脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳技术用途
脉冲场凝胶电泳技术用途
脉冲场凝胶电泳技术（Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一种用于分离和分析大分子DNA的技术。
它利用电场在凝胶中引起的不断变化的方向来分离DNA分子，适用于分析大片段DNA，如整个基因组或染色体。
PFGE技术在生物学和医学领域有着广泛的用途，包括但不限于以下几个方面：
1. 研究基因组结构：PFGE技术可以用于分析和研究细菌、真菌、植物和动物等生物的基因组结构，帮助科研人员了解基因组的大小、形态和结构。
2. 分子生物学研究：PFGE技术可以用于分析DNA的大小和构成，例如在基因克隆、DNA 指纹图谱分析、基因组映射等方面有着重要的应用。
3. 疾病研究：PFGE技术可以用于分析病原微生物（如细菌、真菌等）的基因组，帮助研究人员了解病原微生物的遗传特性、毒力因子等，对于疾病的预防、诊断和治疗有着重要的意义。
4. 分子流行病学：PFGE技术可以用于分析病原微生物的遗传特征，帮助研究人员追踪疾病的传播途径和流行病学特征，对于疾病的控制和预防有着重要的作用。
总的来说，PFGE技术在生物学、医学和疾病研究领域有着广泛的应用，可以帮助科研人员深入了解DNA的结构和功能，从而促进基础科学研究和临床医学的发展。
pfge脉冲场凝胶电泳具体操作
pfge脉冲场凝胶电泳具体操作PFGE（Pulsed Field Gel Electrophoresis）是一种高分辨率的凝胶电泳技术，可用于分离和检测大分子量DNA片段。
该技术常用于研究基因组结构、遗传变异和DNA断裂等领域。
下面将详细介绍PFGE的具体操作步骤。
1. 准备DNA样品:a. 从细胞中提取DNA。
可以使用标准的DNA提取方法，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。
b. 用酶切酶或限制酶对DNA进行切割。
选择使DNA在所需大小范围内切割的酶，以便获得所需的DNA片段。
2. 制备凝胶:a. 准备1% - 2% 的琼脂糖溶胶。
将所需琼脂糖加入TE缓冲液中，并在适当的温度下加热搅拌，直到完全溶解。
b. 将琼脂糖溶胶倒入制作凝胶的模具中。
在模具顶部放置梳子以制作凝胶槽，并确保梳子的位置水平。
c. 让凝胶固化。
根据琼脂糖溶胶中指定的温度和时间，将模具放入冰箱或培养箱中，使凝胶完全固化。
3. 负载和电泳样品:a. 准备DNA样品。
将所需比例的DNA标记物和DNA样品混合，并加入适量的加载缓冲液，如Bromophenol Blue。
b. 用吸管吸取混合物，并将其轻轻注入凝胶槽中的样品孔中。
确保尽量避免气泡进入凝胶槽。
c. 启动电泳。
电泳前，确保样品中有足够的时间固定在凝胶上。
启动电源，并将电流设置为所需的值。
4. 设置电泳条件:a. 选择适当的电泳缓冲液。
常用的电泳缓冲液包括TBE缓冲液（三硼酸钠缓冲液）和TAE缓冲液（乙醋酸/三乙酸片性缓冲液）。
b. 设置电泳条件，如电流密度，脉冲时间和频率等。
这些条件可以根据所研究的DNA分子量和所使用的电泳设备进行调整。
5. 进行电泳:a. 启动电泳设备，确保电泳条件设置正确，并在所需时间内运行电泳。
b. 当电泳结束时，关闭电源，并小心地取出凝胶，以免损坏样品。
6. 可选的染色和可视化:a. 将凝胶放入染色缓冲液中，如溴化乙锭溶液，使DNA可被视觉化。
b. 在染色缓冲液中搅拌凝胶，确保各个区域充分染色。
pfge原理
pfge原理PFGE原理是一种分子生物学技术，全称为脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis），它是一种分离和分析DNA片段的方法，可以将大片段的DNA分子从凝胶中分离出来，从而进行电泳分析。
1. 原理PFGE的原理在于凝胶中应用交错电场，使DNA的运动方向变化，从而使大分子量DNA可以被更好的分离。
首先，DNA被切成片段，并在凝胶中进行电泳分离。
PFGE所采用的凝胶是一种“交错”的凝胶，即在不同方向上阻碍电泳运动的纤维素。
在电场中，DNA分子因为其大小、形状和电荷密度不同而负载不同的电荷，向着凝胶的两个端点移动。
在PFGE过程中，电场方向会不断改变，这种改变可以使大分子量DNA分子在不同方向上进行运动。
一次分离过程通常持续16小时以上。
2. 应用PFGE技术是目前常用的DNA分子分离技术之一，其应用范围广泛，主要用于以下领域：（1）遗传学研究：PFGE技术可以帮助了解基因组结构和动态变化，尤其是在菌群的基因组研究中，PFGE技术具有重要作用。
（2）食品安全检测：PFGE技术可以用于食品安全检测，例如细菌的分离和鉴定，食品中微生物的种类、数量及分布等的研究。
（3）医学研究：PFGE技术在医学领域中有广泛应用，比如可以用来检测癌症等重大疾病，检测病原体和细菌的快速鉴定等。
3. 优势相较于常规的DNA电泳，PFGE技术有以下几点优势：（1）可以分离大分子量的DNA分子，比如细菌的染色体DNA。
（2）可以提高DNA分离的分辨率，从而更准确地分析DNA的结构和变异情况。
（3）PFGE的原理可以单独分离DNA分子，使处理比较麻烦的DNA成为可能，比如重复序列等。
总之，PFGE技术在现代生命科学中已经成为了不可或缺的基础技术之一。
通过PFGE技术，我们可以更好地理解细胞DNA的组成和结构，同时对食品和医学工作中的研究也有着巨大的帮助作用。
脉冲场凝胶电泳(PFGE)
脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理大致为：细菌包埋于琼脂块中，用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切，酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。
PFGE中内切酶的选用至关重要，所采用的内切酶常为寡切点酶（low frequency cleavagerestric-tionendoucleases），这种酶切后的片段少而大，适合于作PFGE电泳。
McCllelland等通过对细菌的PFGE电泳图谱的内切酶的选择研究发现，四核苷酸CTAG在许多GC含量>45%的细菌染色体中是很少见的，在他们所试验的16个细菌的染色体中，被1个或多个可识别CTAG位点的内切酶酶切，每100000bps中不到一次，这些酶的识别序列分别为：XbaⅠ（TCTAGA），SepⅠ（ACTAGT），AvrⅡ（CCTAGG）和NheⅠ（GCTAGC）。
同样地，在许多含G+C<45%的基因组，CCG和CGG更少。
这样用SmaⅠ（CCCGGGG）、R srⅡ（CGGWCGG）、NaeⅠ（GCCGGC）和SacⅡ（CCGCGG）进行酶切，对产生平均超过100000bps片段是非常合适的。
对PFGE结果的观察，可因不同研究者而出现较大差异，据此，Tenover等经过多年的研究提出了PFGE的解释标准：(1)相同（indistinguishable）：酶切图谱间有同样的条带数，且相应条带大小相同，流行病学上则认为相同，这种经PFGE证实的结果，用其它方法检测不可能显示实质性的差异。
(2)紧密相关（closelyrelated）：PFGE试验中，其它克隆株与暴发克隆株有一致的单一基因事件的改变，如点突变、插入或DNA缺失。
典型的情况下，这种变化可导致2～3条带的差异，当一些分离菌株被多次重复培养或自同一病人多次分离时可观察到这种现象。
(3)可能相关（possiblyrelated）：两个独立的基因情况所致的一致的差异，如出现了4～6条带差异，此时能用简单的插入或DNA缺失或限制性位点的获得或缺失来解释。
脉冲场凝胶电泳分离技术
脉冲场凝胶电泳分离技术在生物学、医学、环境科学等领域广泛应用，它针对DNA、RNA和蛋白质等生物大分子的高分辨率分离和分析具有非常重要的意义。
一、的原理是在凝胶电泳基础上发展出来的。
它利用凝胶矩阵中各点的电阻率不同，即芯中高，表层低的特性，将生物大分子按大小和电荷在凝胶中进行分离。
基于两个国际单位制（SI）的物理量——电场强度和电流密度。
在其中电场强度指单位电量在两点间的电场强度，它的基本单位是伏特每米；电流密度指通过某一面积的电流值，它的基本单位是安培每平方米。
生物大分子在凝胶中进行电泳时，电场强度和电流密度的变化规律直接影响它们在凝胶中的迁移距离和选择性质。
二、的优缺点1.优点具有极高的分辨能力，在分离比较小的DNA片段方面具有明显的优势。
另外，它较为灵活，可以根据样本的特性和需求来设计实验方案。
此外，这种技术实验成本不高，实验条件相对简单。
2.缺点的缺点在于，进行实验需要逐级递增加强电场，涉及到的专业知识比较复杂，操作门槛较高。
另外，由于DNA迁移距离与其电荷量和大小成反比，因此在进行分离的过程中，需要选定相应的凝胶浓度和电场，以克服基于这些因素引起的迁移距离不均的问题。
三、的应用1.在DNA分离中的应用在DNA分离中应用比较广泛，可以用来鉴定遗传变异、克隆DNA、以及构建DNA指纹等。
对于基因测序中所需的较长的DNA片段，也可以进行分离。
2.在RNA分离中的应用也可以应用于RNA分离领域，在这一领域中，它可以用来鉴定表达的不同等。
3.在蛋白质分离中的应用除了在DNA和RNA分离中的应用，还可以应用于蛋白质的分离中。
在蛋白质分离中，这项技术使用较少，但仍然具有应用潜力，可用于鉴定蛋白质降解产物等。
总结：在生物技术领域具有非常重要的意义。
其高分辨率、灵活性等特性，使得它可以在不同的领域进行应用。
虽然技术门槛相对较高，但它的优点仍然是非常显著的。
我们期待，在后续的发展研究中，会变得更加成熟，更加高效，并且得到更加广泛的应用。
脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%Brij58；0.2% 脱氧胆酸盐(Deoxycholate；0.5%十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl。
（生物秀实验频道 ）4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
脉冲场凝胶电泳的原理
条带变粗 ---减少上样量 条带拖尾或模糊---电场转换时间不适合，优化电 场转换时间、上样量太高，调整样品浓度 大片段DNA 不能有效分离---降低电压、延长电场 转换时间 条带弯曲---缓冲液缓冲能力下降，更换缓冲液、 上样时样品块被挤碎、泵速度太慢
脉冲时间
当电场方向发生改变, 大分子的DNA 便滞留在胶孔中, 直 至沿新的电场重新定向后, 才能继续向前移动,大分子DNA 重新定向需要的时间长 当DNA分子变换方向的时间小于脉冲周期时,DNA 就可 以按其分子量大小分开
改变脉冲时间
分离不同大小DNA
电压
最常用的电压是6V/cm，低电压时，迁移率与电 压成正比，想分离大分子DNA时一般选用低电压 和延长脉冲时间
1%的琼脂糖浓度最大可以分离3Mb的DNA片段 1.2–1.5%的琼脂糖浓度可以使片段更加紧密 0.5-0.9%的琼脂糖浓度可以分离片段更大的DNA片段， 不过条带很弥散
缓冲液和温度
温度越高，DNA移动速度越快，但是条带的 清晰度和分辨力明显下降。温度过高会导致 DNA带变形或解链。 最佳电泳温度是14 ℃ 最常用的电泳液是 0.5x的TBE buffer，有时 也可以用1.0x的TAE buffer代替
脉冲场凝胶电泳 (Pulsed Field Gel Electrophoresis ,PFGE)
用于分离大分子量DNA 片段的一种电泳方法。 PFGE 是通过脉冲电场方向、时间与电流大小交替改变完 成分离大分子DNA。
影响PFGE的因素
琼脂糖凝胶浓度
浓度越高，移动速度越慢，适合分离低分子量DNA 浓度越低，移动速度越快，适合分离高分子量DNA
脉冲场凝胶电泳(PFGE)
脉冲场凝胶电泳
报告人：吉尚雷 2013-03-13
一、原理
常规的电泳采用的是单一的均匀电 场，DNA分子经凝胶的分子筛作用由负 极移向正极。而脉冲场凝胶电泳(Pulse dfield gel electrophoresis，PFGE) 采用 了两个交变电场，即两个电场交替地 开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随 着电场的变化而改变。电场方向的交 替改变使大分子DNA得以分离。
普通凝胶电 泳
PFGE
二、PFGE在分子生物学中的应用
在普通的凝胶电泳中，大于10kb的 DNA分子移动速度接近，很难分离形成足 以区分的条带。脉冲场凝胶电泳可以用来 分离大小从10kb到10Mb的DNA分子 。主 要用于基因组DNDR-II脉冲场电取出凝胶，放在电泳槽中 适当位置。调节脉冲场电泳参数，4V/cm、 脉冲时间1-40s, 14℃ 电泳18h，泵 70。
将电泳完的凝胶用EB染色20min， 清水漂洗20min，置凝胶成像系统 中检测
四、影响PFGE的因素
1.琼脂糖凝胶浓度
低熔点琼脂糖是经过羟乙基化修饰的琼 脂糖，30℃左右成胶，熔点是65℃。熔化 温度低于大多数双链DNA熔点。这种性质可 以从凝胶中回收天然形式的DNA
1 PFGE是公认的比较繁琐耗时的技术。一次电泳至少需 要两天时间。 2 电泳带型易受人为等多种因素的影响，需要较高的技 术水平。 3 不能同时优化胶的每个部分的条带分布。 4 不能确切地认为相同大小的条带就是相同的DNA片段。 5 一个酶切位点的变化可能引起不止一个条带的变化。 6 PFGE分型技术在大肠杆菌O157：H7等细菌的分子生 物学分析中得到了广泛的应用。但有些菌种用PFGE是 不可分的。研究人员发现对于有广泛基因重组现象的 细菌，PFGE并不是一个适宜的分子分型工具。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一
种常用于分析测定大分子量DNA分子种类、外源DNA同源度、DNA长度等
实验的灵敏度相当高的一种电泳技术。
该技术是利用 DNA 分子在脉冲场
条件下的电泳运动，将不同类型的 DNA 集合体根据其分子质量分离而得
到细菌的 DNA 指纹图谱，从而用于基因检测、基因定位、系统发育研究、菌种识别、菌群分析、植物起源及食品安全检测等领域。
其实验原理是在
原电泳的基础上，增加了两个梯度磁场，形成脉冲场条件下，DNA 分子会
从均匀电荷有序分布转变为非均匀电荷分布，在脉冲场条件下，它会产生
不均匀向偏冲，从而实现对 DNA 集合体的分离，再加上同时对 DNA 分子
进行大量的微量操纵，有效的分离了DNA分子，使它们能够产生端粒酶消
化片段，最终可以经过比较求得大分子量DNA分子种类，外源DNA同源度、DNA长度等实验结果。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis ，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA 序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。
电泳结果通常是条带图谱。
该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。
通过分型可以鉴定比较菌株是否一致， 对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。
一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE 与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA 分子经凝胶的分子筛作用由负极移向正极。
而PFGE 采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA 分子的电泳方向随着电场的变化而改变。
正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA 得以分离。
图l 是根据Carle 和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1field gel electrophoresis ，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。
A 、B 代表两个交替开启和关闭的电场。
当A 电场开启时，B 电场关闭，DNA 分子从A 电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B 电场开启时，DNA 分子改变原来的运行方向，随B 电场由负极向正极移动。
这样，随着电场方向的交替变化DNA 分子 即呈“Z” 字形向前移动。
目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA 分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。
如果电场方向改变 DNA 分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。
这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA 分子必须相应地变化移动方向。
可以想象， 较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulse Field Gel Electrophoresis, PFGE），是一种通过交替改
变电场方向和大小等参数，使得大分子DNA在凝胶中得到更好的分离的电泳技术。
该技术
主要依靠电场对DNA分子的移动与定向拉伸，通过一系列的脉冲场控制形成脉冲态运动，
使DNA分子得到更广泛的电泳分离。
在经过凝胶电泳之后，得到的分离图谱呈现出一组带状分布的DNA分子，每条带都代
表着分子的大小。
DNA分子越大，迁移的速率就越慢，因此大的分子在凝胶上迁移的距离
要比小的分子短。
这个技术被广泛应用于基因编辑、基因检测和病原体的快速分型等领域。
实验中，将DNA分子高压加在凝胶中，通过影响电场的大小和方向，脉冲场凝胶电泳
可以将DNA分子拉伸成一系列不同长度的线条。
接下来应该是经过染色或者转移等方法，
对凝胶进行图像处理，得到DNA分子的带状图谱。
带状图谱中，每一条带代表一个不同的DNA分子长度，因此可以确定DNA的大小。
根据带的数量、大小和密度等参数，可以进一
步区分样品中不同的DNA分子。
需要注意的是，PFGE并不能很好地分离具有相同长度的DNA分子，因为它们将聚集成一个带状图。
但总的来说，PFGE是一种用于高分辨率DNA分离的强大工具，已被广泛用于研究多种生物学和医学问题，例如：身份鉴定、结构基因组学、基因突变分析等。
脉冲场凝胶电泳技术
5、 把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。 如果用的是10个齿的梳子，把标准菌株H9812加在 第1、5、10个齿上。 6、 用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在 室温下风干约3分钟。 7、 把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上， 并且胶块与胶槽的底面相接触。从胶槽的下部中央 缓慢到入100ml熔化的在55℃－60℃平衡的1％ SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在 室温下凝固30分钟左右。 8、 记录加样顺序。
多余的部分。
5、 保证胶块在液面下而不在管壁上。
6、 将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速
约170转/分钟。
7、 将纯水和TE放在50℃水浴摇床中预热。
三、洗胶块 1、 从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的 screened-cap。轻轻倒掉CLB。在实验台上轻磕管 底使胶块落在管底。 2、 每管中加入15ml预热的纯水。 3、 确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回 50℃水浴摇床中，摇10分钟。 4、 倒掉水，用纯水再洗一次。 5、 倒掉水，加入15ml预热的TE，在50℃的水浴 摇床中摇15分钟。 6、 倒掉TE，用TE重复洗三次，每次10－15分钟。 7、 倒掉TE，加入10ml TE，放在4℃冰箱保存备 用。
四、胶块内DNA的酶切 1、 在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及 H9812的名称。 2、 按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液，混匀。 试剂 µl/胶块 µl /10胶块 纯水 180µl 1800µl Buffer D 20µl 200µl 总体积 200µl 2000µl 注意：缓冲液要置于冰上。
调整至3.6~4.5。如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果
脉冲电场凝胶电泳及其应用
脉冲电场凝胶电泳及其应用脉冲电场凝胶电泳（Pulsed-field Gel Electrophoresis，简称PFGE）是一种高分辨率的凝胶电泳技术，广泛应用于基因组学、分子流行病学和疾病诊断等领域。
本文将介绍脉冲电场凝胶电泳的原理、实验步骤以及其在不同领域的应用。
一、原理脉冲电场凝胶电泳是基于传统凝胶电泳的基础上发展起来的一种技术。
其原理是利用不同方向的电场脉冲交替作用于DNA分子，使得DNA在凝胶中的运动方向改变，从而提高了分离效果。
在脉冲电场凝胶电泳中，常用的凝胶材料是琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶。
DNA样品首先经过酶切或限制性内切酶切割，然后将切割后的DNA片段进行电泳分离。
脉冲电场通常是由两个方向的电场脉冲交替作用产生的，这样就使得DNA在凝胶中呈现交错状的运动轨迹。
通过调整电场的强度和方向，可以实现对DNA片段的高效分离。
二、实验步骤脉冲电场凝胶电泳的实验步骤包括样品制备、琼脂糖凝胶制备、电泳条件设置和电泳结果分析等。
1. 样品制备：将待测DNA样品进行切割或限制性内切酶切，得到DNA片段。
2. 琼脂糖凝胶制备：将琼脂糖加热至溶解，然后冷却至约60°C左右，加入缓冲液和DNA样品，混合均匀后倒入电泳槽中。
3. 电泳条件设置：根据实验需要，设置电场的强度和方向。
通常情况下，电场强度为6 V/cm至8 V/cm，电泳时间为16小时至20小时。
4. 电泳结果分析：将凝胶取出，进行染色或杂交等处理后，通过紫外光照射或激光扫描等方式观察和记录DNA分子的迁移情况。
三、应用脉冲电场凝胶电泳在基因组学、分子流行病学和疾病诊断等领域具有广泛的应用。
1. 基因组学：脉冲电场凝胶电泳可用于基因组的拓扑结构研究、基因重排分析、基因突变检测等。
例如，通过脉冲电场凝胶电泳可以分析染色体的大小、数目和结构等信息，从而揭示基因组的组织和功能。
2. 分子流行病学：脉冲电场凝胶电泳可以用于病原微生物的分子流行病学研究。
脉冲交变电场凝胶电泳
脉冲交变电场凝胶电泳
脉冲交变电场凝胶电泳，简称PFG状态，它是一种应用于物质结构特征分析的
新技术。
它利用不均匀的电场，具有特定的强度和取向，将大分子物质的极性分出，完成分子的凝胶电泳分类。
PFG状态主要是通过脉冲发生器发出的电场来把大分子
物质拆分为正负电荷单位，然后再用凝胶电泳把它分离出来。
它可以在低温环境下，特别是非常低温环境下，从而避免蛋白质酶在正常温度下发生降解和改变。
这就是最大的优点。
此外，PFG状态采用快速、横向和可定制的能力，加快了物质分析的板块，是
目前研究和应用应用最多的技术之一。
PFG状态的优势在于它可以精确控制电场的
参数，以获得最佳的物质分类结果。
PFG状态还使用有限的共軛條件来准确分析结
构物，缩短了研究过程，大大提高了效率。
最后，脉冲交变电场凝胶电泳不仅可以解析物质结构，还可以用于活体样品的
分析，从而更进一步提高研究结果的准确性。
此外，随着不断的技术的发展，脉冲交变电场凝胶电泳的技术性能将不断提高，并且应用范围将进一步拓宽。
总之，脉冲交变电场凝胶电泳技术拥有出色的性能，开发出的仪器和仪器将深受市场的青睐。
脉冲场电泳仪操作规程
脉冲场电泳仪操作规程1 .在电泳槽内加入约2.2升合适的电泳缓冲液。
2 .打开主机开关，待主机自检结束后，打开循环泵开关，使电泳缓冲液开始循环，泵的速度设在“70”左右。
然后开启冷凝系统开关，按“settemp”键设置所需电泳温度，按“actua 1temp”显示实际温度。
3 .灌胶，等胶凝固后，上样4 .待电泳缓冲液到达设置的温度后，将加好样的凝胶连同底座一起放入电泳槽内的黑色方框内，并保证电泳缓冲液超过胶面b2≡ι,盖好电泳槽盖5 .在主机上设置电泳程序，先选择采用哪种类型程序，例如最常用的TWoState 方法：FIGETWOSTATEMU1TISTATE(1)按TWOSTATE 键，屏幕显示a Youwi11destroythe1astprogram-Goon?"，输入"1”确认后，系统显示AUrO A1GORITHM ⅛/一、Gradient≡[]V∕cmRunTime≡[]Inc1udedAng1e=[ ]0输入相应的参数后，按ENTER键,屏幕显示输入相应的参数后，按ENTER键确认(其中RamPingfactor默认是线性增长，如果欲采用默认值直接回车即可)。
CHEFMapper屏幕会显示AProgramisinmemory.P1easeenteranothercommand.若需存储程序，按SToREPGM 进行存储。
按STARTRUN即开始运行，此时可观察到电泳槽内电极开始出现气泡。
(2)如选用autoa1gorithm方法，按“autoa1gorithm,,键,键入欲得到的线性范围的最大片段和最小片段的kb数，确认所有给出参数，按“startrun”键，即可进行电泳。
(3)如选用MUItiState及FIGE方法,请参阅说明书。
6.电泳开始后，“highVo1tage”灯亮，此时切不可打开电泳槽盖进行操作，以免发生触电危险。
7.电泳结束后，"highVoItage”灯灭。
脉冲电场凝胶电泳
脉冲电场凝胶电泳引言脉冲电场凝胶电泳是一种常用的生物分子分离和分析技术。
它利用凝胶的孔隙结构和电场的作用，在不同大小和电荷的生物分子之间实现分离。
本文将全面、详细、完整地探讨脉冲电场凝胶电泳的原理、应用、优缺点等方面内容。
原理1. 凝胶基质凝胶基质在脉冲电场凝胶电泳中起到了重要的作用。
凝胶可以是聚丙烯酰胺（polyacrylamide）或琼脂糖（agarose）等材料制成的。
凝胶的孔隙结构可以根据精确的浓度和固化条件来调控，从而实现对不同大小分子的分离。
2. 电场作用脉冲电场是脉冲电场凝胶电泳的核心。
通过在凝胶两端施加电场，带电生物分子将受到电场力的作用而在凝胶中运动。
根据生物分子的电荷大小和大小等因素，不同分子会以不同速度迁移，从而实现分离。
3. 可视化方法分离完成后，需要对生物分子进行可视化。
一种常用的方法是使用DNA或蛋白质染料来染色，如乙溴化乙锭（ethidium bromide）等。
通过紫外光照射，染色的生物分子将呈现出特定的荧光或色带，便于观察和记录。
应用脉冲电场凝胶电泳在生物科学研究中有着广泛的应用。
1. DNA分析脉冲电场凝胶电泳可以用于DNA分析，如DNA片段的大小分离、DNA测序等。
通过将PCR扩增产物或限制性内切酶切割的DNA样品经过脉冲电场凝胶电泳的分离，可以得到DNA的大小分布图谱，进而对DNA进行分析和研究。
2. 蛋白质分析脉冲电场凝胶电泳也可以用于蛋白质的分离和分析。
蛋白质样品经过电泳分离后，可以通过染色和荧光成像等方法观察和记录蛋白质带的位置和分布。
进一步可以进行蛋白质质量测定、蛋白质结构和功能的研究等。
3. 检测突变脉冲电场凝胶电泳在检测突变上也有着重要的应用。
通过将突变位点的DNA样品与野生型的DNA样品分离，可以方便地鉴定突变位点和分析突变的类型和数量。
优缺点1. 优点•分辨率高：脉冲电场凝胶电泳可以实现生物分子的高分辨率分离，对于大小相近的分子也有很好的分辨能力。
脉冲电场凝胶电泳
脉冲电场凝胶电泳1. 介绍脉冲电场凝胶电泳（Pulsed-field Gel Electrophoresis，简称PFGE）是一种用于分离、检测和鉴定大分子DNA的技术。
它通过在凝胶中施加脉冲电场，利用DNA 分子在电场作用下的迁移速度差异来实现DNA分离。
2. 原理PFGE的原理基于DNA分子在脉冲电场中的迁移速度与其大小有关。
在传统的水平凝胶电泳中，小分子DNA会快速迁移，而大分子DNA由于受到凝胶孔隙限制而迁移较慢。
然而，在一定的时间尺度内，大分子DNA可能无法完全穿过凝胶网络，导致其无法被有效分离。
为了解决这个问题，PFGE引入了脉冲电场。
它通过交替改变电场方向和强度来创造一个“混合模式”，使得大分子DNA能够在不同方向上进行迁移，并最终穿过凝胶网络。
这种方式可以有效地增加大分子DNA的迁移距离，从而实现对大片段DNA 的高效分离。
3. 实验步骤3.1 制备凝胶需要制备PFGE所需的琼脂糖凝胶。
通常使用琼脂糖浓度较高的凝胶（通常为1-2%），以增加凝胶网络的致密程度。
3.2 DNA提取从待检测样品中提取待测DNA。
可以使用常规的DNA提取方法，例如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。
3.3 准备DNA样品将提取得到的DNA进行适当的处理和纯化，以去除杂质和降解产物。
可以通过酶处理、有机溶剂萃取或商用纯化试剂盒等方法进行。
3.4 打孔和载入DNA将处理后的DNA溶液加入到琼脂糖凝胶孔中。
为了确保DNA在电泳过程中不会由于重力而下沉，可以在凝胶上方放置一层透明塑料薄膜，并用夹子固定。
3.5 脉冲电场电泳将装有DNA样品的琼脂糖凝胶放置在电泳槽中，并加入适当的缓冲液。
将电泳槽连接到电源上，并设置合适的电场参数，如电压、脉冲时间和脉冲方向等。
3.6 可视化和分析电泳结束后，可以使用DNA染料（如乙溴黄）对凝胶进行染色，并使用紫外线照射仪观察DNA分离结果。
通过比较不同样品的DNA迁移距离和带状图案，可以分析样品中的DNA差异。
脉冲场电泳
脉冲场凝胶电泳- 高分子量DNA琼脂糖凝胶块制备和加工1．收集10ml全血，加入30ml细胞裂解液。
置冰浴中至少20min直至红细胞完全溶解。
2．2000r/min离心10min，移去红色上清液，再次用细胞裂解液洗涤细胞，然后用PBS重悬细胞。
3．稀释单细胞悬液并取一小份用Neubauer腔计数细胞。
4．用PBS重悬细胞，以达到40μl PBS中含1百万个细胞比例（1百万个二倍体哺乳动物大约含有基因组DNA 10μg）5．用PBS配制2％浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50℃。
6．将等体积（各1ml）细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀，立即倒入凝胶块模具中。
7．静置20min让琼脂糖固化，用无菌塑料杯（通常用作划菌）将凝胶块自模具中取出并置入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml的蛋白酶K。
8．将带有凝胶块的蛋白酶K缓冲液于50℃保持2～3天。
每个盛有50ml蛋白酶缓冲液的Falcon管可容纳多达100个凝胶块。
9．蛋白酶K消化后，可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4℃。
10．此外，继续将凝胶块用高压消毒过的TE缓冲液冲洗数遍的步骤。
11．将凝胶块放入装有TE及0.04mg/ml PMSF溶液的Falcon试管中，灭活残留的蛋白酶K。
12.室温下用TE溶液漂洗凝胶块数次,将凝胶块放入另一干净的试管，可直接用于酶切反应或用0.5mol/L EDTA，（pH8.0）4℃保存凝胶块。
13．若用EDTA保存凝胶块，取出后应用TE溶液室温下漂洗30 min×2次。
脉冲场凝胶电泳- 大小标准物的制备λ多联体1．以TE缓冲液悬浮λ多联体（Boehringer MA宝灵曼公司产品），浓度为4μg/40μl。
2．用等体积TE配制的2％低熔点琼脂糖（温度保持在45℃）混匀。
3．移去混合液注入预冷的凝胶块模具中。
4．室温下用TE及100 mmol/L NaCl溶液温育2天。
酵母染色体1．从YPD（酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖）培养基瓶皿中挑选单一克隆加入10ml YPD预培养的肉汤中，30℃下剧烈震荡生长24小时，然后加入200ml YPD肉汤，剧烈振荡24～48h（产量大约100块）。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶系统操作规范文件编号：VBQW11##-##版本号：A0制定：制定日期：审核：审核日期：批准：批准日期：颁发部门：质量保障中心发行日期：文件更改记录版本号发行日期变更原因、依据及详细变更内容制定人分发部门具体部门目录1. 目的 (4)2. 适用范围 (4)3. 职责 (4)4. 操作规范 (4)4.1 简介 (4)4.1.1. 技术原理 (4)4.1.2 主要仪器设备和试剂 (4)4.2 准备工作 (5)4.3 灌胶 (5)4.4 上样 (6)4.5 主机程序设置 (6)4.6 凝胶染色和观察 (6)4.7 电泳槽清理 (7)5. 注意事项 (8)6. 常见故障及解决方法 (8)7. 关于参数设置的几点建议 (9)8. 试剂配制 (11)1.目的指导技术员规范地使用脉冲场凝胶系统。
2.适用范围本标准适用于利用脉冲场凝胶系统对相关产品进行检测。
3.职责分子部门负责本文件的编写，质量保障部及检验人员负责本标准的监督。
4.操作规范4.1简介4.1.1. 技术原理常规的琼脂糖凝胶电泳采用单一的均匀电场，一定大小的线状DNA分子经凝胶的分子筛作用以一定的速率由负极向正极移动。
但当DNA分子的长度超过一定极限后，其迁移率于则于分子大小无关，而主要是决定于电场强度。
实践表明，长度大于50kb的DNA不能在恒场强的琼脂糖凝胶电泳中较好的分离。
脉冲场凝胶系统(Pulsed field gal electrophoresis, PFGE)正好解决这一问题。
PFGE采用两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，DNA的电泳方向随着电场的变化而改变，大分子的DNA得以分离。
严格来讲，“脉冲”场电泳有些用词不当，应称作“交替”场电泳。
电场变换方向的间隔时间为脉冲时间，其分为从数秒到几小时。
通常脉冲时间越长分辨的DNA片段越长。
图一. 脉冲场电泳交变示意图图一是根据Carle和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1 field gel electrophoresis，OFAGE) 绘制的PFGE示意图。
脉冲场凝胶电泳原理
脉冲场凝胶电泳原理嘿，咱聊聊脉冲场凝胶电泳这神奇的玩意儿！这脉冲场凝胶电泳啊，那可真是个厉害的角色。
就好像一位超级侦探，能在微观世界里找出各种秘密。
它是咋工作的呢？简单来说，就是让DNA 分子在特殊的电场中“奔跑”。
这可不是普通的跑哦，是一种有策略的“长跑”。
普通的电泳呢，就像让一群人在直道上跑，跑得快的很快就冲出去老远，跑得慢的就落在后面，最后全乱了套。
可脉冲场凝胶电泳不一样，它就像是给这些DNA 分子设置了一个迷宫赛道。
一会儿这边通电，一会儿那边通电，让DNA 分子不得不拐着弯地跑。
这样一来，不同大小的DNA 分子就会根据自己的“步伐”和“耐力”，逐渐分开。
你想想，那些巨大的DNA 分子，平时就像一群懒洋洋的大象，很难被分开。
但脉冲场凝胶电泳有办法，它不断地变换电场方向，就像在赶着大象走不同的路。
小一点的DNA 分子呢，就像灵活的小兔子，跑得比较快，但也得跟着电场的变化调整自己的路线。
在这个过程中，可不能小瞧了那些电场。
它们就像是一双双无形的大手，推着DNA 分子往前走。
有时候强，有时候弱，让DNA 分子一会儿加速，一会儿减速。
这就好比我们玩的跷跷板，一会儿这边高，一会儿那边高，保持着一种动态的平衡。
而且啊，脉冲场凝胶电泳的精度那是相当高。
它能把那些看起来差不多的DNA 分子分得清清楚楚。
这就像一个超级细心的画家，能把每一根线条都画得恰到好处。
比如说在研究细菌的基因组的时候，脉冲场凝胶电泳就能发挥大作用。
细菌的基因组虽然小，但也有各种各样的结构。
通过脉冲场凝胶电泳，我们可以清楚地看到不同细菌的基因组有哪些不同，就像分辨不同人的脸一样容易。
还有啊，在医学研究中，脉冲场凝胶电泳也功不可没。
它可以帮助医生们找出一些疾病的病因。
比如说某些遗传病，可能就是因为DNA 分子出现了问题。
通过脉冲场凝胶电泳，医生们就能像侦探一样，找到那些有问题的DNA 片段，从而更好地治疗疾病。
再想想，如果没有脉冲场凝胶电泳，我们对很多生命现象的理解可能还停留在表面。
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脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理
脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理大致为:
细菌包埋于琼脂块中,用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切,酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。
PFGE中内切酶的选用至关重要,所采用的内切酶常为寡切点酶(low frequency cleavage restriction endonucleases),这种酶切后的片段少而大,适合于作PFGE电泳。
McClelland等[8]通过对细菌的PFGE 电泳图谱的内切酶的选择研究发现,四核苷酸CTAG在许多GC含量>45%的细菌染色体中是很少见的,在他们所试验的16个细菌的染色体中,被1个或多个可识别CTAG位点的内切酶酶切,每100000ｂｐｓ中不到一次,这些酶的识别序列分别为:XbaI(TCTAGA), SepI(ACTAGT),AvrII(CCTAGG)和NheI(GCTAGC)。
同样地,在许多含
Ｇ+Ｃ<45%的基因组,CCG和CGG更少。
这样用SmaI(CCCGGG)、RsrII(CGGWCCG)、NaeI(GCCGGC)和SacII(CCGCGG)进行酶切,对产生平均超过100000bps片段是非常合适的。
对PFGE结果的观察,可因不同研究者而出现较大差异,据此,Tenover 等[6]经过多年的研究提出了PFGE的解释标准:(1)相同(indistinguishable):酶切图谱间有同样的条带数,且相应条带大小相同,流行病学上则认为相同,这种经PFGE证实的结果,用其它方法检测不可能显示实质性的差异。
(2)紧密相关(closely related): PFGE试验中,其它克隆株与暴发克隆株有一致的单一基因事件的改
变,如点突变、插入或ＤＮＡ缺失。
典型的情况下,这种变化可导致2～3条带的差异,当一些分离菌株被多次重复培养或自同一病人多次分离时可观察到这种现象。
(3)可能相关(possibly related):两个独立的基因情况所致的一致的差异,如出现了4～6条带差异,此时能用简单的插入或ＤＮＡ缺失或限制性位点的获得或缺失来解释。
这些菌株与暴发株间遗传基因不紧密相关,流行病学上也不大可能相关,在长于6个月时间及大范围的暴发中收集的菌株可出现这类情况。
(4)不相关(unrelated):1个分离菌株通过3个更多个独立的基因事件所致的一致的改变,其PFGE图谱与暴发克隆株样式不同,则可认为与暴发克隆株不相关(一般总有7个或更多个条带的差异)。
典型情况下,这一分离株常只有少于50%的良好的分离的片段出现在暴发株图谱样式中。