乙型肝炎病毒相关性肝癌患者癌组织中HBx和CEACAM1的表达及其意义

［文章编号］　１６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０４－０７７９－０５［收稿日期］　２０１２－０２－２７［基金项目］　陕西省科技厅自然科学基金资助课题（２００７Ｃ２２０）；陕西省卫生厅科研项目资助课题（２０１０Ｅ１０）［作者简介］　马　莉（１９７９－）女，陕西省西安市人，主治医师，医学硕士，主要从事肝癌的病理基础研究。

［通信作者］　刘凯歌（Ｔｅｌ：０２９－８４２７７５５２，Ｅ－ｍａｉｌ：ｋａｉｇｅｌｉｕ００７＠１６３．ｃｏｍ）乙型肝炎病毒相关性肝癌患者癌组织中ＨＢｘ和ＣＥＡＣＡＭ１的表达及其意义马　莉１，张　蔚２，许刚柱２，姚　杨２，徐　利２，刘凯歌２（１．西安交通大学第二附属医院病理科，陕西西安７１０００４；２．西安医学院第一附属医院消化科，陕西西安７１００７７）［摘　要］　目的：检测乙型肝炎病毒ｘ蛋白（ＨＢｘ）和癌胚抗原相关细胞黏附分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）在乙型肝炎病毒相关性肝癌（乙肝相关性肝癌）组织中的表达，探讨二者在肝癌发生、发展及转移中的关系及意义。

方法：采用免疫组织化学方法（ＳＰ法）检测８１例乙肝相关性肝癌组织中ＨＢｘ和ＣＥＡＣＡＭ１的表达，分析ＨＢｘ和ＣＥＡＣＡＭ１与乙肝相关性肝癌临床病理特征的关系。

Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测人正常肝细胞系ＱＺＧ、肝癌细胞ＨｅｐＧ２及稳定转染ＨＢｘ的肝癌细胞ＨｅｐＧ２（ＨｅｐＧ２－Ｘ）中ＣＥＡＣＡＭ１的表达。

结果：８１例乙肝相关性肝癌组织中ＨＢｘ表达阳性率为７４．０７％（６０／８１），ＣＥＡＣＡＭ１表达阳性率为７１．６０％（５８／８１），二者与门静脉侵袭、淋巴结转移和ＴＮＭ分期有关联（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。

ＨＢｘ与ＣＥＡＣＡＭ１的表达呈负相关（ｒｓ＝－０．３１０，Ｐ＜０．０５）；稳定转染ＨＢｘ的肝癌细胞ＨｅｐＧ２（ＨｅｐＧ２－Ｘ）中，ＣＥＡＣＡＭ１蛋白表达水平与肝癌细胞ＨｅｐＧ２及人正常肝细胞系ＱＺＧ比较显著降低。

结论：ＨＢｘ的高表达和ＣＥＡＣＡＭ１的低表达与乙肝相关性肝癌的侵袭、转移有关联，ＨＢｘ可能通过抑制ＣＥＡＣＡＭ１表达促进肿瘤的发生与发展。

［关键词］　乙型肝炎病毒ｘ蛋白；癌胚抗原相关细胞黏附分子１；乙型肝炎病毒相关性肝癌；肿瘤转移［中图分类号］　Ｒ５１２．６２ ［文献标志码］　ＡＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ＨＢｘ　ａｎｄ　ＣＥＡＣＡＭ１ｉｎ　ＨＢＶ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｓＭＡ　Ｌｉ　１，ＺＨＡＮＧ　Ｗｅｉ　２，ＸＵ　Ｇａｎｇ－ｚｈｕ２，ＹＡＯ　Ｙａｎｇ２，ＸＵ　Ｌｉ　２，ＬＩＵ　Ｋａｉ－ｇｅ２（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｘｉ’ａｎ　Ｊｉａｏ　Ｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ　７１０００４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｘｉ’ａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ　７１００７７，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ　Ｘ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＢｘ）ａｎｄ　ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　１（ＣＥＡＣＡＭ１）ｉｎ　ＨＢＶ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ＨＢｘ　ａｎｄ　ＣＥＡＣＡＭ１ｉｎ　８１ｃａｓｅｓ　ｏｆ　ＨＢＶ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｔｉｓｓｕｅｓｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｗｉｔｈ　ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｅａｔｕｒｅｓ　ｗａｓａｎａｌｙｚｅｄ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ＣＥＡＣＡＭ１ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ＱＺＧ，ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａＨｅｐＧ２ａｎｄ　ＨｅｐＧ２－Ｘ（ＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＨＢｘ）ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ＨＢｘ　ａｎｄ　ＣＥＡＣＡＭ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｉｎ　８１ｃａｓｅｓ　ｏｆ　ＨＢＶ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｗｅｒｅ７４．０７％（６０／８１）ａｎｄ　７１．６０％（５８／８１），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ＨＢｘ　ａｎｄ　ＣＥＡＣＡＭ１ｗｅｒｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈｐｏｒｔａｌ　ｖｅｉｎ　ｉｎｖａｓｉｏｎ，ｎｏｄａｌ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　ＴＮＭ　ｓｔａｇｉｎｇ（Ｐ＜０．０５ｏｒ　Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＨＢｘ　ｗａｓｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＣＥＡＣＡＭ１（ｒｓ＝－０．３１０，Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ　ＣＥＡＣＡＭ１ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ＨｅｐＧ２－Ｘ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ＨｅｐＧ２ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ＱＺＧ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｈｉｇｈ９７７第３８卷　第４期２０１２年７月吉　林　大　学　学　报　（医　学　版）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．４　Ｊｕｌ．２０１２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＨＢｘ　ａｎｄ　ｌｏｗ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＣＥＡＣＡＭ１ａｒｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　ｏｆ　ＨＢＶ－ｒｅｌａｔｅｄｈｅｐａｔｏｃｅｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ａｎｄ　ＨＢｘ　ｍａｙ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ＨＢＶ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｂｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎＣＥＡＣＡＭ１．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＨＢＶ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ　ｘ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｌａｔｅｄｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　１；ｎｅｏｐｌａｓｍ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ 肝细胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＨＣＣ）是我国最常见的恶性肿瘤之一，而乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染是引起肝癌的最主要原因，特别是乙型肝炎病毒基因ｘ开放读框编码的乙型肝炎病毒ｘ蛋白（ＨＢｘ）。

癌胚抗原相关细胞黏附分子１（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ　１，ＣＥＡＣＡＭ１）属于免疫球蛋白超家族基因，具有肿瘤抑制作用，研究发现：ＣＥＡＣＡＭ１在多种恶性肿瘤中的表达普遍降低。

乙型肝炎病毒相关性肝癌（乙肝相关性肝癌）中ＨＢｘ和ＣＥＡＣＡＭ１的关系和作用如何，国内外的相关研究鲜有报道。

本文作者拟通过检测ＨＢｘ和ＣＥＡＣＡＭ１在乙肝相关性肝癌组织和细胞中的表达，探讨其在肝癌发生和发展中的意义。

１　资料与方法１．１　研究对象　８１例乙肝相关性肝癌标本由西安医学院附属医院及第四军医大学西京医院病理科提供，均为２００２年３月—２０１０年３月手术病例，术前未行化疗、放疗及其他辅助治疗。

诊断标准参考中国抗癌协会肝癌专业委员会２００１年９月于广州制定的“原发性肝癌的临床诊断与分期标准”。

人正常肝细胞株ＱＺＧ细胞、肝癌细胞株ＨｅｐＧ２及ＨｅｐＧ２－Ｘ为第四军医大学西京医院肿瘤生物学国家重点实验室保存，其中ＨｅｐＧ２－Ｘ为转染了ＨＢｘ基因的ＨｅｐＧ２细胞。

１．２　试　剂　１００ｍＬ·Ｌ－１小牛血清（杭州四季青生物工程公司）、ＲＰＭＩ１６４０培养基、免疫组织化学ＳＰ试剂盒（北京中杉生物技术公司），鼠抗人ＨＢｘ单克隆抗体（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ公司），兔抗人ＣＥＡＣＡＭ１单克隆抗体（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ公司），β－ａｃｔｉｎ及蛋白Ｍａｒｋｅｒ（Ｓｉｇｍａ公司），ＤＡＢ显色试剂（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司），化学发光法（ＥＣＬ）显色试剂（Ｐｉｅｒｃｅ公司）。

１．３　免疫组织化学检测　组织标本用４０ｇ·Ｌ－１甲醛固定２４ｈ，石蜡包埋，连续切片４μｍ，贴附于预先用１ｇ·Ｌ－１多聚赖氨酸处理的载玻片，６５℃烤片１ｈ，ＳＰ法检测按试剂盒说明书步骤进行，兔抗人ＣＥＡＣＡＭ１ｍＡｂ滴度为１∶２００，鼠抗人ＨＢｘ　ｍＡｂ滴度为１∶４００，以ＰＢＳ代替一抗作为阴性对照，用已知阳性标本作为阳性对照。

ＤＡＢ显色后进行结果判定：阳性反应物为棕黄色颗粒，仅细胞核着蓝色者为阴性，胞膜、胞质或胞核呈棕黄色者为阳性细胞。

随机选取５个视野，根据每个视野中阳性细胞数百分比和染色强弱进行评分：无阳性细胞记０分，阳性细胞数＜２５％记１分，阳性细胞数２５％～５０％记２分，阳性细胞数＞５０％记３分；细胞无显色记０分，呈浅黄色（弱染色）记１分，呈棕黄色（中等染色）记２分，棕褐色（强染色）记３分。

两项相加＞３分记为阳性，≤３分记为阴性。

１．４　细胞培养　人正常肝细胞株ＱＺＧ、肝癌细胞株ＨｅｐＧ２及ＨｅｐＧ２－Ｘ细胞以含体积分数１００ｍＬ·Ｌ－１的新小牛血清和青霉素１００Ｕ·ｍＬ－１、链霉素１００ｍｇ·Ｌ－１的ＲＰＭＩ１６４０培养液，在３７℃、５０ｍＬ·Ｌ－１　ＣＯ２、饱和湿度的培养箱中培养。

１．５　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测蛋白水平　细胞生长达培养皿的７０％～８０％时，冰上操作，４℃的ＰＢＳ洗涤细胞３次，收集细胞，三去污裂解液裂解细胞。

４℃、１４　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，收取上清蛋白，蛋白变性、定量及电泳。