋ ｃ ｍ ｓ ／ ｄ ｏ ｉ ／ ｌ Ｏ ． １ ３ ３ １ ５ ／ ｊ ． ｃ ｎ ｋ ｉ ． ｃ ｊ ｃ ｅ ｐ ． ２ ０ １ ４ ． ０ ３ ． ０ ２ ８ ． ｈ ｔ ｍ ｌ
行测序法和 Ａ Ｒ ＭＳ法检测 。其 中 ６ ５例 为 回顾 性病 例 ， 均为
测序法判断为无 突变 者 ； ８ ９例 为前 瞻 性病 例。手术 切 除标 本７ １ 例， 各种活检标本 ７ ９例 ， 包括纤维支气管镜 活检 、 肺穿
刺、 淋巴结活检 、 胸膜活 检等 ； 另 ４例为胸水 。
突变 率 高 。
检测 Ｎ Ｓ Ｃ Ｌ Ｃ
中Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ突变情 况 时 ， Ａ Ｒ ＭＳ法较 直接 测序 法操作 步骤 少 ，
关键词 ： 肺肿瘤 ； 非小 细胞肺 癌 ； 基 因突变 ； 测序 ； 蝎 形探针扩
增 阻滞突变系统
中图分类号 ： Ｒ ７ ３ ４； Ｒ ４ ４ ６ 文 献 标 志码 ： Ｂ 文章编号 ： １ ０ ０ １ — ７ ３ ９ ９ （ ２ ０ １ ４ ） ０ ３—０ ３ ２ ８— ０ ５
Ｐ Ｃ Ｒ直接 测 序 法 与 Ａ Ｒ ＭＳ检 测 ｔ ｉ ｅ ｄ ， 细胞肺癌 Ｅ ＧＦ Ｒ基 因突 变
宿 杰 阿克 苏。 ， 侯英勇 ， 刘亚 岚 ， 徐
摘要 ： 目的
晨 ， 张
新 ， 黄 洁
１ 材 料 与方 法
比较 Ｐ Ｃ Ｒ直 接测序 法 与蝎形 探针 扩增 阻滞 突
变系统 （ ａ ｍｐ ｌ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｒ ｅ ｆ ｒ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ｙ ｍ ｕ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍ，Ａ Ｒ ＭＳ ） 检 测 非小细胞 肺癌 （ ｎ ｏ ｎ — ｓ ｍａ ｌ ｌ ｃ ｅ ｌ ｌ ｌ ｕ ｎ ｇ ｃ ａ ｎ ｃ ｅ ｒ ，Ｎ Ｓ Ｃ Ｌ Ｃ） 中Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ
１ ． １ 一 般资料
选 取复 旦大 学 附属 中 山医院 病理科 ２ ０ １ ０
基 因突变 的敏感性 。方法
突变情况 。结果
用直接测 序发 与 Ａ Ｒ ＭＳ法 同时
年１ ０月 ～２ ０ １ １ 年 ３月行 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ检测 的患者 １ ５ ４例 ， 同时进
检测 １ ５ ４例 Ｎ Ｓ Ｃ Ｌ Ｃ中 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ基 因第 １ ８ 、 １ ９ 、 ２ ０ 、 ２ １外显 子 的 男性 ８ ４例 ， 女性 ７ ０例 ， 年龄 ３ ３～８ ６岁 ， 手术切 除标 本 ７ １例 、 活检 标 本 ７ ９例 ， 其 中鳞 状 细胞 癌 ２ ７ 例、 腺癌 １ ２ １例 、 腺鳞癌 ２例 ； 另 ４例为胸 水。测序 法 ３ ２例 突变 （ ３ ２ ／ １ ５ ４， ２ ０ ． ８ ％） ， Ａ Ｒ ＭＳ法 ５ ２例 突 变 （ ５ ３ ／ １ ５ ４ ， ３ ３ ． ８ ％） 。两种方法均检测到 突变 者 ２ ９例 ， 均无 突变 者 ９ ９例 ，
ｄ ｏ ｉ ： １０ ． １ ３ ３ １ ５ ／ ｊ ． ｃ ｎ ｋ ｉ ． ｃ ｊ ｃ ｅ ｐ ． ２ ０ １ ４ ． ０ ３ ． ０ ２ ８
３ ， 扩增 ２ ０号外显 子 ５ １ ３ ｂ ｐ ； ２ １号上 游引物 ５ 一 Ｇ Ａ Ｇ Ｃ Ｔ ｒ Ｃ Ｔ —
Ｔ Ｃ Ｃ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｔ Ｃ Ｔ ． ３ ． ， 下游 引物 ５ ， ＿ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ｇ Ｃ Ｔ Ｇ Ｇ Ｃ Ｔ Ｇ Ａ Ｃ —
Ｇ Ｃ Ｇ Ｔ Ａ Ａ Ａ Ｃ 一 ３ ， 下游弓 Ｉ 物５ 一 Ａ Ｔ Ｇ Ｇ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ｃ Ｔ Ｇ Ａ Ｔ 兀’ （ 一
直接测序法检测 到突变而 Ａ Ｒ Ｍ Ｓ法 阴性者 ３例 ， 反之 ２ ３例 ，
不一致率 差异有显著性 （ Ｐ＜ ０ ． ０ ０ ０ １ ） 。结论
Ｃ Ｔ Ａ Ａ Ａ Ｇ． ３， ． 扩增 １ １号外显子 １ ９ ９ ｂ ｐ ， 引物 由上海生 物公 司
肺癌是全球病死率较高 的恶性肿 瘤之一。近年 ， 以易瑞 沙（ ｉ ｒ ｅ ｓ ｓ ａ ） 为代 表 的表皮 生长 因 子受 体 酪氨 酸激 酶 抑制 剂
（ Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ — Ｔ Ｋ Ｉ ） 在非小细胞肺 癌 （ ｎ ｏ ｎ — ｓ ｍ ａ ｌ ｌ ｃ ｅ ｌ ｌ ｌ ｕ ｎ ｇ ｃ ｎｃ ａ ｅ ｒ ，
１ ． ２ 直 接 测 序 法 检 测 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ基 因第 １ ８ 、 １ ９ 、 ２ ０ 、 ２ １外 显
子 。从石蜡包埋 组织 或新 鲜 细胞 （ 胸水） 中提取 Ｄ Ｎ Ａ， Ｐ Ｃ Ｒ 扩增 ３ ５个循 环 ， 退火温 度 ６ ２℃。反应 所需 引物序 列如 下 ： 第 １ ８号 上游 引物 ５ 一 Ｇ Ａ Ｇ Ｇ Ｔ Ｇ Ａ ｃ ｃ ｃ Ｔ Ｔ Ｇ Ｔ ｃ Ｔ ｃ Ｔ Ｇ Ｔ Ｇ Ｔ ． ３， ． 下游 引物 ５ 一 Ｃ Ｃ Ｃ Ａ Ａ Ａ Ｃ Ａ Ｃ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ｔ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ｃ Ａ Ａ Ａ 一 ３ ， 特异扩增第 １ ８ 外 显子 ２ ４ ５ ｂ ｐ ； １ ９号 上游 引物 ５ 一 Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ Ａ Ｇ Ｔ Ｙ Ａ Ａ Ｃ Ｇ Ｔ Ｃ Ｔ Ｆ Ｃ Ｃ Ｔ — Ｔ Ｃ Ｔ － ３ ， 下游弓 Ｉ 物 ５ 一 Ｔ Ｇ Ａ Ａ ｃ Ａ ｒ ｒ Ｉ Ｔ Ａ Ｇ Ｇ Ａ Ｔ Ｇ Ｔ Ｇ Ｇ Ａ Ｇ Ａ Ｔ 一 ３ ， 扩 增１ ９号外显子 １ ９ ５ ｂ ｐ ； ２ ０号上游引物 ５ － Ａ ｃ ｒ Ｉ Ｔ Ｉ ’ ｃ Ａ ｃ Ａ Ｇ Ｃ ｃ Ｃ Ｔ —