脉冲场凝胶电泳(PFGE)

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4.制冷系统以及泵的流速等
蠕动泵的流速：一般控制在50-70左右，以免速度 太快，使胶在溶液ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ移动。
冷却泵的开启：冷却泵开启时，一定要把蠕动泵打 开，以避免冷却泵管道内的溶液因为过度制冷，凝 结成冰块而堵塞管道。
电泳结束后，应及时取出凝胶，进行染色等操作， 以避免因为时间太长，而造成条带的弥散。
五、PFGE方法的局限和不足
1 PFGE是公认的比较繁琐耗时的技术。一次电泳至少需 要两天时间。 2 电泳带型易受人为等多种因素的影响，需要较高的技 术水平。 3 不能同时优化胶的每个部分的条带分布。 4 不能确切地认为相同大小的条带就是相同的DNA片段。 5 一个酶切位点的变化可能引起不止一个条带的变化。 6 PFGE分型技术在大肠杆菌O157：H7等细菌的分子生 物学分析中得到了广泛的应用。但有些菌种用PFGE是 不可分的。研究人员发现对于有广泛基因重组现象的 细菌，PFGE并不是一个适宜的分子分型工具。
脉冲场凝胶电泳
报告人：吉尚雷 2013-03-13
一、原理
常规的电泳采用的是单一的均匀电 场，DNA分子经凝胶的分子筛作用由负 极移向正极。而脉冲场凝胶电泳(Pulse dfield gel electrophoresis，PFGE) 采用 了两个交变电场，即两个电场交替地 开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随 着电场的变化而改变。电场方向的交 替改变使大分子DNA得以分离。
普通凝胶电 泳
PFGE
二、PFGE在分子生物学中的应用
在普通的凝胶电泳中，大于10kb的 DNA分子移动速度接近，很难分离形成足 以区分的条带。脉冲场凝胶电泳可以用来 分离大小从10kb到10Mb的DNA分子 。主 要用于基因组DNA的分离，流行病学分析 等方面. DNA文库的构建 细菌分型
伯乐 CHEF DR-II脉冲场电泳 仪
最常用的电泳液是 0.5x的TBE buffer， 有时也可以用1.0x的TAE buffer代替。缓
冲液体积不得少于2.2 L
3.脉冲角度、时间、电压梯度
电泳角度： 使用较小的角度，可以把电泳时间减少50 ％ ,较大的片段分离的更理想，但较小的片段分离效果 降低 。因此要根据分离片段大小来调整脉冲角度。 脉冲时间 ：脉冲时间就是电极在单一方向改变所需要的 时间，如30s的脉冲时间即为电极在单一方向受脉冲作 用30s，然后在另一个方向作用30s。为了分离小片段 的样本，通常减小脉冲时间；为了分离大片段的样本， 通常增大脉冲时间。 电压：850 kb左右的DNA片段，6 V／cm的电压梯度最 宜； 大于3 Mb的DNA片段，1.5～3 V／cm电压梯度最 宜；
伯乐CHEF Mapper XA脉冲场电泳仪
BAC文库的建立示意图
三、PFGE电泳实验过程
胶块的制备
1、取肌肉组织、研磨过滤、细胞计数。 2、将细胞与低熔点琼脂糖混合后加入凝胶模 具中，待凝固后取出。 3、用含有蛋白酶K的裂解液将胶块内的细胞 裂解，释放出DNA. 4，用苯甲基磺酰胺（PMSF）去除蛋白酶K。 5、存贮于0.5M EDTA中半年无降解。
制胶过程模拟图
胶块上样模拟图
拆卸凝胶槽，小心取出凝胶，放在电泳槽中 适当位置。调节脉冲场电泳参数，4V/cm、 脉冲时间1-40s, 14℃ 电泳18h，泵 70。
将电泳完的凝胶用EB染色20min， 清水漂洗20min，置凝胶成像系统 中检测
四、影响PFGE的因素
1.琼脂糖凝胶浓度
低熔点琼脂糖是经过羟乙基化修饰的琼 脂糖，30℃左右成胶，熔点是65℃。熔化 温度低于大多数双链DNA熔点。这种性质可 以从凝胶中回收天然形式的DNA
1%的琼脂糖浓度最大可以分离3Mb的DNA 片段 0.5-0.9%的琼脂糖浓度可以分离片段更大的 DNA片段，不过条带很弥散
2.缓冲液的种类、浓度和温度的影响 缓冲液中的离子浓度越低，电泳跑得越快。 Buffer缓冲液的温度影响整个电泳时间和结 果，缓冲液的温度越低，电泳跑的越慢，得 到的条带越细直，结果越理想.目前认为14℃ 能得到最好的电泳带型。