脉冲场凝胶电泳.

脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项

【实验原理】

大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。

这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。

【仪器、材料与试剂】

1. 制备DNA 样品所需材料

1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。

2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。

3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%

Brij58；0.2% 脱氧胆酸盐(Deoxycholate；0.5%十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl。（生物秀实验频道 ）

4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。

5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。

6RNase(10mg/mL。

7 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品。

8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。

90.5μg/mL 溴化乙锭

2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料

1 紫外递质。

210mg/mL tRNA。

35mol/L NaCl。

4 苯酚/氯仿。

53mol/L NaAc，pH5.2。

695%乙醇。

3. 设备

1TBE 缓冲液。

2Seakem HGT 琼脂糖。

3Wide Mini-Sub Cell 凝胶电泳设备。

4 变速泵或蠕动泵 (Bio-Red Laboratory。

5IBI FIJI 600 HV 程序性开关设备。

6 缓冲液冷却循环器 (Fotodyne ， New Britain ，WI 或Mini Chiller(Bio-Rad Laboratory 。

【实验步骤】

1. 脉冲电场凝胶电泳的DNA 样品的制备

为避免大分子DNA 在提取过程中断裂，细胞需在琼脂糖凝胶块中进行原位裂解，在本实验中，我们使用金黄色葡萄球菌(StapHylococcus

aureus 作为例子。

1 取100mL 对数生长期金黄色葡萄球菌细胞于4℃，5000g 离心5min 。

2 用20mL TEN 缓冲液冲洗沉淀，同样条件离心5min 。之后用10mL EC 缓冲液使细胞悬浮。

3 取1.5mL 细胞样品与相同体积含2%SeaPLaque 琼脂糖的EC

缓冲液迅速混合混匀并等分流溶液至封闭的模块中于4℃凝固，混合前加热至琼脂糖熔解并冷却至50℃。

4 对于每一个菌株，需要15～20 个凝胶块，将它们放至含有30～45μg/mL RNase(50mL 的10mg/mL 的

RNase 的10mL EC

缓冲液中，于37℃振摇过夜。

5 去掉裂解缓冲液，换为10mL ESP 缓冲液于50℃轻度振摇温育48h 。

6 将凝胶块放在10mL 含有174μg/mL 苯甲基磺酰氟(PMSF的TE 缓冲液中，室温温育4h(2h 换液一次，以灭活ESP 中的蛋白酶K 。

7 用TE 清洗琼脂块6h(2h 换液一次，置于TE 中4℃保存。

2. 限制酶消化

提高PFGE 的分辨率取决于100～1000kb 片段电泳结果的重复率，它与酶切关系密切，可在琼脂糖凝胶块中使用合适的内切酶消化。（生物秀实验频道

）

125μL10× 反应缓冲液，30U 限制酶，加双蒸水至250μL 混匀。

2 取一个凝胶块置其中，合适温度下温育过夜(按内切酶要求后，用TE 缓冲液洗涤并贮存。

3. 应用PFGE 对样品DNA 进行分析

1 用0.5×TBE 缓冲液制备一个0.8%SeakemHGT 琼脂糖凝胶，胶的厚度尽量与样品凝胶块相符。若用Wide Minisub Cell

进行电泳的话，50mL 该溶液即可。

2 胶凝后，小心移去样品梳。将凝胶块用小刀切成与加样孔一致的大小，将样心地插入加样孔，避免产生气泡。(若样品在溶液中，以l:1

的比率与 50℃2%Seaplaque 琼脂糖相混合，迅速注入加样孔中。

3 把胶放入电泳槽内，加缓冲液，刚好覆盖胶的表面即可，缓冲液事先14℃冷却。

4 将电泳槽和一个连着稳压电源的程序性开关设备相连。打开电源，调节蠕动泵到适当流速(5～10mL/rain或打开变速泵至40。

5 通过计算机启动极性转换程序。大于50kb 的限制性片段在1.2s 和0.4s 正向和反向的电脉冲下得以分离，时间一般为3.5h 或更长。小于50kb