脉冲场凝胶电泳(PFGE)
脉冲场凝胶电泳技术用途
脉冲场凝胶电泳技术用途
脉冲场凝胶电泳技术（Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一种用于分离和分析大分子DNA的技术。
它利用电场在凝胶中引起的不断变化的方向来分离DNA分子，适用于分析大片段DNA，如整个基因组或染色体。
PFGE技术在生物学和医学领域有着广泛的用途，包括但不限于以下几个方面：
1. 研究基因组结构：PFGE技术可以用于分析和研究细菌、真菌、植物和动物等生物的基因组结构，帮助科研人员了解基因组的大小、形态和结构。
2. 分子生物学研究：PFGE技术可以用于分析DNA的大小和构成，例如在基因克隆、DNA 指纹图谱分析、基因组映射等方面有着重要的应用。
3. 疾病研究：PFGE技术可以用于分析病原微生物（如细菌、真菌等）的基因组，帮助研究人员了解病原微生物的遗传特性、毒力因子等，对于疾病的预防、诊断和治疗有着重要的意义。
4. 分子流行病学：PFGE技术可以用于分析病原微生物的遗传特征，帮助研究人员追踪疾病的传播途径和流行病学特征，对于疾病的控制和预防有着重要的作用。
总的来说，PFGE技术在生物学、医学和疾病研究领域有着广泛的应用，可以帮助科研人员深入了解DNA的结构和功能，从而促进基础科学研究和临床医学的发展。
pfge脉冲场凝胶电泳具体操作
pfge脉冲场凝胶电泳具体操作PFGE（Pulsed Field Gel Electrophoresis）是一种高分辨率的凝胶电泳技术，可用于分离和检测大分子量DNA片段。
该技术常用于研究基因组结构、遗传变异和DNA断裂等领域。
下面将详细介绍PFGE的具体操作步骤。
1. 准备DNA样品:a. 从细胞中提取DNA。
可以使用标准的DNA提取方法，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。
b. 用酶切酶或限制酶对DNA进行切割。
选择使DNA在所需大小范围内切割的酶，以便获得所需的DNA片段。
2. 制备凝胶:a. 准备1% - 2% 的琼脂糖溶胶。
将所需琼脂糖加入TE缓冲液中，并在适当的温度下加热搅拌，直到完全溶解。
b. 将琼脂糖溶胶倒入制作凝胶的模具中。
在模具顶部放置梳子以制作凝胶槽，并确保梳子的位置水平。
c. 让凝胶固化。
根据琼脂糖溶胶中指定的温度和时间，将模具放入冰箱或培养箱中，使凝胶完全固化。
3. 负载和电泳样品:a. 准备DNA样品。
将所需比例的DNA标记物和DNA样品混合，并加入适量的加载缓冲液，如Bromophenol Blue。
b. 用吸管吸取混合物，并将其轻轻注入凝胶槽中的样品孔中。
确保尽量避免气泡进入凝胶槽。
c. 启动电泳。
电泳前，确保样品中有足够的时间固定在凝胶上。
启动电源，并将电流设置为所需的值。
4. 设置电泳条件:a. 选择适当的电泳缓冲液。
常用的电泳缓冲液包括TBE缓冲液（三硼酸钠缓冲液）和TAE缓冲液（乙醋酸/三乙酸片性缓冲液）。
b. 设置电泳条件，如电流密度，脉冲时间和频率等。
这些条件可以根据所研究的DNA分子量和所使用的电泳设备进行调整。
5. 进行电泳:a. 启动电泳设备，确保电泳条件设置正确，并在所需时间内运行电泳。
b. 当电泳结束时，关闭电源，并小心地取出凝胶，以免损坏样品。
6. 可选的染色和可视化:a. 将凝胶放入染色缓冲液中，如溴化乙锭溶液，使DNA可被视觉化。
b. 在染色缓冲液中搅拌凝胶，确保各个区域充分染色。
BIO-RAD脉冲场电泳介绍
﹡这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生 物基因组结构的研究。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
PFGE的原理
PFGE的基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变的脉冲电场,其方向 、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改变时,大分子DNA 便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重新定向后,才能继续向前泳 动,DNA分子越大,这种重新定向需要的时间就越长,当DNA分子改 变方向的时间小于脉冲时间时,DNA就可以按照其分子量大小分开, 经EB染色后在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。
一、PFGE在分子分型方面的应用 通过微生物分型可以鉴定菌株是否一致、比较它们的亲缘
关系,对于细菌性传染病的监测、传染源追踪、传播途径的调查 和识别有着非常重要的意义。
传统的微生物分型技术主要是基于表型特性分类,如生化分 型(biotyping)、血清学分型(serotyping)、耐药谱测定(antmi icrobial susceptibility testing)、噬菌体分型(bacterialphage typing) 等。由于微生物易受环境的影响,很容易改变其表达性状,使得表 型分类很不准确。
CHEF-DR III
脉冲场电泳系统的配件
脉冲场电泳（PFGE）的实验流程
Cultured Cells
Unicellular Organisms
Harvest Cells
Tissues
Dissociate
Wash Cell Suspension
Determine Cell Concentration Resuspend to needed Concentration
PFGE实验的标准流程
大肠杆菌0157、沙门菌和痢疾杆菌脉冲场凝胶电泳实验步骤提前准备从检测培养基上挑取单菌落，接种于含5%去纤维蛋白羊血的胰化大豆琼脂（TSA-SB）平板（或相当的培养基）上培养，37℃孵育箱培养14-18小时；用同一个接种针/环,穿刺或接种于小螺帽管中的TSA、HIA或相似培养基，以保证必要时重复检测同一个克隆。
同时接种标准株H9812。
第一天步骤1 细菌的包埋1、打开水浴摇床（54℃）、水浴箱（56℃）。
2、用TE缓冲液（具体试剂配方见附件）制备1%Seakem Gold:1%SDS琼脂糖.以配置25ml体积为例说明,方法如下:1)准确称取0.25g Seakem Gold agarose,放入250ml的蓝盖瓶中.2)加入22.5mlTE缓冲液,轻柔摇荡瓶子使琼脂均匀散开.3)微松盖瓶,将玻璃瓶放入微波炉内搞活加热30秒,取出轻柔摇荡,再次加热30秒,重复操作直至琼脂彻底溶解(无颗粒物、悬浮物、透光均一，无明显异常折光，无气泡)4)将溶解的Seakem Gold agarose放入56℃（55-60℃均可）水浴箱内至少15分钟，再加入预热到56℃的10%SDS溶液2.5ml,置于56℃水浴箱备用.3、在Falcon2054管(或其他相当的管)上标记样品名称和空白对照;在1.5ml微量离心管上标记好对应样品的名称.4、在Falcon2054管中分别加入约2ml细胞悬浊液CSB(配方见附件).注:使用测定细菌浓度的容器不同加入CSB的量也不同.5、用CSB湿润棉签，从培养皿上刮去适量细菌，均与悬浊于CSB中。
通过加入CSB稀释或增加菌量提高浓度，调整细胞悬液浓度至指定范围。
1）用比浊仪（bioMerieux Vitek colorimeter）测其浓度,并调整浓度至4.0-4.5麦氏单位.2）用分光光度计时,在610nm波长吸光度应在1.3-1.4.3）Dade Microscan Turbidity Meter:0.48-0.52(以Falcon2054管测量) 0.68-0.72(以Falcon2057管测量)注:在 4.0-4.5该范围内细菌的浓度都可得到较满意的实验结果,但过大的浓度差距会造成同一块胶上的条带亮度差异,影响条带的识别.6、取400ul细菌悬浊液于相应的1.5ml微量离心管中,置于37℃水浴中孵育5分钟.将剩余的细菌悬浊液置于冰上知道胶块制备完毕.7、从水浴箱中取出微量离心管,没管加入20ul蛋白酶K(储存液浓度20mg/ml)混匀,使其终浓度为0.5 mg/ml,蛋白酶K置于冰上备用.8、加入400ul的1%Seakem Gold:1%SDS到上述装有400ul细菌悬液的微量离心管内,用枪头轻轻混匀,避免有气泡产生.(此时1%Seakem Gold:1%SDS需置于56℃水浴中)9、迅速将混合物加入模具,避免气泡产生,在室温下凝固10-15分钟.为节省时间也可以在4℃下凝固5分钟.10、记录好模具内对应样品的名称。
科室PFGE分析
背景的问题
• • • • • DNA降解 菌量过多 裂解不完全 清洗不足 酶切不完全
谢谢！
PFGE操作及注意事项
金东 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室
PFGE原理与方法
实践表明：长度大于40KB的DNA不能在恒强水平琼脂糖凝胶电泳中 分离。脉冲场凝胶电泳解决了这一难题，该法可以分离长至50MB 的DNA分子。其原理是：DNA分子在交替变换方向的电场中做出反 应的时间取决于它的大小。较小的分子重新定向较快，因而在凝胶 中移动也较快，于是不同大小的分子被成功分离。 DNA分子在交替电场作用下的行为可以用分子的延展性和沿电场 方向平行泳动前的重新定向解释。DNA分子以蠕行（reptation） 方式在琼脂糖凝胶的连续孔洞中迁移。当电场变换方向时，DNA 分子在新的方向泳动前必须再定向。
PFGE是一个操作步骤相对复杂的试 验过程，除了保证相关仪器和耗材 的质量外还需要操作人员的仔细认 真和试验程序的标准化
Excellent gels
1. Gel fills the whole TIFF 2. Wells included on TIFF 3. All bands including the last band of the standard appear on the TIFF 4. The last band of the standard is 1-1.5cm from the bottom of the gel 5. The cell concentration is approximately the same in each lane 6. Clear and distinct bands all the way to the bottom of the gel 7. Straight lane 8. Complete restriction in all lanes 9. Clear backgroud 10.No DNA degradation (no smearing in all lanes)
脉冲场凝胶电泳技术_PFGE_在分子分型中的应用现状_王丽丽
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疾病监测 ２００６ 年 ５ 月 ３１ 日第 ２１ 卷第 ５ 期 Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ， Ｍａｙ．３１，２００６， Ｖｏｌ．２１， Ｎｏ．５
·综 述·
脉冲场凝胶电泳技术（PFGE）在分子分型中的应用现状
王丽丽， 徐建国
关键词： 脉冲场凝胶电泳； 分子分源自； 应用【中 图 分 类 号 】Ｒ－ ３３１
一 ＰＦＧＥ 方法原理
ＰＦＧＥ 以 其 重 复 性 好 ， 分 辨 力 强 而 被 誉 为 细 菌 分子生物学分型技术的＂金标准＂。它可以用于大 分 子 ＤＮＡ 的 分 离 ， 其 分 辨 范 围 达 到 １０ Ｍｂ。 而 普 通 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 仅 能 分 离 小 于 ５０ ０ ｋｂ 的 ＤＮＡ 分 子 。ＰＦＧＥ 的 基 本 原 理 是 通 过 电 场 的 不 断 改 变 ， 使 包 埋 在 琼 脂 糖 凝 胶 中 的 ＤＮＡ 分 子 的 泳 动 方 向 做 相 应 改 变 ， 小 的 ＤＮＡ 分 子 比 大 的 变 化 快 ，
PFGE原理及参数设置
金东 2010年6月
PFGE原理及相关参数
PFGE原理及相关参数
超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同 速率迁移。大于该极限长度后DNA的迁移速度几乎与分子 大小无关。当DNA分子的有效直径超过凝胶孔径时，卷曲 的DNA分子在电场作用下会沿电场方向拉伸变形挤过筛孔， 凝胶介质的分子筛效应不明显，此时DNA分子在电场中的 迁移速度主要取决于电场强度。 有实验证明长度大于40KB的DNA分子不能在恒强水平琼脂 糖凝胶电泳中分离。
PFGE操作基本流程
PFGE操作的基本流程—革兰氏阴性菌
PFGE操作的基本流程
相对于容易破壁 的革兰氏阴性菌， 革兰氏阳性菌通 常需要使用溶菌 酶或者是其他试 剂对其进行预先 处理。
PFGE聚类分析原则
TENOVER原则与聚类分析
不同研究者对于同样的PFGE带型会有完全不同的解 释，对于这些菌株是否属于暴发相关或者暴发不相关 的菌株也会有完全不同的意见，对于PFGE带型上条 带的差异也有不同的解释。 TENOVER原则是在没有使用软件进行分析的时候 PFGE带型解释方法。这个标准对于临床实验室分析
缓冲液的缓冲能力以及长电泳时间中液体的损耗问题。
通常用于脉冲场凝胶电泳的电泳缓冲液包括两种 0.5XTBE和1XTAE，其中1XTAE常用于MB级的DNA片 断的分离（>3MB），而0.5XTBE常用于<1MB的片断
的分离。
电泳温度
脉冲场凝胶电泳通过冷凝以及循环系统实现对电泳缓冲液
的温度控制。
当缓冲液的温度越高，电泳所需要的时间也就越短。但是， 较高的温度会造成条带弥散，影响分辨率。
PFGE作为暴发菌株的鉴定是一种有效的方法，然而 一旦收集菌株的时间跨度超过三到六个月，分型研究 就转化为种群研究。而另外一些技术，如MLST，主 要用于监测微生物种群随时间的变化。管家基因的突 变是中性突变，不受环境选择压力的影响。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一
种常用于分析测定大分子量DNA分子种类、外源DNA同源度、DNA长度等
实验的灵敏度相当高的一种电泳技术。
该技术是利用 DNA 分子在脉冲场
条件下的电泳运动，将不同类型的 DNA 集合体根据其分子质量分离而得
到细菌的 DNA 指纹图谱，从而用于基因检测、基因定位、系统发育研究、菌种识别、菌群分析、植物起源及食品安全检测等领域。
其实验原理是在
原电泳的基础上，增加了两个梯度磁场，形成脉冲场条件下，DNA 分子会
从均匀电荷有序分布转变为非均匀电荷分布，在脉冲场条件下，它会产生
不均匀向偏冲，从而实现对 DNA 集合体的分离，再加上同时对 DNA 分子
进行大量的微量操纵，有效的分离了DNA分子，使它们能够产生端粒酶消
化片段，最终可以经过比较求得大分子量DNA分子种类，外源DNA同源度、DNA长度等实验结果。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis ，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA 序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。
电泳结果通常是条带图谱。
该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。
通过分型可以鉴定比较菌株是否一致， 对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。
一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE 与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA 分子经凝胶的分子筛作用由负极移向正极。
而PFGE 采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA 分子的电泳方向随着电场的变化而改变。
正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA 得以分离。
图l 是根据Carle 和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1field gel electrophoresis ，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。
A 、B 代表两个交替开启和关闭的电场。
当A 电场开启时，B 电场关闭，DNA 分子从A 电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B 电场开启时，DNA 分子改变原来的运行方向，随B 电场由负极向正极移动。
这样，随着电场方向的交替变化DNA 分子 即呈“Z” 字形向前移动。
目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA 分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。
如果电场方向改变 DNA 分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。
这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA 分子必须相应地变化移动方向。
可以想象， 较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulse Field Gel Electrophoresis, PFGE），是一种通过交替改
变电场方向和大小等参数，使得大分子DNA在凝胶中得到更好的分离的电泳技术。
该技术
主要依靠电场对DNA分子的移动与定向拉伸，通过一系列的脉冲场控制形成脉冲态运动，
使DNA分子得到更广泛的电泳分离。
在经过凝胶电泳之后，得到的分离图谱呈现出一组带状分布的DNA分子，每条带都代
表着分子的大小。
DNA分子越大，迁移的速率就越慢，因此大的分子在凝胶上迁移的距离
要比小的分子短。
这个技术被广泛应用于基因编辑、基因检测和病原体的快速分型等领域。
实验中，将DNA分子高压加在凝胶中，通过影响电场的大小和方向，脉冲场凝胶电泳
可以将DNA分子拉伸成一系列不同长度的线条。
接下来应该是经过染色或者转移等方法，
对凝胶进行图像处理，得到DNA分子的带状图谱。
带状图谱中，每一条带代表一个不同的DNA分子长度，因此可以确定DNA的大小。
根据带的数量、大小和密度等参数，可以进一
步区分样品中不同的DNA分子。
需要注意的是，PFGE并不能很好地分离具有相同长度的DNA分子，因为它们将聚集成一个带状图。
但总的来说，PFGE是一种用于高分辨率DNA分离的强大工具，已被广泛用于研究多种生物学和医学问题，例如：身份鉴定、结构基因组学、基因突变分析等。
脉冲场凝胶电泳技术
5、 把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。 如果用的是10个齿的梳子，把标准菌株H9812加在 第1、5、10个齿上。 6、 用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在 室温下风干约3分钟。 7、 把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上， 并且胶块与胶槽的底面相接触。从胶槽的下部中央 缓慢到入100ml熔化的在55℃－60℃平衡的1％ SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在 室温下凝固30分钟左右。 8、 记录加样顺序。
多余的部分。
5、 保证胶块在液面下而不在管壁上。
6、 将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速
约170转/分钟。
7、 将纯水和TE放在50℃水浴摇床中预热。
三、洗胶块 1、 从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的 screened-cap。轻轻倒掉CLB。在实验台上轻磕管 底使胶块落在管底。 2、 每管中加入15ml预热的纯水。 3、 确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回 50℃水浴摇床中，摇10分钟。 4、 倒掉水，用纯水再洗一次。 5、 倒掉水，加入15ml预热的TE，在50℃的水浴 摇床中摇15分钟。 6、 倒掉TE，用TE重复洗三次，每次10－15分钟。 7、 倒掉TE，加入10ml TE，放在4℃冰箱保存备 用。
四、胶块内DNA的酶切 1、 在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及 H9812的名称。 2、 按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液，混匀。 试剂 µl/胶块 µl /10胶块 纯水 180µl 1800µl Buffer D 20µl 200µl 总体积 200µl 2000µl 注意：缓冲液要置于冰上。
调整至3.6~4.5。如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果
PFGE原理及参数设置..
影响分辨率的因素
影响分辨率的因素包括：脉冲时间、电场夹角、电场强度、 电影温度、缓冲液以及电泳时间等。在脉冲场凝胶电泳中 通常包括脉冲时间、电场强度、温度、缓冲液组成、琼脂 糖类型和浓度以及电场夹角等参数而只是改变脉冲时间来 控制分辨样品的范围，即通过增加脉冲时间分离较大分子， 减少脉冲时间来分离较小分子。
大部分基于CHEF脉冲场凝胶电泳系统的操作手册使用 的电场夹角为120度。
电场角度
120 °
2.2 Mb 1.6 Mb
105 °
100 °
96°
94° 随着电场角度的减 少，两个大片段分 的更开。但是同时 小片段也在逐渐的 压缩。所以为了兼 顾不同大小的片段 需要选择一个合适 的电场角度。
大部分基于CHEF脉冲场凝胶电泳系统的操作手册使用的电场夹角为120。
脉冲时间
脉冲时间是指电场在某个角度持续的时间。
例如：脉冲时间为30s，即电场方向将会在30s变换一次。脉冲时
间是脉冲场电泳的核心参数。通常实验中使用的脉冲时间为一个范 围值如：2－20S。这样是为了使一定范围内的DNA片段都可以得 到理想的分离。这种脉冲时间的变换可以是线性的或者是非线性的。 线性是指脉冲时间在一定的电泳时间内是均匀变换的；而非线性的 变换可以使一定的脉冲时间相对集中，从而使相应大小的片断得到 更好的分离。
PFGE原理及相关参数
目前常用的脉冲场凝胶电泳仪器为箝位匀强电场系统（contour-clamped homogeneous electric field, CHEF）
方框代表琼脂糖凝胶，一排长方形小框代表DNA加样孔，六边形代表CHEF系 统的电极（4X6）。当电泳工作时，DNA分子以箭头方向迁移。
通常使用的缓冲液的温度为12℃－15℃。在这个温度内
脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA一般长度超过20kb，在某些情况下，超过40kb在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10〜2000kb之间的DNA片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显着地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE 设备能把大小范围在10〜2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris ，pH7.5；0.15mol/LNaCl ；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris ，pH7.5；lmol/L NaCl ；0.5%4ESP缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，Img/mL蛋白酶K。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
7 胶模( 由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。
90.5匕g/mL溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。
浅谈PFGE实验及注意问题
浅谈 PFGE实验及注意问题山东济南章丘 250200摘要：目的为达到 PulseNet China 网络实验室监测技术能力标准化和规范化，实现数据有效传输和分析，要求PFGE实验完成的图像要符合质量标准。
方法按照国家疾控中心出台的标准操作规程及结合各网络实验室开展实验以来积累的操作经验。
结果 PFGE实验按操作规程认真、仔细操作，完成的图像就能够达到质量标准。
关键词：PFGE实验；操作规程；注意问题中图分类号：R-331 文献标识码：BPFGE（Pulsed Field Gel Electrophoresis）即脉冲场凝胶电泳。
为达到PulseNet China 网络实验室监测技术能力标准化和规范化，实现数据有效传输和分析，要求PFGE实验完成的图像要符合质量标准。
PFGE实验操作步骤繁杂，耗费时间长，要取得标准的分子分型条带，每一步骤均得按操作规程认真操作，同时还得结合操作经验。
PFGE实验主要包括以下步骤：实验前准备工作；细菌培养；制备小胶块；胶块裂解；胶块清洗；酶切；电泳；染色、脱色，读胶成像，现将每一步操作及注意问题简述如下。
1.PFGE实验前准备工作。
1.1制备灭菌纯水：实验用水为水质达到 18.2M 欧的纯水。
所用耗材高压灭菌：配置试剂用螺口瓶，小试管，量筒，枪头。
1.2配制试验用试剂：严格按照操作规程进行配制。
所用试剂有Tris:EDTA Buffer (TE), pH 8.0；Cell Suspension Buffer (CSB)；Cell Lysis Buffer （CLB）；0.5×TBE Buffer；琼脂糖凝胶块(1%SeaKem Gold，以TE 配制)；电泳胶(1% SeaKem Gold，以0.5×TB E 配制)。
1.细菌培养。
2.1如果是冷冻保存的菌株，要复苏后再转种一次，保持该菌株的活力。
PFGE实验用菌株要求在该菌株最佳培养条件下培养14-18小时。
PFGE原理及注意事项
脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis ,PFGE)是通过脉冲电场方向、时间与电流大小交替改变完成分离大分子DNA。
PFGE注意事项：：蠕动泵的流速：电泳过程中，控制好蠕动泵的流速，一般控制在50-70左右，以免速度太快，使胶在溶液中移动。
冷却泵的开启：冷却泵开启时，一定要把蠕动泵打开，以避免冷却泵管道内的溶液因为过度制冷，凝结成冰块而堵塞管道。
电泳结束后，应及时取出凝胶，进行染色等操作，以避免因为时间太长，而造成条带的弥散。
脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理大致为:细菌包埋于琼脂块中,用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切,酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。
PFGE中内切酶的选用至关重要,所采用的内切酶常为寡切点酶(low frequency cleavage restriction endonucleases),这种酶切后的片段少而大,适合于作PFGE电泳。
McClelland等[8]通过对细菌的PFGE电泳图谱的内切酶的选择研究发现,四核苷酸CTAG在许多GC含量>45%的细菌染色体中是很少见的,在他们所试验的16个细菌的染色体中,被1个或多个可识别CTAG位点的内切酶酶切,每100000ｂｐｓ中不到一次,这些酶的识别序列分别为:XbaI(TCTAGA), SepI(ACTAGT),AvrII(CCTAGG)和NheI(GCTAGC)。
同样地,在许多含Ｇ+Ｃ<45%的基因组,CCG和CGG更少。
这样用SmaI(CCCGGG)、RsrII(CGGWCCG)、NaeI(GCCGGC)和SacII(CCGCGG)进行酶切,对产生平均超过100000bps片段是非常合适的。
对PFGE结果的观察,可因不同研究者而出现较大差异,据此,Tenover 等[6]经过多年的研究提出了PFGE的解释标准:(1)相同(indistinguishable):酶切图谱间有同样的条带数,且相应条带大小相同,流行病学上则认为相同,这种经PFGE证实的结果,用其它方法检测不可能显示实质性的差异。
脉冲场凝胶电泳技术及其在细菌感染性疾病中的应用分析
脉冲场凝胶电泳技术及其在细菌感染性疾病中的应用分析在细菌的相关研究中，比如其流行特征、追踪传染源等，有多种方式可以实现。
其中应用比较广泛的方法是将菌株分型，以此来得到同源性关系。
具体来说，脉冲场凝胶电泳技术是实现基因分型的一种最为常用的方法，该方法得到的结果的重复性和分辨率都是非常好的，很多相关的研究人员都会采用该种方式来研究细菌感染性疾病的相关知识。
本文对脉冲场凝胶电泳技术的应用进行相关分析和探究，具体内容如下。
1 原理脉冲场凝胶电泳技术也称为PFGE技术，该技术是在1984年被美国科学家提出的。
PFGE技术主要是通过限制性核算内切酶可以将DNA实现消化，最终可以产生多个有限的，并且各段长度都不一样的DNA片段，一般来说，片段数量通常在5到20之间。
之后便可以采用常用的电泳方式实现分离。
根据跟李的电泳条带图谱，可以正确地判断细菌的种类。
基于以上原理，PFGE技术可以很好地反应细菌所有基因组的情况，包括一些细微的地位，这将对细菌的相关研究具有非常有利的影响。
2 结果判断如果在图片条带上的大小以及出现的数量都是相同的，则可以认为其型别是相同的。
如果在所有的图片条带中，有两个或者三个是有所差别的，则可以认为其亲缘关系是较为密切的。
如果在所有的图片条带中，有四到六个是有所大的，则可以认为它们之间有可能会存在亲缘关系。
而如果在所有的图片条带中出现了大于等于七个有所差异的条带，则认为两者之间不存在任何的亲缘关系。
考虑到细菌间的变异特性，将85%作为判断相关的标准。
3 主要影响因素第一，是缓冲液温度。
缓冲液的温度会产生一定的影响。
这是因为缓冲液的温度越高，那么电泳对应的速度是越快的，这就使得整个的时间变得更短，这会导致条带的分辨率变得较低，不能很好得进行识别。
在缓冲液温度较低的情况下，对应的电泳所需要的时间就会变得越长，会让条带更好地进行分辨，通常将温度维持在14度左右，第二，是脉冲的角度。
脉冲的角度也会对结果产生一定的影响。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。
电泳结果通常是条带图谱。
该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。
通过分型可以鉴定比较菌株是否一致，对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。
一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA分子经凝胶的分子筛作用负极移向正极。
而PFGE采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随着电场的变化而改变。
正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA得以分离。
图l是根据Carle和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1 field gel electrophoresis，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。
A、B代表两个交替开启和关闭的电场。
当A电场开启时，B电场关闭，DNA分子从A电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B电场开启时，DNA分子改变原来的运行方向，随B电场负极向正极移动。
这样，随着电场方向的交替变化DNA分子图1 PGE的原理(OFAGE系统) A、B代表两电场即呈“Z” 字形向前移动。
目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。
如果电场方向改变DNA分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。
这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA分子必须相应地变化移动方向。
可以想象，较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。
pfge原理
pfge原理PFGE原理是一种分子生物学技术，全称为脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis），它是一种分离和分析DNA片段的方法，可以将大片段的DNA分子从凝胶中分离出来，从而进行电泳分析。
1. 原理PFGE的原理在于凝胶中应用交错电场，使DNA的运动方向变化，从而使大分子量DNA可以被更好的分离。
首先，DNA被切成片段，并在凝胶中进行电泳分离。
PFGE所采用的凝胶是一种“交错”的凝胶，即在不同方向上阻碍电泳运动的纤维素。
在电场中，DNA分子因为其大小、形状和电荷密度不同而负载不同的电荷，向着凝胶的两个端点移动。
在PFGE过程中，电场方向会不断改变，这种改变可以使大分子量DNA分子在不同方向上进行运动。
一次分离过程通常持续16小时以上。
2. 应用PFGE技术是目前常用的DNA分子分离技术之一，其应用范围广泛，主要用于以下领域：（1）遗传学研究：PFGE技术可以帮助了解基因组结构和动态变化，尤其是在菌群的基因组研究中，PFGE技术具有重要作用。
（2）食品安全检测：PFGE技术可以用于食品安全检测，例如细菌的分离和鉴定，食品中微生物的种类、数量及分布等的研究。
（3）医学研究：PFGE技术在医学领域中有广泛应用，比如可以用来检测癌症等重大疾病，检测病原体和细菌的快速鉴定等。
3. 优势相较于常规的DNA电泳，PFGE技术有以下几点优势：（1）可以分离大分子量的DNA分子，比如细菌的染色体DNA。
（2）可以提高DNA分离的分辨率，从而更准确地分析DNA的结构和变异情况。
（3）PFGE的原理可以单独分离DNA分子，使处理比较麻烦的DNA成为可能，比如重复序列等。
总之，PFGE技术在现代生命科学中已经成为了不可或缺的基础技术之一。
通过PFGE技术，我们可以更好地理解细胞DNA的组成和结构，同时对食品和医学工作中的研究也有着巨大的帮助作用。
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普通凝胶电 泳
PFGE
二、PFGE在分子生物学中的应用
在普通的凝胶电泳中，大于10kb的 DNA分子移动速度接近，很难分离形成足 以区分的条带。脉冲场凝胶电泳可以用来 分离大小从10kb到10Mb的DNA分子 。主 要用于基因组DNDR-II脉冲场电泳 仪
脉冲场凝胶电泳
报告人：吉尚雷 2013-03-13
一、原理
常规的电泳采用的是单一的均匀电 场，DNA分子经凝胶的分子筛作用由负 极移向正极。而脉冲场凝胶电泳(Pulse dfield gel electrophoresis，PFGE) 采用 了两个交变电场，即两个电场交替地 开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随 着电场的变化而改变。电场方向的交 替改变使大分子DNA得以分离。
伯乐CHEF Maмын сангаасFGE电泳实验过程
胶块的制备
1、取肌肉组织、研磨过滤、细胞计数。 2、将细胞与低熔点琼脂糖混合后加入凝胶模 具中，待凝固后取出。 3、用含有蛋白酶K的裂解液将胶块内的细胞 裂解，释放出DNA. 4，用苯甲基磺酰胺（PMSF）去除蛋白酶K。 5、存贮于0.5M EDTA中半年无降解。
1 PFGE是公认的比较繁琐耗时的技术。一次电泳至少需 要两天时间。 2 电泳带型易受人为等多种因素的影响，需要较高的技 术水平。 3 不能同时优化胶的每个部分的条带分布。 4 不能确切地认为相同大小的条带就是相同的DNA片段。 5 一个酶切位点的变化可能引起不止一个条带的变化。 6 PFGE分型技术在大肠杆菌O157：H7等细菌的分子生 物学分析中得到了广泛的应用。但有些菌种用PFGE是 不可分的。研究人员发现对于有广泛基因重组现象的 细菌，PFGE并不是一个适宜的分子分型工具。
1%的琼脂糖浓度最大可以分离3Mb的DNA 片段 0.5-0.9%的琼脂糖浓度可以分离片段更大的 DNA片段，不过条带很弥散
2.缓冲液的种类、浓度和温度的影响 缓冲液中的离子浓度越低，电泳跑得越快。 Buffer缓冲液的温度影响整个电泳时间和结 果，缓冲液的温度越低，电泳跑的越慢，得 到的条带越细直，结果越理想.目前认为14℃ 能得到最好的电泳带型。
最常用的电泳液是 0.5x的TBE buffer， 有时也可以用1.0x的TAE buffer代替。缓
冲液体积不得少于2.2 L
3.脉冲角度、时间、电压梯度
电泳角度： 使用较小的角度，可以把电泳时间减少50 ％ ,较大的片段分离的更理想，但较小的片段分离效果 降低 。因此要根据分离片段大小来调整脉冲角度。 脉冲时间 ：脉冲时间就是电极在单一方向改变所需要的 时间，如30s的脉冲时间即为电极在单一方向受脉冲作 用30s，然后在另一个方向作用30s。为了分离小片段 的样本，通常减小脉冲时间；为了分离大片段的样本， 通常增大脉冲时间。 电压：850 kb左右的DNA片段，6 V／cm的电压梯度最 宜； 大于3 Mb的DNA片段，1.5～3 V／cm电压梯度最 宜；
谢谢！！！
制胶过程模拟图
胶块上样模拟图
拆卸凝胶槽，小心取出凝胶，放在电泳槽中 适当位置。调节脉冲场电泳参数，4V/cm、 脉冲时间1-40s, 14℃ 电泳18h，泵 70。
将电泳完的凝胶用EB染色20min， 清水漂洗20min，置凝胶成像系统 中检测
四、影响PFGE的因素
1.琼脂糖凝胶浓度
低熔点琼脂糖是经过羟乙基化修饰的琼 脂糖，30℃左右成胶，熔点是65℃。熔化 温度低于大多数双链DNA熔点。这种性质可 以从凝胶中回收天然形式的DNA
4.制冷系统以及泵的流速等
蠕动泵的流速：一般控制在50-70左右，以免速度 太快，使胶在溶液中移动。
冷却泵的开启：冷却泵开启时，一定要把蠕动泵打 开，以避免冷却泵管道内的溶液因为过度制冷，凝 结成冰块而堵塞管道。
电泳结束后，应及时取出凝胶，进行染色等操作， 以避免因为时间太长，而造成条带的弥散。
五、PFGE方法的局限和不足