脉冲场凝胶电泳

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pfge脉冲场凝胶电泳具体操作

PFGE（Pulsed Field Gel Electrophoresis）是一种高分辨率的凝胶电泳

技术，可用于分离和检测大分子量DNA片段。该技术常用于研究基因组结构、遗

传变异和DNA断裂等领域。下面将详细介绍PFGE的具体操作步骤。

1. 准备DNA样品:

a. 从细胞中提取DNA。可以使用标准的DNA提取方法，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。

b. 用酶切酶或限制酶对DNA进行切割。选择使DNA在所需大小范围内切割的酶，以便获得所需的DNA片段。

2. 制备凝胶:

a. 准备1% - 2% 的琼脂糖溶胶。将所需琼脂糖加入TE缓冲液中，并在适当

的温度下加热搅拌，直到完全溶解。

b. 将琼脂糖溶胶倒入制作凝胶的模具中。在模具顶部放置梳子以制作凝胶槽，并确保梳子的位置水平。

c. 让凝胶固化。根据琼脂糖溶胶中指定的温度和时间，将模具放入冰箱或培

养箱中，使凝胶完全固化。

3. 负载和电泳样品:

a. 准备DNA样品。将所需比例的DNA标记物和DNA样品混合，并加入适量的

加载缓冲液，如Bromophenol Blue。

b. 用吸管吸取混合物，并将其轻轻注入凝胶槽中的样品孔中。确保尽量避免

气泡进入凝胶槽。

c. 启动电泳。电泳前，确保样品中有足够的时间固定在凝胶上。启动电源，

并将电流设置为所需的值。

4. 设置电泳条件:

a. 选择适当的电泳缓冲液。常用的电泳缓冲液包括TBE缓冲液（三硼酸钠缓

冲液）和TAE缓冲液（乙醋酸/三乙酸片性缓冲液）。

b. 设置电泳条件，如电流密度，脉冲时间和频率等。这些条件可以根据所研究的DNA分子量和所使用的电泳设备进行调整。

脉冲场凝胶电泳技术用途

脉冲场凝胶电泳技术（Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一种用于分离和分析大分子DNA的技术。它利用电场在凝胶中引起的不断变化的方向来分离DNA分子，适用于分析大片段DNA，如整个基因组或染色体。

PFGE技术在生物学和医学领域有着广泛的用途，包括但不限于以下几个方面：

1. 研究基因组结构：PFGE技术可以用于分析和研究细菌、真菌、植物和动物等生物的基因组结构，帮助科研人员了解基因组的大小、形态和结构。

2. 分子生物学研究：PFGE技术可以用于分析DNA的大小和构成，例如在基因克隆、DNA 指纹图谱分析、基因组映射等方面有着重要的应用。

3. 疾病研究：PFGE技术可以用于分析病原微生物（如细菌、真菌等）的基因组，帮助研究人员了解病原微生物的遗传特性、毒力因子等，对于疾病的预防、诊断和治疗有着重要的意义。

4. 分子流行病学：PFGE技术可以用于分析病原微生物的遗传特征，帮助研究人员追踪疾病的传播途径和流行病学特征，对于疾病的控制和预防有着重要的作用。

总的来说，PFGE技术在生物学、医学和疾病研究领域有着广泛的应用，可以帮助科研人员深入了解DNA的结构和功能，从而促进基础科学研究和临床医学的发展。

脉冲场凝胶电泳的原理

缓冲液和温度
温度越高，DNA移动速度越快，但是条带的清晰度和分辨力明显下降。温度过高会导致 DNA带变形或解链。
最佳电泳温度是14 ℃
最常用的电泳液是 0.5x的TBE buffer，有时也可以用1.0x的TAE buffer代替
脉冲时间
当电场方向发生改变, 大分子的DNA 便滞留在胶孔中, 直至沿新的电场重新定向后, 才能继续向前移动,大分子DNA 重新定向需要的时间长
脉冲场凝胶电泳 (Pulsed Field Gel Electrophoresis ,PFGE)
用于分离大分子量DNA 片段的一种电泳方法。
PFGE 是通过脉冲电场方向、时间与电流大小交替改变完成分离大分子DNA。
影响PFGE的因素琼脂糖凝胶浓度
浓度越高，移动速度越慢，适合分离低分子量DNA 浓度越低，移动速度越快，适合分离高分子量DNA 1%的琼脂糖浓度最大可以分离3Mb的DNA片段 1.2–1.5%的琼脂来自百度文库浓度可以使片段更加紧密 0.5-0.9%的琼脂糖浓度可以分离片段更大的DNA片段，不过条带很弥散
可能遇到的问题以及解决方法
凝胶在缓冲液中漂浮---蠕动泵的速度太快或太慢，请调到合适的速度。
缓冲液不流动或流速慢---检查冷却泵：当冷却泵制冷时，如果蠕动泵没有开，会造成管道内结冰，导致管道堵塞。

脉冲场凝胶电泳分离技术

在生物学、医学、环境科学等领域广泛应用，它针对DNA、RNA和蛋白质等生物大分子的高分辨率分离和分析具有非常重要的意义。

一、的原理

是在凝胶电泳基础上发展出来的。它利用凝胶矩阵中各点的电阻率不同，即芯中高，表层低的特性，将生物大分子按大小和电荷在凝胶中进行分离。基于两个国际单位制（SI）的物理量——电场强度和电流密度。在其中电场强度指单位电量在两点间的电场强度，它的基本单位是伏特每米；电流密度指通过某一面积的电流值，它的基本单位是安培每平方米。生物大分子在凝胶中进行电泳时，电场强度和电流密度的变化规律直接影响它们在凝胶中的迁移距离和选择性质。

二、的优缺点

1.优点

具有极高的分辨能力，在分离比较小的DNA片段方面具有明

显的优势。另外，它较为灵活，可以根据样本的特性和需求来设

计实验方案。此外，这种技术实验成本不高，实验条件相对简单。

2.缺点

的缺点在于，进行实验需要逐级递增加强电场，涉及到的专业

知识比较复杂，操作门槛较高。另外，由于DNA迁移距离与其电

荷量和大小成反比，因此在进行分离的过程中，需要选定相应的

凝胶浓度和电场，以克服基于这些因素引起的迁移距离不均的问题。

三、的应用

1.在DNA分离中的应用

在DNA分离中应用比较广泛，可以用来鉴定遗传变异、克隆DNA、以及构建DNA指纹等。对于基因测序中所需的较长的

DNA片段，也可以进行分离。

2.在RNA分离中的应用

也可以应用于RNA分离领域，在这一领域中，它可以用来鉴定表达的不同等。

3.在蛋白质分离中的应用

除了在DNA和RNA分离中的应用，还可以应用于蛋白质的分离中。在蛋白质分离中，这项技术使用较少，但仍然具有应用潜力，可用于鉴定蛋白质降解产物等。

脉冲场凝胶电泳(PFGE)

1 PFGE是公认的比较繁琐耗时的技术。一次电泳至少需要两天时间。 2 电泳带型易受人为等多种因素的影响，需要较高的技术水平。 3 不能同时优化胶的每个部分的条带分布。 4 不能确切地认为相同大小的条带就是相同的DNA片段。 5 一个酶切位点的变化可能引起不止一个条带的变化。 6 PFGE分型技术在大肠杆菌O157：H7等细菌的分子生物学分析中得到了广泛的应用。但有些菌种用PFGE是不可分的。研究人员发现对于有广泛基因重组现象的细菌，PFGE并不是一个适宜的分子分型工具。
4.制冷系统以及泵的流速等
蠕动泵的流速：一般控制在50-70左右，以免速度太快，使胶在溶液中移动。
冷却泵的开启：冷却泵开启时，一定要把蠕动泵打开，以避免冷却泵管道内的溶液因为过度制冷，凝结成冰块而堵塞管道。
电泳结束后，应及时取出凝胶，进行染色等操作，以避免因为时间太长，而造成条带的弥散。
五、PFGE方法的局限和不足
制胶过程模拟图
胶块上样模拟图
拆卸凝胶槽，小心取出凝胶，放在电泳槽中适当位置。调节脉冲场电泳参数，4V/cm、脉冲时间1-40s, 14℃ 电泳18h，泵 70。
将电泳完的凝胶用EB染色20min，清水漂洗20min，置凝胶成像系统中检测
四、影响PFGE的因素
1.琼脂糖凝胶浓度
低熔点琼脂糖是经过羟乙基化修饰的琼脂糖，30℃左右成胶，熔点是65℃。熔化温度低于大多数双链DNA熔点。这种性质可以从凝胶中回收天然形式的DNA

脉冲场凝胶电泳的原理

脉冲场凝胶电泳 (Pulsed Field Gel Electrophoresis ,PFGE)

用于分离大分子量DNA 片段的一种电泳方法。 PFGE 是通过脉冲电场方向、时间与电流大小交替改变完成分离大分子DNA。

影响PFGE的因素

琼脂糖凝胶浓度
浓度越高，移动速度越慢，适合分离低分子量DNA 浓度越低，移动速度越快，适合分离高分子量DNA

1%的琼脂糖浓度最大可以分离3Mb的DNA片段 1.2–1.5%的琼脂糖浓度可以使片段更加紧密 0.5-0.9%的琼脂糖浓度可以分离片段更大的DNA片段，不过条带很弥散
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缓冲液和温度

温度越高，DNA移动速度越快，但是条带的清晰度和分辨力明显下降。温度过高会导致 DNA带变形或解链。最佳电泳温度是14 ℃ 最常用的电泳液是 0.5x的TBE buffer，有时也可以用1.0x的TAE buffer代替

条带变粗 ---减少上样量条带拖尾或模糊---电场转换时间不适合，优化电场转换时间、上样量太高，调整样品浓度大片段DNA 不能有效分离---降低电压、延长电场转换时间条带弯曲---缓冲液缓冲能力下降，更换缓冲液、上样时样品块被挤碎、泵速度太慢

可能遇到的问题以及解决方法

脉冲场凝胶电泳

近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis ，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA 序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。电泳结果通常是条带图谱。该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。通过分型可以鉴定比较菌株是否一致，对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。

一、脉冲场凝胶电泳的原理

PFGE 与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA 分子经凝胶的分子筛作用由负极移向正极。而PFGE 采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA 分子的电泳方向随着电场的变化而改变。正是因为电场方向的交替改变，才使大分子

DNA 得以分离。图l 是根据Carle 和Olson

最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1

field gel electrophoresis ，OFA-GE)绘制的

PFGE 示意图。A 、B 代表两个交替开启和关

闭的电场。当A 电场开启时，B 电场关闭，

DNA 分子从A 电场的负极(A-)向正设(A+ )

移动；当B 电场开启时，DNA 分子改变原

来的运行方向，随B 电场由负极向正极移动。

这样，随着电场方向的交替变化DNA 分子即呈“Z” 字形向前移动。目前的理论和实验

研究表明，当某一电场开启时，DNA 分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。如果电场方向改变 DNA 分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA 分子必须相应地变化移动方向。可以想象，较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。此外还发现，当交替变化的两个电场方向的夹角大于90°时，DNA 能较迅速地将其后端调转过来，在新的电场中成为泳动的前端。但另一方面，由于DNA 分子是顺长度穿越凝胶孔的，当电场方向突然改变时，分子的两端可能同时伸入不同的凝胶孔，折为U 形或J 形结构而被阻隔下来。只有当新的前端移向更前方时，另一端才能被牵拉下来。因DNA 分子具有很大弹性，当某一端挂在凝胶孔时， DNA 分子拉长，滑落下来后又收缩，并很快赶上前端。但当电场强度太大时，大分子DNA 因带有均匀的电荷，电场力的作用将可能使同一DNA 大分子的多个部位同时进入多个凝胶孔，结果被陷住而不再向前移动。这就是在分离人酵母菌(S ．pombe)染色体等大分子时要用低电场的原因。

脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一

种常用于分析测定大分子量DNA分子种类、外源DNA同源度、DNA长度等

实验的灵敏度相当高的一种电泳技术。该技术是利用 DNA 分子在脉冲场

条件下的电泳运动，将不同类型的 DNA 集合体根据其分子质量分离而得

到细菌的 DNA 指纹图谱，从而用于基因检测、基因定位、系统发育研究、菌种识别、菌群分析、植物起源及食品安全检测等领域。其实验原理是在

原电泳的基础上，增加了两个梯度磁场，形成脉冲场条件下，DNA 分子会

从均匀电荷有序分布转变为非均匀电荷分布，在脉冲场条件下，它会产生

不均匀向偏冲，从而实现对 DNA 集合体的分离，再加上同时对 DNA 分子

进行大量的微量操纵，有效的分离了DNA分子，使它们能够产生端粒酶消

化片段，最终可以经过比较求得大分子量DNA分子种类，外源DNA同源度、DNA长度等实验结果。

脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳（Pulse Field Gel Electrophoresis, PFGE），是一种通过交替改

变电场方向和大小等参数，使得大分子DNA在凝胶中得到更好的分离的电泳技术。该技术

主要依靠电场对DNA分子的移动与定向拉伸，通过一系列的脉冲场控制形成脉冲态运动，

使DNA分子得到更广泛的电泳分离。

在经过凝胶电泳之后，得到的分离图谱呈现出一组带状分布的DNA分子，每条带都代

表着分子的大小。DNA分子越大，迁移的速率就越慢，因此大的分子在凝胶上迁移的距离

要比小的分子短。这个技术被广泛应用于基因编辑、基因检测和病原体的快速分型等领域。

实验中，将DNA分子高压加在凝胶中，通过影响电场的大小和方向，脉冲场凝胶电泳

可以将DNA分子拉伸成一系列不同长度的线条。接下来应该是经过染色或者转移等方法，

对凝胶进行图像处理，得到DNA分子的带状图谱。带状图谱中，每一条带代表一个不同的DNA分子长度，因此可以确定DNA的大小。根据带的数量、大小和密度等参数，可以进一

步区分样品中不同的DNA分子。

需要注意的是，PFGE并不能很好地分离具有相同长度的DNA分子，因为它们将聚集成一个带状图。但总的来说，PFGE是一种用于高分辨率DNA分离的强大工具，已被广泛用于研究多种生物学和医学问题，例如：身份鉴定、结构基因组学、基因突变分析等。

脉冲场凝胶电泳的原理

可能遇到的问题以及解决方法

凝胶在缓冲液中漂浮---蠕动泵的速度太快或太慢，请调到合适的速度。缓冲液不流动或流速慢---检查冷却泵：当冷却泵制冷时，如果蠕动泵没有开，会造成管道内结冰，导致管道堵塞。
电泳条带扭曲---因为流速太低，导致制冷不充分，或不均一、缓冲液体积必须大于2.2 L

脉冲时间
当电场方向发生改变, 大分子的DNA 便滞留在胶孔中, 直至沿新的电场重新定向后, 才能继续向前移动,大分子DNA 重新定向需要的时间长当DNA分子变换方向的时间小于脉冲周期时,DNA 就可以按其分子量大小分开

改变脉冲时间
分离不同大小DNA

电压
最常用的电压是6V/cm，低电压时，迁移率与电压成正比，想分离大分子DNA时一般选用低电压和延长脉冲时间
脉冲场凝胶电泳的原理及相关注意事项
普通凝胶电泳

通常的琼脂糖凝胶电泳利用双链DNA 分子在电场作用下，在凝胶中的迁移率不同而达到分离的目的。

当双链DNA 分子超过一定的大小以后， DNA 双螺旋的半径超过了凝胶的孔径，在琼脂糖中的电泳速度会达到极限，此时凝胶不能按照分子大小来筛分 DNA。
脉冲场凝胶电泳 (Pulsed Field Gel Electrophoresis ,PFGE)

脉冲交变电场凝胶电泳

脉冲交变电场凝胶电泳（PulseFieldGelElectrophoresis，简称PFGE）是一种常用的分子印迹技术，可以分析出微生物类群的分子细胞分子量和电泳结构。PFGE是由威廉S克莱因爵士（William S. Klein）于1989年发明的，也是当今最为重要的遗传技术之一。它利用了由

一个或多个可改变的电场来引导DNA链在凝胶电泳中运动，这种可改变的电场交替变化，称为脉冲(Pulse)。

PFGE首先使用聚合物凝胶将所要分析的DNA片段缓慢拉伸，然

后将拉伸的DNA片段注入凝胶电泳板。在凝胶电泳过程中，DNA片段会被拉伸，形成一条宽的“蛇形”DNA条带，可以被精确测定。脉冲场电泳技术将电场脉冲应用到凝胶电泳中，可以改变凝胶电泳速度，使DNA片段在凝胶中移动，从而分离出小片段，有利于进一步改善结果的质量和精确度。

PFGE技术可以分离出不同的DNA片段，可以用来评估微生物的

分子多样性、物种的分子变异和群体的遗传多样性。它可以用于研究病原体的分子结构和多样性，包括疾病的基因分型、抗药突变类型等，也可以用于家系遗传研究、基因库构建、病毒检测等。PFGE技术可

以以高精度、快速、简便的方式，实现病原体和分子结构的高精度分析，是病原体研究比较可靠的技术。

此外，PFGE技术还可以用于肿瘤基因突变检测、遗传学计算机

模拟和基因芯片验证等，它可以提供快速、精确、可靠的分子诊断，更有利于科学家们认识病毒、病原体和细胞免疫力的结构。

脉冲交变电场凝胶电泳的关键技术，主要是电泳温度的控制和脉冲电场的调制，使之能够实现精准的DNA分离。首先，PFGE实验仪会将温度保持在室温的一定程度，使得DNA能够在芯片凝胶中热性解析，实现最佳的分离结果。其次，PFGE设备还需要使用脉冲交变电场电泳分离DNA片段，将电场脉冲应用到凝胶电泳中。这样，就可以有效防止微生物病毒的拉伸，改善凝胶电泳结果的质量和精确性。

脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。电泳结果通常是条带图谱。该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。通过分型可以鉴定比较菌株是否一致，对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA分子经凝胶的分子筛作用负极移向正极。而PFGE采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随着电

场的变化而改变。正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA得以分离。图l是根据Carle和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1 field gel electrophoresis，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。A、B代表两个交替开启和关闭的电场。当A电场开启时，B电场关闭，DNA分子从A电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B电场开启时，DNA分子改变原来的运行方向，随B电场负极向正极移动。这样，随着电场方向的交替变化DNA分子图1 PGE的原理(OFAGE系统) A、B代表两电场即呈“Z” 字形向前移动。目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。如果电场方向改变DNA分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA分子必须相应地变化移动方向。可以想象，较小的分子能相当快

脉冲交变电场凝胶电泳

脉冲交变电场凝胶电泳，简称PFG状态，它是一种应用于物质结构特征分析的

新技术。它利用不均匀的电场，具有特定的强度和取向，将大分子物质的极性分出，完成分子的凝胶电泳分类。PFG状态主要是通过脉冲发生器发出的电场来把大分子

物质拆分为正负电荷单位，然后再用凝胶电泳把它分离出来。它可以在低温环境下，特别是非常低温环境下，从而避免蛋白质酶在正常温度下发生降解和改变。这就是最大的优点。

此外，PFG状态采用快速、横向和可定制的能力，加快了物质分析的板块，是

目前研究和应用应用最多的技术之一。PFG状态的优势在于它可以精确控制电场的

参数，以获得最佳的物质分类结果。PFG状态还使用有限的共軛條件来准确分析结

构物，缩短了研究过程，大大提高了效率。

最后，脉冲交变电场凝胶电泳不仅可以解析物质结构，还可以用于活体样品的

分析，从而更进一步提高研究结果的准确性。此外，随着不断的技术的发展，脉冲交变电场凝胶电泳的技术性能将不断提高，并且应用范围将进一步拓宽。总之，脉冲交变电场凝胶电泳技术拥有出色的性能，开发出的仪器和仪器将深受市场的青睐。

脉冲场凝胶电泳.

脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项

【实验原理】

大分子DNA一般长度超过20kb，在某些情况下，超过40kb在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10〜2000kb之间的DNA片段。

这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显着地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。反之，较小的DNA移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。在许多实用的PFGE方法中，倒转电场凝胶电泳

是最简单最常用的方法(FIGE。通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE 设备能把大小范围在10〜2000kb 的DNA 片段分开。FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。

【仪器、材料与试剂】

1. 制备DNA 样品所需材料

1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris ，pH7.5；0.15mol/LNaCl ；0.1mol/LEDTA。

2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。

3EC 缓冲液(6mol/LTris ，pH7.5；lmol/L NaCl ；0.5%

PFGE原理及注意事项[指南]

脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis ,PFGE)是通过脉冲电场方向、时间与电流大小交替改变完成分离大分子DNA。00

PFGE注意事项：：00

蠕动泵的流速：电泳过程中，控制好蠕动泵的流速，一般控制在50-70左右，以免速度太快，使胶在溶液中移动。00

冷却泵的开启：冷却泵开启时，一定要把蠕动泵打开，以避免冷却泵管道内的溶液因为过度制冷，凝结成冰块而堵塞管道。00

电泳结束后，应及时取出凝胶，进行染色等操作，以避免因为时间太长，而造成条带的弥散。00

脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理00

脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理大致为:

细菌包埋于琼脂块中,用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切,酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。

PFGE中内切酶的选用至关重要,所采用的内切酶常为寡切点酶(low frequency cleavage restriction endonucleases),这种酶切后的片

段少而大,适合于作PFGE电泳。McClelland等[8]通过对细菌的PFGE 电泳图谱的内切酶的选择研究发现,四核苷酸CTAG在许多GC含量>45%的细菌染色体中是很少见的,在他们所试验的16个细菌的染色体中,被1个或多个可识别CTAG位点的内切酶酶切,每100000ｂｐｓ中不到一次,这些酶的识别序列分别为:XbaI(TCTAGA), SepI(ACTAGT),AvrII(CCTAGG)和NheI(GCTAGC)。同样地,在许多含

脉冲电场凝胶电泳

1. 介绍

脉冲电场凝胶电泳（Pulsed-field Gel Electrophoresis，简称PFGE）是一种用于分离、检测和鉴定大分子DNA的技术。它通过在凝胶中施加脉冲电场，利用DNA 分子在电场作用下的迁移速度差异来实现DNA分离。

2. 原理

PFGE的原理基于DNA分子在脉冲电场中的迁移速度与其大小有关。在传统的水平凝胶电泳中，小分子DNA会快速迁移，而大分子DNA由于受到凝胶孔隙限制而迁移较慢。然而，在一定的时间尺度内，大分子DNA可能无法完全穿过凝胶网络，导致其无法被有效分离。

为了解决这个问题，PFGE引入了脉冲电场。它通过交替改变电场方向和强度来创造一个“混合模式”，使得大分子DNA能够在不同方向上进行迁移，并最终穿过凝胶网络。这种方式可以有效地增加大分子DNA的迁移距离，从而实现对大片段DNA 的高效分离。

3. 实验步骤

3.1 制备凝胶

需要制备PFGE所需的琼脂糖凝胶。通常使用琼脂糖浓度较高的凝胶（通常为1-2%），以增加凝胶网络的致密程度。

3.2 DNA提取

从待检测样品中提取待测DNA。可以使用常规的DNA提取方法，例如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。

3.3 准备DNA样品

将提取得到的DNA进行适当的处理和纯化，以去除杂质和降解产物。可以通过酶处理、有机溶剂萃取或商用纯化试剂盒等方法进行。

3.4 打孔和载入DNA

将处理后的DNA溶液加入到琼脂糖凝胶孔中。为了确保DNA在电泳过程中不会由于重力而下沉，可以在凝胶上方放置一层透明塑料薄膜，并用夹子固定。