脉冲场凝胶电泳技术资料

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BIO-RAD脉冲场电泳介绍

﹡此后,随着PFGE技术的不断改进,现已具有分辨出高达10Mb级 DNA的能力。
﹡这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生物基因组结构的研究。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
PFGE的原理
PFGE的基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变的脉冲电场,其方向、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改变时,大分子DNA 便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重新定向后,才能继续向前泳动,DNA分子越大,这种重新定向需要的时间就越长,当DNA分子改变方向的时间小于脉冲时间时,DNA就可以按照其分子量大小分开, 经EB染色后在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。
一、PFGE在分子分型方面的应用通过微生物分型可以鉴定菌株是否一致、比较它们的亲缘
关系,对于细菌性传染病的监测、传染源追踪、传播途径的调查和识别有着非常重要的意义。
传统的微生物分型技术主要是基于表型特性分类,如生化分型(biotyping)、血清学分型(serotyping)、耐药谱测定(antmi icrobial susceptibility testing)、噬菌体分型(bacterialphage typing) 等。由于微生物易受环境的影响,很容易改变其表达性状,使得表型分类很不准确。
CHEF-DR III
脉冲场电泳系统的配件
脉冲场电泳（PFGE）的实验流程
Cultured Cells
Unicellular Organisms
Harvest Cells
Tissues
Dissociate
Wash Cell Suspension
Determine Cell Concentration Resuspend to needed Concentration

pfge原理

pfge原理PFGE原理是一种分子生物学技术，全称为脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis），它是一种分离和分析DNA片段的方法，可以将大片段的DNA分子从凝胶中分离出来，从而进行电泳分析。

1. 原理PFGE的原理在于凝胶中应用交错电场，使DNA的运动方向变化，从而使大分子量DNA可以被更好的分离。

首先，DNA被切成片段，并在凝胶中进行电泳分离。

PFGE所采用的凝胶是一种“交错”的凝胶，即在不同方向上阻碍电泳运动的纤维素。

在电场中，DNA分子因为其大小、形状和电荷密度不同而负载不同的电荷，向着凝胶的两个端点移动。

在PFGE过程中，电场方向会不断改变，这种改变可以使大分子量DNA分子在不同方向上进行运动。

一次分离过程通常持续16小时以上。

2. 应用PFGE技术是目前常用的DNA分子分离技术之一，其应用范围广泛，主要用于以下领域：（1）遗传学研究：PFGE技术可以帮助了解基因组结构和动态变化，尤其是在菌群的基因组研究中，PFGE技术具有重要作用。

（2）食品安全检测：PFGE技术可以用于食品安全检测，例如细菌的分离和鉴定，食品中微生物的种类、数量及分布等的研究。

（3）医学研究：PFGE技术在医学领域中有广泛应用，比如可以用来检测癌症等重大疾病，检测病原体和细菌的快速鉴定等。

3. 优势相较于常规的DNA电泳，PFGE技术有以下几点优势：（1）可以分离大分子量的DNA分子，比如细菌的染色体DNA。

（2）可以提高DNA分离的分辨率，从而更准确地分析DNA的结构和变异情况。

（3）PFGE的原理可以单独分离DNA分子，使处理比较麻烦的DNA成为可能，比如重复序列等。

总之，PFGE技术在现代生命科学中已经成为了不可或缺的基础技术之一。

通过PFGE技术，我们可以更好地理解细胞DNA的组成和结构，同时对食品和医学工作中的研究也有着巨大的帮助作用。

202X年脉冲场凝胶电泳(1)

上述方法亦可用于ss环状病毒DNA RF型的分离, 质粒DNA的氯霉素扩增使用并不广泛（菌株和载体）
2) 噬菌体载体DNA的分离
纯净病毒颗粒病毒载体DNA
M13mp载体可采用质粒DNA的分离方法
第十二页，共三十八页。
二、RNA的分离与纯化
1. 制备RNA的关键—防止内外源RNase的作用
1) RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围; 抗高温严寒 (0~65℃均具活性）；抗变性剂
单子叶植物 151（玉米）~182kb（浮萍）藻类 132（裸藻）~191kb（衣藻）
第八页，共三十八页。
1) DNA分离纯化过程
破碎细胞 + DNA抽提液(EDTA、去污剂、还原剂) 65℃温育
20’
冰浴冷却离心去细胞碎片苯酚抽提法①
CsCl密度梯度离心②
1) 苯酚抽提法上清液缓冲液用水饱和苯酚抽提2~3次上层液相用氯仿抽至界面无蛋白变性物上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀沉淀物用70%冷乙醇洗涤,干燥溶于缓冲液加入RNAase处理除去RNA 苯酚氯仿抽提沉淀干燥
2) 按电泳装置分: 水平式/琼脂糖凝胶; 竖式/聚丙烯酰胺凝胶
3) 两种方法比较：分离效果和分离范围; 操作难易
2. 用途
琼脂糖凝胶用于DNA和RNA的常规(chángguī)分析；聚丙烯酰胺凝胶常用于小分子核酸分析。
3. 凝胶电泳的一般程序
制胶点样电泳染色观察
二、DNA电泳
1. DNA分子种类
288 kb
痘病毒
196 kb
质体几~100以上kb
线粒体
藻类线状
15kb
酵母环状
19~78 kb

脉冲场凝胶电泳.

脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。

此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。

脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。

这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。

反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。

在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。

通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。

FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。

【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。

2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。

3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%Brij58；0.2% 脱氧胆酸盐(Deoxycholate；0.5%十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl。

（生物秀实验频道）4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。

5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。

6RNase(10mg/mL。

脉冲场凝胶电泳.

此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。

脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。

反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。

在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。

通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。

FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。

【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。

2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。

3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。

5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。

6RNase(10mg/mL。

7 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品。

8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。

90.5μg/mL 溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。

脉冲场凝胶电泳技术及其在细菌感染性疾病中的应用分析

脉冲场凝胶电泳技术及其在细菌感染性疾病中的应用分析在细菌的相关研究中，比如其流行特征、追踪传染源等，有多种方式可以实现。

其中应用比较广泛的方法是将菌株分型，以此来得到同源性关系。

具体来说，脉冲场凝胶电泳技术是实现基因分型的一种最为常用的方法，该方法得到的结果的重复性和分辨率都是非常好的，很多相关的研究人员都会采用该种方式来研究细菌感染性疾病的相关知识。

本文对脉冲场凝胶电泳技术的应用进行相关分析和探究，具体内容如下。

1 原理脉冲场凝胶电泳技术也称为PFGE技术，该技术是在1984年被美国科学家提出的。

PFGE技术主要是通过限制性核算内切酶可以将DNA实现消化，最终可以产生多个有限的，并且各段长度都不一样的DNA片段，一般来说，片段数量通常在5到20之间。

之后便可以采用常用的电泳方式实现分离。

根据跟李的电泳条带图谱，可以正确地判断细菌的种类。

基于以上原理，PFGE技术可以很好地反应细菌所有基因组的情况，包括一些细微的地位，这将对细菌的相关研究具有非常有利的影响。

2 结果判断如果在图片条带上的大小以及出现的数量都是相同的，则可以认为其型别是相同的。

如果在所有的图片条带中，有两个或者三个是有所差别的，则可以认为其亲缘关系是较为密切的。

如果在所有的图片条带中，有四到六个是有所大的，则可以认为它们之间有可能会存在亲缘关系。

而如果在所有的图片条带中出现了大于等于七个有所差异的条带，则认为两者之间不存在任何的亲缘关系。

考虑到细菌间的变异特性，将85%作为判断相关的标准。

3 主要影响因素第一，是缓冲液温度。

缓冲液的温度会产生一定的影响。

这是因为缓冲液的温度越高，那么电泳对应的速度是越快的，这就使得整个的时间变得更短，这会导致条带的分辨率变得较低，不能很好得进行识别。

在缓冲液温度较低的情况下，对应的电泳所需要的时间就会变得越长，会让条带更好地进行分辨，通常将温度维持在14度左右，第二，是脉冲的角度。

脉冲的角度也会对结果产生一定的影响。

脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis ，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA 序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。

电泳结果通常是条带图谱。

该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。

通过分型可以鉴定比较菌株是否一致，对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。

一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE 与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA 分子经凝胶的分子筛作用由负极移向正极。

而PFGE 采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA 分子的电泳方向随着电场的变化而改变。

正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA 得以分离。

图l 是根据Carle 和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1field gel electrophoresis ，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。

A 、B 代表两个交替开启和关闭的电场。

当A 电场开启时，B 电场关闭，DNA 分子从A 电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B 电场开启时，DNA 分子改变原来的运行方向，随B 电场由负极向正极移动。

这样，随着电场方向的交替变化DNA 分子即呈“Z” 字形向前移动。

目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA 分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。

如果电场方向改变 DNA 分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。

这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA 分子必须相应地变化移动方向。

可以想象，较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。

凝胶电泳技术课件

提高灵敏度：通过改进检测方法、优化实验条件等方法提高灵敏度，以便更好地检测低丰度的DNA片段。
降低成本：通过优化实验方案、改进实验设备等方法降低成本，以便更好地推广凝胶电泳技术。
应用领域拓展
生物制药：蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化
基因工程：DNA片段的克隆和测序
食品安全：食品添加剂、微生物检测
凝胶电泳技术课件
目录
01. 凝胶电泳技术概述 02. 凝胶电泳实验步骤 03. 凝胶电泳结果分析 04. 凝胶电泳技术发展
凝胶电泳原理
凝胶电泳技术是一种利用凝胶介质对不同分子量的DNA、RNA或蛋白质进行分离和检测的技术。
凝胶电泳的原理是利用电场对不同分子量的DNA、 RNA或蛋白质进行分离和检测。
04
06
确定分子量：根据迁移率和分子量之间的关系确定分子量
确定电泳条件：根据结果分析确定合适的电泳条件
技术改进方向
提高分辨率：通过优化凝胶配方、改进电泳技术等方法提高分辨率，以便更好地区分不同大小的DNA片段。
提高速度：通过优化电泳技术、改进实验流程等方法提高速度，以便更快地完成实验。
凝胶电泳技术主要包括凝胶制备、样品处理、电泳、染色和检测等步骤。
凝胶电泳技术在分子生物学、生物化学、遗传学、医学等领域具有广泛的应用。
凝胶电泳类型
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：根据分子量进行分离
毛细管凝胶电泳（CGE）：根据分子大小和电荷进行
分离
琼脂糖凝胶电泳（AGE）：根据分
子大小进行分离
03
电泳方向：观察电泳方向的正负，判断样品的电荷和分子量
04
电泳时间：观察电泳时间的长短，判断样品的电荷和分子量

脉冲场凝胶电泳技术

5、把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。如果用的是10个齿的梳子，把标准菌株H9812加在第1、5、10个齿上。 6、用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约3分钟。 7、把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面相接触。从胶槽的下部中央缓慢到入100ml熔化的在55℃－60℃平衡的1％ SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟左右。 8、记录加样顺序。
多余的部分。
5、保证胶块在液面下而不在管壁上。
6、将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速
约170转/分钟。
7、将纯水和TE放在50℃水浴摇床中预热。

三、洗胶块 1、从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的 screened-cap。轻轻倒掉CLB。在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。 2、每管中加入15ml预热的纯水。 3、确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回 50℃水浴摇床中，摇10分钟。 4、倒掉水，用纯水再洗一次。 5、倒掉水，加入15ml预热的TE，在50℃的水浴摇床中摇15分钟。 6、倒掉TE，用TE重复洗三次，每次10－15分钟。 7、倒掉TE，加入10ml TE，放在4℃冰箱保存备用。

四、胶块内DNA的酶切 1、在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及 H9812的名称。 2、按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液，混匀。试剂 µl/胶块 µl /10胶块纯水 180µl 1800µl Buffer D 20µl 200µl 总体积 200µl 2000µl 注意：缓冲液要置于冰上。
调整至3.6~4.5。如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果

脉冲场凝胶电泳.

脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA一般长度超过20kb，在某些情况下，超过40kb在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。

此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。

脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10〜2000kb之间的DNA片段。

这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显着地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。

反之，较小的DNA移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。

在许多实用的PFGE方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。

通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE 设备能把大小范围在10〜2000kb 的DNA 片段分开。

FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。

【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris ，pH7.5；0.15mol/LNaCl ；0.1mol/LEDTA。

2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。

3EC 缓冲液(6mol/LTris ，pH7.5；lmol/L NaCl ；0.5%4ESP缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，Img/mL蛋白酶K。

5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。

6RNase(10mg/mL。

7 胶模( 由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。

90.5匕g/mL溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。

脉冲电泳原理

脉冲电泳原理脉冲电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE）是一种高分辨率的电泳技术，广泛应用于DNA分子的分离和分析。

它利用交替的电场方向和不同频率的电场脉冲，能够有效地分离大分子DNA，是分子生物学领域中重要的实验方法之一。

脉冲电泳的原理基于DNA分子在电场中的迁移速度与其大小成反比的关系。

在传统的连续电泳中，较大的DNA片段会受到较大的电阻力而难以迁移，导致分辨率较低。

而脉冲电泳通过交替改变电场方向和频率，使得DNA分子有机会在电场中重新定位，从而能够有效地分离不同大小的DNA片段。

在进行脉冲电泳实验时，首先需要将待分离的DNA样品嵌入凝胶中，通常使用琼脂糖或琼脂糖瓷作为凝胶材料。

接下来，将凝胶放置在电泳槽中，注入含有缓冲液的电泳缓冲液。

然后，施加高压电场，使得DNA分子在凝胶中迁移。

在脉冲电泳中，电场的方向和频率会不断变化，从而使得不同大小的DNA片段能够得到更好的分离。

脉冲电泳的优势在于其高分辨率和对大分子DNA的有效分离。

通过调整电场的方向和频率，可以实现对不同大小DNA片段的精确分离，使得实验结果更加准确可靠。

因此，脉冲电泳被广泛应用于基因组学研究、疾病诊断、DNA指纹分析等领域。

总的来说，脉冲电泳是一种重要的分子生物学实验技术，其原理基于DNA分子在电场中的迁移速度与大小成反比的关系。

通过交替改变电场方向和频率，脉冲电泳能够有效地分离大分子DNA，具有高分辨率和高效性的优势。

在实验过程中，需要注意凝胶的制备和电场参数的调节，以确保实验结果的准确性和可靠性。

脉冲电泳在基因组学研究、疾病诊断、DNA指纹分析等领域有着广泛的应用前景，对于推动生命科学研究具有重要意义。

副溶血弧菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)标准操作方案

酶 NotI（10U/µl） 4µl 总体积 200µl
9、
每管加入 200µl 混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面的下面。
10、
在 50℃水浴中孵育至少 4 小时，H9812 的胶块放在 37℃水浴中孵育至少 2 小时。灌制电泳胶
1、打开水浴箱，温度调至 55-60℃。 2、配制 2200ml 的 0.5×TBE。 3、用 0.5×TBE 配制 1%SeaKem Gold(SKG)胶。 14cm 宽电泳胶框（10-15 加样孔）：1.0gSKG 胶溶于 100ml0.5×TBE 中； 21cm 宽电泳胶框（≥15 加样孔）：1.5gSKG 胶溶于 150ml0.5×TBE 中。 4、熔化时，微波加热 60 秒，混合；每隔 15-30 秒重复一次，直到胶完全熔化。放在 55-60℃水浴备用（温度至少平衡 30 分钟以后使用）。 5、从 37℃水浴中取出酶切完的胶块，平衡到室温。 6、用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。 7、每管加入 200µl 0.5×TBE, 室温平衡 5 分钟。 8、安装胶槽，调整梳子高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平仪调整胶槽使其水平。 9、把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。把标准菌株 H9812 加在第 1、 5、 10 个齿上（10 齿梳子）或第 1、5、10、15 个齿上（15 齿梳子）。 10、用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约 3 分钟。 11、把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在同一条直线上，并且胶块与胶槽的底面相接触。从胶槽的下部中央缓慢到入熔化的在 55℃－60℃平衡的 1％SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固 30 分钟左右。 12、记录加样顺序。

脉冲场凝胶电泳试验流程

脉冲场凝胶电泳实验流程一、准备样品1. 琼脂糖包埋的样品常用的DNA提取方法不能得到完整的大分子量DNA。

大分子量DNA很脆弱，在制备过程中容易因移液等操作造成机械剪切。

将完整细胞包埋入琼脂糖后再进行裂解，去除蛋白的操作，可防止大分子量DNA的断裂。

琼脂糖块包埋的DNA可以避免被机械剪切，并且是一种简单的操作方法。

处理过的包埋有DNA的琼脂糖块可以直接放入琼脂糖凝胶的点样孔。

在将细胞包埋入琼脂糖之前要先确定细胞浓度，尽管吸光度很常用，但是并不可靠。

单位吸光度对应的细胞浓度会因菌株不同或培养基不同而有差异。

这会影响琼脂糖块中DNA的含量，导致上样量过大或不足。

不论细菌、真菌还是哺乳动物细胞，使用血球计数板均可得到准确和高重复性的细胞浓度。

Bio-Rad提供一次性的样品模具（货号：170-3713）。

每个模具可制备50个10 x 5 x 1.5 mm的琼脂糖胶块。

样品制备过程中的酶可以快速有效的扩散进入胶块，用Bio-Rad标准梳子制胶，胶块不需要修剪就可直接放入点样孔。

2. 液体样品小于200kb的DNA片断可以不用琼脂糖包埋，可直接以液体形式加入点样孔。

当操作的DNA大于50kb时，必须用大开口的吸头。

如果只电泳液体样品，使用厚度0.75 mm的梳子可以获得更锐利的条带和更高的分辨率。

3. 制备琼脂糖包埋的哺乳动物DNA该方法中用到的缓冲液，酶和琼脂糖均包含于试剂盒CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit （货号：170-3591）。

1)将细胞悬浮于等渗盐溶液或不含血清的培养基中并置于冰上。

用血球计数板对细胞计数，每毫升琼脂糖块需要5 x 107个细胞，每个10 x 5 x 1.5 mm的样品块需要0.1 mL琼脂糖。

2)准备2% CleanCut™琼脂糖（货号：170-3594），用微波炉融化并置于50 °C水浴。

3)1000g、4 °C离心细胞悬液5分钟，用琼脂糖块一半体积的细胞悬浮缓冲液（10 mM Tris, pH 7.2,20 mM NaCl, 50 mM EDTA）重悬细胞并置于50 °C水浴。

PFGE（脉冲场凝胶电泳）标准操作规程（SOP）

PFGE（脉冲场凝胶电泳）标准操作规程（SOP）PFGE（脉冲场凝胶电泳）标准操作规程(SOP)关键词：PFGE，脉冲场凝胶电泳目的：运用PFGE方法对20Kb至数Mb的DNA进行分子分型图谱分析：采用“PFGE脉冲场凝胶电泳分子分型识别系统”（官微：PFGE_CHINA）进行图谱分析。

系统主要功能是PFGE图谱分子分型在线识别和处理，提供二叉层级聚树，MLVA、MLST字符类型的最小生成树，SEQUENCE基因片段类型的亲缘树计算和图形绘制，用于分析菌株之间的相关性，协助追踪感染来源以及有效控制疫情。

第一天一、胶块的制备1、在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，分别加入约2ml细胞悬浊液（CSB）；2、在1.5ml eppendorf管上标记好对应样品的名称；3、在模具上标记好对应样品的名称；4、用CSB湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB中，用bioMerieuxVitek colorimeter测其OD值，并调整至3.6~4.5。

如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果OD值小于3.6，增加菌量提高其浓度。

5、取400μl细菌悬浊液于相应的1.5ml eppendorf管中，置于37℃水浴中孵育5分钟。

将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中。

6、从水浴箱中取出eppendorf管，每管加入20μl蛋白酶K（储存液浓度为20mg/ml）混匀，使其终浓度为0.5mg/ml。

7、制备好1%Seakem Gold：1%SDS，放于56℃水浴箱中。

8、在eppendorf管中加入400μl的1% Seakem Gold：1%SDS，用枪头轻轻混匀。

9、将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。

注意事项：（1）用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。

（2）细胞悬浊液、蛋白酶K要置于冰上。

（3）在混合细胞悬浊液和1% Seakem Gold：1%SDS时要避免气泡的产生。

脉冲场电泳

脉冲场凝胶电泳- 高分子量DNA琼脂糖凝胶块制备和加工1．收集10ml全血，加入30ml细胞裂解液。

置冰浴中至少20min直至红细胞完全溶解。

2．2000r/min离心10min，移去红色上清液，再次用细胞裂解液洗涤细胞，然后用PBS重悬细胞。

3．稀释单细胞悬液并取一小份用Neubauer腔计数细胞。

4．用PBS重悬细胞，以达到40μl PBS中含1百万个细胞比例（1百万个二倍体哺乳动物大约含有基因组DNA 10μg）5．用PBS配制2％浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50℃。

6．将等体积（各1ml）细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀，立即倒入凝胶块模具中。

7．静置20min让琼脂糖固化，用无菌塑料杯（通常用作划菌）将凝胶块自模具中取出并置入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml的蛋白酶K。

8．将带有凝胶块的蛋白酶K缓冲液于50℃保持2～3天。

每个盛有50ml蛋白酶缓冲液的Falcon管可容纳多达100个凝胶块。

9．蛋白酶K消化后，可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4℃。

10．此外，继续将凝胶块用高压消毒过的TE缓冲液冲洗数遍的步骤。

11．将凝胶块放入装有TE及0.04mg/ml PMSF溶液的Falcon试管中，灭活残留的蛋白酶K。

12.室温下用TE溶液漂洗凝胶块数次,将凝胶块放入另一干净的试管，可直接用于酶切反应或用0.5mol/L EDTA，（pH8.0）4℃保存凝胶块。

13．若用EDTA保存凝胶块，取出后应用TE溶液室温下漂洗30 min×2次。

脉冲场凝胶电泳- 大小标准物的制备λ多联体1．以TE缓冲液悬浮λ多联体（Boehringer MA宝灵曼公司产品），浓度为4μg/40μl。

2．用等体积TE配制的2％低熔点琼脂糖（温度保持在45℃）混匀。

3．移去混合液注入预冷的凝胶块模具中。

4．室温下用TE及100 mmol/L NaCl溶液温育2天。

酵母染色体1．从YPD（酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖）培养基瓶皿中挑选单一克隆加入10ml YPD预培养的肉汤中，30℃下剧烈震荡生长24小时，然后加入200ml YPD肉汤，剧烈振荡24～48h（产量大约100块）。

脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。

电泳结果通常是条带图谱。

该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。

通过分型可以鉴定比较菌株是否一致，对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。

一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA分子经凝胶的分子筛作用由负极移向正极。

而PFGE采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随着电场的变化而改变。

正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA得以分离。

图l是根据Carle和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1 field gel electrophoresis，OFA-GE)绘制的PFGE示意图。

A、B代表两个交替开启和关闭的电场。

当A电场开启时，B电场关闭，DNA分子从A电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B电场开启时，DNA分子改变原来的运行方向，随B电场由负极向正极移动。

这样，随着电场方向的交替变化DNA分子图1 PGE的原理(OFAGE系统) A、B代表两电场即呈“Z” 字形向前移动。

目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。

如果电场方向改变 DNA分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。

这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA分子必须相应地变化移动方向。

脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶系统操作规范文件编号：VBQW11##-##版本号：A0制定：制定日期：审核：审核日期：批准：批准日期：颁发部门：质量保障中心发行日期：文件更改记录版本号发行日期变更原因、依据及详细变更内容制定人分发部门具体部门目录1. 目的 (4)2. 适用范围 (4)3. 职责 (4)4. 操作规范 (4)4.1 简介 (4)4.1.1. 技术原理 (4)4.1.2 主要仪器设备和试剂 (4)4.2 准备工作 (5)4.3 灌胶 (5)4.4 上样 (6)4.5 主机程序设置 (6)4.6 凝胶染色和观察 (6)4.7 电泳槽清理 (7)5. 注意事项 (8)6. 常见故障及解决方法 (8)7. 关于参数设置的几点建议 (9)8. 试剂配制 (11)1.目的指导技术员规范地使用脉冲场凝胶系统。

2.适用范围本标准适用于利用脉冲场凝胶系统对相关产品进行检测。

3.职责分子部门负责本文件的编写，质量保障部及检验人员负责本标准的监督。

4.操作规范4.1简介4.1.1. 技术原理常规的琼脂糖凝胶电泳采用单一的均匀电场，一定大小的线状DNA分子经凝胶的分子筛作用以一定的速率由负极向正极移动。

但当DNA分子的长度超过一定极限后，其迁移率于则于分子大小无关，而主要是决定于电场强度。

实践表明，长度大于50kb的DNA不能在恒场强的琼脂糖凝胶电泳中较好的分离。

脉冲场凝胶系统(Pulsed field gal electrophoresis, PFGE)正好解决这一问题。

PFGE采用两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，DNA的电泳方向随着电场的变化而改变，大分子的DNA得以分离。

严格来讲，“脉冲”场电泳有些用词不当，应称作“交替”场电泳。

电场变换方向的间隔时间为脉冲时间，其分为从数秒到几小时。

通常脉冲时间越长分辨的DNA片段越长。

图一. 脉冲场电泳交变示意图图一是根据Carle和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1 field gel electrophoresis，OFAGE) 绘制的PFGE示意图。