脉冲场凝胶电泳技术资料

3、 在每个1.5ml eppendorf管中加入200µl缓冲液H 的稀释液。 4、小心从TE中取出胶块放在干净的培养皿上。 5、 用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5ml eppendorf 管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原
来的TE中。
6、 用同样的方法处理标准株H9812的胶块。

二、 细胞的裂解
1、 在50ml的screw-cap tube上做好标记。
2、 配制细胞裂解液（CLB）：每5ml细胞裂解液
加入25µl蛋白酶 K（20mg/ml），使其终浓度为
0.1mg/ml，然后颠倒混匀。
3、 每个管子加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。

4、 如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面

注意事项：
（1） 用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。
（2） 细胞悬浊液、蛋白酶K要置于冰上。
（3） 在混合细胞悬浊液和1% Seakem Gold：
1%SDS时要避免气泡的产生。
（4） 混合物加入模具时不能产生气泡。 （5） 在加1% Seakem Gold：1%SDS的过程中 1% Seakem Gold：1%SDS要一直放在56℃水浴箱 中。
胶块的制备

1、 在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，
分别加入约2ml细胞悬浊液（CSB）；
2、 在1.5ml eppendorf管上标记好对应样品的名称；
3、 在模具上标记好对应样品的名称；

4、 用CSB湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬 浊于CSB中，用bioMerieux Vitek colorimeter测其OD值，并
调整至3.6~4.5。如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果
OD值小于3.6，增加菌量提高其浓度。 5、 取400µl细菌悬浊液于相应的1.5ml eppendorf管中，置 于37℃水浴中孵育5分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直 到胶块制备好放在水浴摇床中。

6、 从水浴箱中取出eppendorf管，每管加入20µl
失去了其分子筛的作用,导致电泳带型无法 分辨，PFGE的发明正好解决了这一问题。

1984年, Schwartz和Cantor首次用此技术成功分离 得到酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)细胞 的16条完整染色体DNA。

此后,随着PFGE技术的不断改进,现已具有分辨出高 达10Mb级DNA的能力。

这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几 乎所有生物基因组结构的研究。
PFGE的原理
PFGE的基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变的脉冲电场, 其方向、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改 变时,大分子DNA便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重 新定向后,才能继续向前泳动,DNA分子越大,这种重新定向 需要的时间就越长,当DNA分子改变方向的时间小于脉冲 时间时,DNA就可以按照其分子量大小分开,经EB染色后 在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。

四、胶块内DNA的酶切 1、 在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及 H9812的名称。 2、 按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液，混匀。 试剂 µl/胶块 µl /10胶块 纯水 180µl 1800µl Buffer D 20µl 200µl 总体积 200µl 2000µl 注意：缓冲液要置于冰上。
多余的部分。
5、 保证胶块在液面下而不在管壁上。
6、 将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速
约170转/分钟。
7、 将纯水和TE放在50℃水浴摇床中预热。

三、洗胶块 1、 从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的 screened-cap。轻轻倒掉CLB。在实验台上轻磕管 底使胶块落在管底。 2、 每管中加入15ml预热的纯水。 3、 确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回 50℃水浴摇床中，摇10分钟。 4、 倒掉水，用纯水再洗一次。 5、 倒掉水，加入15ml预热的TE，在50℃的水浴 摇床中摇15分钟。 6、 倒掉TE，用TE重复洗三次，每次10－15分钟。 7、 倒掉TE，加入10ml TE，放在4℃冰箱保存备 用。
脉冲场凝胶电泳技术
生科院遗传学 胡银松
脉冲场凝脉电泳
(Pulsed field gelelectrophoresis,PFGE), 是近年发展起来的一种重要的分离大分子量 线性DNA分子的电泳技术。
普通的琼脂糖凝胶电泳分离DNA分子的上限
是50 kb
大于该极限的DNA分子,常规的琼脂糖凝胶便
PFGE的方法

常规的DNA制备方法得不到完整的大分子量DNA,因 为DNA大片段很脆弱,容易因提取过程中的机械作用 如吸打、离心等而导致DNA的断裂。

为了得到完整的大量DNA大片段,目前主要是采用低 熔点琼脂糖(Lowmelting point agarose)包埋样品,再
进行原位裂解和去蛋白处理从而释放DNA
蛋白酶K（储存液浓度为20mg/ml）混匀，使其终浓
度为0.5mg/ml。
7、 制备好1%Seakem Gold：1%SDS，放于56℃
水浴箱中。
8、 在eppendorf管中加入400µl的1% Seakem Gold：1%SDS，用枪头轻轻混匀。 9、 将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下 凝固10-15分钟。
7、 将管子放在37℃水浴中孵育10-15分钟。

8、 在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶
切缓冲液，混匀。 试剂 µl/胶块 µl /10胶块
纯水 175µl 1750µl
Buffer D 20µl 200µl 酶（10U/µl） 5µl 50µl 总体积 200µl 2000µl 9、 每管加入200µl混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，

低熔点琼脂糖在这个过程中阻止了机械力对DNA大
片段的剪切作用,因而细胞裂解所释放的DNA大片段
包埋在胶栓中。制作好的样品插wenku.baidu.com可以在电泳时直
接插入加样孔中
PFGE的操作步骤
PFGE的简要操作步骤包括样品的包埋、原
位裂解、稀少酶切位点的限制性内切酶对染
色体DNA的消化、脉冲场电泳、凝胶的EB染
色观察5个步骤。