脉冲场凝胶电泳实验流程
大肠杆菌、沙门氏菌和志贺杆菌PFGE标准操作
1、 确保电泳槽是水平的。如果不水平，调整槽底部的旋钮。 注：不要触碰电极。 2、 加入 2-2.2L 0.5×TBE,关上盖子。 3、 打开主机和泵的开关，确保泵设在－70（这时缓冲液的流速约 1L/分钟）和 缓冲液在管道中正常循环。
4、 打开冷凝机， 确保预设温度在 14℃ （缓冲液达到该温度通常约需要 20 分钟） 。 5、 打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸清除胶四周和底面多余的胶， 小心的把胶放入电泳槽，关上盖子。 6、 设置电泳参数。 （1）沙门菌属以 XbaⅠ或 AvrⅡ（BlnⅠ）酶切，电泳条件相同。 CHEF Mapper: Auto Algorithm 30kb ——low MW（最小分子量） 700kb ——high MW（最大分子量） 按“enter”选择程度默认值 run time（电泳时间）改为 18-19h （默认值： initial switch time （初始转换时间） =2.16s； final switch time（终末转换时间）=63.8s） CHEF DR-Ⅲ： Initial switch time: 2.2s Final switch time: 63.8s Voltage: 6v Included Angle: 120° Run time：18-19h （2） 大肠杆菌 O157 和宋内志贺菌 XbaⅠ或 AvrⅡ （BlnⅠ） 酶切， 电泳条件相同。 CHEF Mapper: Auto Algorithm 30kb ——low MW（最小分子量） 600kb ——high MW（最大分子量） 按“enter”选择程度默认值 run time（电泳时间）改为 18-19h （默认值： initial switch time （初始转换时间） =2.16s； final switch time（终末转换时间）=54.17s） CHEF DR-Ⅲ：
PFGE实验的标准流程
大肠杆菌0157、沙门菌和痢疾杆菌脉冲场凝胶电泳实验步骤提前准备从检测培养基上挑取单菌落，接种于含5%去纤维蛋白羊血的胰化大豆琼脂（TSA-SB）平板（或相当的培养基）上培养，37℃孵育箱培养14-18小时；用同一个接种针/环,穿刺或接种于小螺帽管中的TSA、HIA或相似培养基，以保证必要时重复检测同一个克隆。
同时接种标准株H9812。
第一天步骤1 细菌的包埋1、打开水浴摇床（54℃）、水浴箱（56℃）。
2、用TE缓冲液（具体试剂配方见附件）制备1%Seakem Gold:1%SDS琼脂糖.以配置25ml体积为例说明,方法如下:1)准确称取0.25g Seakem Gold agarose,放入250ml的蓝盖瓶中.2)加入22.5mlTE缓冲液,轻柔摇荡瓶子使琼脂均匀散开.3)微松盖瓶,将玻璃瓶放入微波炉内搞活加热30秒,取出轻柔摇荡,再次加热30秒,重复操作直至琼脂彻底溶解(无颗粒物、悬浮物、透光均一，无明显异常折光，无气泡)4)将溶解的Seakem Gold agarose放入56℃（55-60℃均可）水浴箱内至少15分钟，再加入预热到56℃的10%SDS溶液2.5ml,置于56℃水浴箱备用.3、在Falcon2054管(或其他相当的管)上标记样品名称和空白对照;在1.5ml微量离心管上标记好对应样品的名称.4、在Falcon2054管中分别加入约2ml细胞悬浊液CSB(配方见附件).注:使用测定细菌浓度的容器不同加入CSB的量也不同.5、用CSB湿润棉签，从培养皿上刮去适量细菌，均与悬浊于CSB中。
通过加入CSB稀释或增加菌量提高浓度，调整细胞悬液浓度至指定范围。
1）用比浊仪（bioMerieux Vitek colorimeter）测其浓度,并调整浓度至4.0-4.5麦氏单位.2）用分光光度计时,在610nm波长吸光度应在1.3-1.4.3）Dade Microscan Turbidity Meter:0.48-0.52(以Falcon2054管测量) 0.68-0.72(以Falcon2057管测量)注:在 4.0-4.5该范围内细菌的浓度都可得到较满意的实验结果,但过大的浓度差距会造成同一块胶上的条带亮度差异,影响条带的识别.6、取400ul细菌悬浊液于相应的1.5ml微量离心管中,置于37℃水浴中孵育5分钟.将剩余的细菌悬浊液置于冰上知道胶块制备完毕.7、从水浴箱中取出微量离心管,没管加入20ul蛋白酶K(储存液浓度20mg/ml)混匀,使其终浓度为0.5 mg/ml,蛋白酶K置于冰上备用.8、加入400ul的1%Seakem Gold:1%SDS到上述装有400ul细菌悬液的微量离心管内,用枪头轻轻混匀,避免有气泡产生.(此时1%Seakem Gold:1%SDS需置于56℃水浴中)9、迅速将混合物加入模具,避免气泡产生,在室温下凝固10-15分钟.为节省时间也可以在4℃下凝固5分钟.10、记录好模具内对应样品的名称。
凝胶电泳制胶
凝胶电泳制胶凝胶电泳制胶是一种常用的实验方法，用于分离和检测DNA、RNA或蛋白质等生物分子。
本文将介绍凝胶电泳制胶的原理、步骤和应用。
一、原理凝胶电泳制胶主要基于凝胶的特性。
凝胶是一种高分子物质，可以形成三维网络结构，使分子在其内部进行分离。
常用的凝胶材料有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和琼脂糖-聚丙烯酰胺复合凝胶等。
在凝胶电泳制胶过程中，首先将凝胶原液均匀地注入制胶模具中，然后在模具两侧固定导电板，使之与电源相连。
接着，待凝胶完全凝固后，取下模具，即得到凝胶板。
二、步骤凝胶电泳制胶的步骤如下：1. 准备制胶模具：选择适当的模具尺寸和形状，常见的有平板模和斜板模。
清洗模具并涂抹硅油，以便取出凝胶。
2. 制备凝胶原液：根据实验需求选择适当的凝胶材料，如聚丙烯酰胺凝胶。
根据所需凝胶浓度，称取凝胶原液和缓冲液，混合均匀。
3. 注入凝胶原液：将凝胶原液缓慢均匀地注入制胶模具中，注意不要产生气泡。
4. 固化凝胶：待凝胶原液完全凝固后，取下制胶模具。
可将凝胶板浸泡在缓冲液中，以去除残留的离子。
5. 凝胶电泳操作：将待测样品加入凝胶槽中的样品孔，接通电源进行电泳。
根据需要选择合适的电压和时间。
6. 凝胶染色和观察：电泳结束后，可以通过染色方法对分离的分子进行染色，如乙溴化乙锭染色。
然后使用透射式或反射式凝胶电泳成像仪观察和记录结果。
三、应用凝胶电泳制胶广泛应用于生物学、分子生物学、遗传学等领域，常见的应用有：1. DNA分离和检测：凝胶电泳制胶可用于分离不同长度的DNA片段，并通过染色或探针杂交等方法检测目标DNA。
2. RNA分析：通过凝胶电泳制胶，可以分离和检测不同长度的RNA 分子，用于研究基因表达和调控等方面。
3. 蛋白质分离和鉴定：凝胶电泳制胶可用于分离和检测不同大小和电荷的蛋白质，常用于蛋白质组学研究和蛋白质鉴定。
4. 分子标记和DNA测序：凝胶电泳制胶可用于分离和检测DNA分子标记，如DNA大小标记和DNA测序。
202X年脉冲场凝胶电泳(1)
2) 噬菌体载体DNA的分离
纯净病毒颗粒 病毒载体DNA
M13mp载体可采用质粒DNA的分离方法
第十二页，共三十八页。
二、RNA的分离与纯化
1. 制备RNA的关键—防止内外源RNase的作用
1) RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围; 抗高温严寒 (0~65℃均具活性）；抗变性剂
单子叶植物 151（玉米）~182kb（浮萍） 藻类 132（裸藻）~191kb（衣藻）
第八页，共三十八页。
1) DNA分离纯化过程
破碎细胞 + DNA抽提液(EDTA、去污剂、还原剂) 65℃温育
20’
冰浴冷却 离心去细胞碎片 苯酚抽提法①
CsCl密度梯度离心②
1) 苯酚抽提法 上清液 缓冲液用水饱和苯酚抽提2~3次 上层液相用氯仿抽 至界面无蛋白变性物 上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀 沉 淀物用70%冷乙醇洗涤,干燥 溶于缓冲液 加入RNAase处理 除去RNA 苯酚氯仿抽提 沉淀干燥
2) 按电泳装置分: 水平式/琼脂糖凝胶; 竖式/聚丙烯酰胺凝胶
3) 两种方法比较：分离效果和分离范围; 操作难易
2. 用途
琼脂糖凝胶用于DNA和RNA的常规(chángguī)分析；聚丙烯酰胺凝胶常 用于小分子核酸分析。
3. 凝胶电泳的一般程序
制胶 点样 电泳 染色 观察
二、DNA电泳
1. DNA分子种类
288 kb
痘病毒
196 kb
质体 几~100以上kb
线粒体
藻类 线状
15kb
酵母 环状
19~78 kb
脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%Brij58；0.2% 脱氧胆酸盐(Deoxycholate；0.5%十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl。
（生物秀实验频道 ）4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
7 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品。
8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。
90.5μg/mL 溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一
种常用于分析测定大分子量DNA分子种类、外源DNA同源度、DNA长度等
实验的灵敏度相当高的一种电泳技术。
该技术是利用 DNA 分子在脉冲场
条件下的电泳运动，将不同类型的 DNA 集合体根据其分子质量分离而得
到细菌的 DNA 指纹图谱，从而用于基因检测、基因定位、系统发育研究、菌种识别、菌群分析、植物起源及食品安全检测等领域。
其实验原理是在
原电泳的基础上，增加了两个梯度磁场，形成脉冲场条件下，DNA 分子会
从均匀电荷有序分布转变为非均匀电荷分布，在脉冲场条件下，它会产生
不均匀向偏冲，从而实现对 DNA 集合体的分离，再加上同时对 DNA 分子
进行大量的微量操纵，有效的分离了DNA分子，使它们能够产生端粒酶消
化片段，最终可以经过比较求得大分子量DNA分子种类，外源DNA同源度、DNA长度等实验结果。
鲍曼不动杆菌脉冲场凝胶电泳实验步骤
鲍曼不动杆菌脉冲场凝胶电泳标准操作程序生物安全警告：所操作菌为条件致病菌，请按二级生物安全水平操作，转移和操作活菌时更要注意。
处理大量菌株，请在生物安全柜中进行。
以正确方式对接触培养物的塑料制品和玻璃制品进行消毒或丢弃。
开始操作之前，请阅读所有指导。
把所有接触过细胞悬液或凝胶块的塑料制品、玻璃制品、吸管、小铲等当作污染材料，按照实验室的生物要求丢弃或消毒。
可重复使用的制胶模具须在清洗前消毒；可丢弃的制胶模具及胶带和用来把凝胶块从样品孔中推出的小片，应该用10%漂白剂消毒30分钟以上，然后清洗和重复使用。
提前准备从检测培养基上挑取单菌落，接种于营养琼脂平板（或相当的培养基）上培养；用同一个接种针/环，穿刺或接种于小螺帽管中半固体培养基，以保证必要时重复检测同一个克隆。
37℃培养14-18小时。
第一天1、打开水浴摇床（54℃）、水浴箱（56℃）。
2、用TE缓冲液（具体试剂配制方法见附件）制备1%Seakem Gold：1%SDS琼脂糖，以配制25ml体积为例说明，方法如下：1）准确称取0.25g SeaKem Gold agarose, 放入250ml的蓝色瓶内。
2）加入22.5ml TE缓冲液，轻柔摇荡瓶子使琼脂均匀散开。
3）微松瓶盖，将玻璃瓶放于微波炉内高火加热30秒，取出轻柔摇荡，再次加热30秒，重复操作直至琼脂彻底溶解（无颗粒物、悬浮物，透光均一，无明显异常折光，无气泡）。
4）将溶解的SeaKem Gold agarose放入56℃（55-60℃均可）水浴箱内至少15分钟，再加入预热到56℃的10%SDS溶液2.5ml，置于56℃水浴箱备用。
3、在Falcon 2054管（或其他相当的管）上标记样品名称和空白对照；在1.5ml微量离心管上标记好对应样品的名称。
4、在Falcon 2054管中分别加入约2ml细胞悬浊液CSB（配制方法见附件）。
注：使用测定细菌浓度的容器不同加入CSB的量也不同。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulse Field Gel Electrophoresis, PFGE），是一种通过交替改
变电场方向和大小等参数，使得大分子DNA在凝胶中得到更好的分离的电泳技术。
该技术
主要依靠电场对DNA分子的移动与定向拉伸，通过一系列的脉冲场控制形成脉冲态运动，
使DNA分子得到更广泛的电泳分离。
在经过凝胶电泳之后，得到的分离图谱呈现出一组带状分布的DNA分子，每条带都代
表着分子的大小。
DNA分子越大，迁移的速率就越慢，因此大的分子在凝胶上迁移的距离
要比小的分子短。
这个技术被广泛应用于基因编辑、基因检测和病原体的快速分型等领域。
实验中，将DNA分子高压加在凝胶中，通过影响电场的大小和方向，脉冲场凝胶电泳
可以将DNA分子拉伸成一系列不同长度的线条。
接下来应该是经过染色或者转移等方法，
对凝胶进行图像处理，得到DNA分子的带状图谱。
带状图谱中，每一条带代表一个不同的DNA分子长度，因此可以确定DNA的大小。
根据带的数量、大小和密度等参数，可以进一
步区分样品中不同的DNA分子。
需要注意的是，PFGE并不能很好地分离具有相同长度的DNA分子，因为它们将聚集成一个带状图。
但总的来说，PFGE是一种用于高分辨率DNA分离的强大工具，已被广泛用于研究多种生物学和医学问题，例如：身份鉴定、结构基因组学、基因突变分析等。
脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA一般长度超过20kb，在某些情况下，超过40kb在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10〜2000kb之间的DNA片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显着地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE 设备能把大小范围在10〜2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris ，pH7.5；0.15mol/LNaCl ；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris ，pH7.5；lmol/L NaCl ；0.5%4ESP缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，Img/mL蛋白酶K。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
7 胶模( 由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。
90.5匕g/mL溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。
分子克隆3—DNA凝胶电泳和脉冲场琼脂糖凝胶电泳
分子克隆3—DNA凝胶电泳和脉冲场琼脂糖凝胶电泳方案1.琼脂糖凝胶电泳方案2.琼脂糖凝胶中DNA的检测方案3.琼脂糖凝胶中DNA的回收：DEAE-纤维素膜电泳方案4.琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺中DNA的回收：电泳洗脱至透析袋方案5.阴离子交换色谱纯化从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶回收的DNA 方案6.低熔点琼脂糖凝胶中DNA的回收：有机溶剂抽提·替代方案：用玻璃珠从琼脂糖凝胶中回收DNA方案7.低熔点琼脂糖凝胶中DNA：用琼脂糖酶消化方案8.碱性琼脂糖凝胶电泳·附加方案：碱性琼脂糖凝胶的放射自显影方案9.中性聚丙烯酰胺凝胶电泳方案10.聚丙烯酰胺凝胶中DNA的染色检测方案11.聚丙烯酰胺凝胶中DNA的放射自显影检测方案12.聚丙烯酰胺凝胶中DNA片段的回收：压碎与浸泡法脉冲场凝胶电泳（方案13~20）方案13.脉冲场凝胶电泳制备DNA：哺乳动物细胞和组织DNA的分离方案14.脉冲场凝胶电泳制备DNA：酵母完整DNA的分离方案15.琼脂糖凝胶中DNA的限制性内切核酸酶消化方案16.脉冲场凝胶电泳的分子质量标准方案17.横向交变场的脉冲场凝胶电泳方案18.箝位匀强电场的脉冲场凝胶电泳方案19.脉冲场凝胶中DNA片段的直接回收方案20.脉冲场凝胶中浓缩DNA片段的回收琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分离、鉴定和纯化DNA片段。
该技术的优点：[1].操作简单而迅速，能分离用其他方法不能满意分离的片段；[2].凝胶DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料直接观察到[3].这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种目的。
[4].琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶能灌制成各种形状、大小、孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。
这些参数或条件的选择主要取决于被分离DNA 片段的大小。
A.聚丙烯酰胺凝胶：[1].适用范围：1.)最适合分离小片段DNA（5~500bp）；2.)聚丙烯酰胺凝胶电泳是在恒定电场中垂直方位上进行的。
脉冲场凝胶电泳试验流程
脉冲场凝胶电泳实验流程一、准备样品1. 琼脂糖包埋的样品常用的DNA提取方法不能得到完整的大分子量DNA。
大分子量DNA很脆弱，在制备过程中容易因移液等操作造成机械剪切。
将完整细胞包埋入琼脂糖后再进行裂解，去除蛋白的操作，可防止大分子量DNA的断裂。
琼脂糖块包埋的DNA可以避免被机械剪切，并且是一种简单的操作方法。
处理过的包埋有DNA的琼脂糖块可以直接放入琼脂糖凝胶的点样孔。
在将细胞包埋入琼脂糖之前要先确定细胞浓度，尽管吸光度很常用，但是并不可靠。
单位吸光度对应的细胞浓度会因菌株不同或培养基不同而有差异。
这会影响琼脂糖块中DNA的含量，导致上样量过大或不足。
不论细菌、真菌还是哺乳动物细胞，使用血球计数板均可得到准确和高重复性的细胞浓度。
Bio-Rad提供一次性的样品模具（货号：170-3713）。
每个模具可制备50个10 x 5 x 1.5 mm的琼脂糖胶块。
样品制备过程中的酶可以快速有效的扩散进入胶块，用Bio-Rad标准梳子制胶，胶块不需要修剪就可直接放入点样孔。
2. 液体样品小于200kb的DNA片断可以不用琼脂糖包埋，可直接以液体形式加入点样孔。
当操作的DNA大于50kb时，必须用大开口的吸头。
如果只电泳液体样品，使用厚度0.75 mm的梳子可以获得更锐利的条带和更高的分辨率。
3. 制备琼脂糖包埋的哺乳动物DNA该方法中用到的缓冲液，酶和琼脂糖均包含于试剂盒CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit （货号：170-3591）。
1)将细胞悬浮于等渗盐溶液或不含血清的培养基中并置于冰上。
用血球计数板对细胞计数，每毫升琼脂糖块需要5 x 107个细胞，每个10 x 5 x 1.5 mm的样品块需要0.1 mL琼脂糖。
2)准备2% CleanCut™琼脂糖（货号：170-3594），用微波炉融化并置于50 °C水浴。
3)1000g、4 °C离心细胞悬液5分钟，用琼脂糖块一半体积的细胞悬浮缓冲液（10 mM Tris, pH 7.2,20 mM NaCl, 50 mM EDTA）重悬细胞并置于50 °C水浴。
PFGE（脉冲场凝胶电泳）标准操作规程（SOP）
PFGE（脉冲场凝胶电泳）标准操作规程（SOP）PFGE（脉冲场凝胶电泳）标准操作规程(SOP)关键词：PFGE，脉冲场凝胶电泳目的：运用PFGE方法对20Kb至数Mb的DNA进行分子分型图谱分析：采用“PFGE脉冲场凝胶电泳分子分型识别系统”（官微：PFGE_CHINA）进行图谱分析。
系统主要功能是PFGE图谱分子分型在线识别和处理，提供二叉层级聚树，MLVA、MLST字符类型的最小生成树，SEQUENCE基因片段类型的亲缘树计算和图形绘制，用于分析菌株之间的相关性，协助追踪感染来源以及有效控制疫情。
第一天一、胶块的制备1、在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，分别加入约2ml细胞悬浊液（CSB）；2、在1.5ml eppendorf管上标记好对应样品的名称；3、在模具上标记好对应样品的名称；4、用CSB湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB中，用bioMerieuxVitek colorimeter测其OD值，并调整至3.6~4.5。
如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果OD值小于3.6，增加菌量提高其浓度。
5、取400μl细菌悬浊液于相应的1.5ml eppendorf管中，置于37℃水浴中孵育5分钟。
将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中。
6、从水浴箱中取出eppendorf管，每管加入20μl蛋白酶K（储存液浓度为20mg/ml）混匀，使其终浓度为0.5mg/ml。
7、制备好1%Seakem Gold：1%SDS，放于56℃水浴箱中。
8、在eppendorf管中加入400μl的1% Seakem Gold：1%SDS，用枪头轻轻混匀。
9、将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。
注意事项：（1）用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。
（2）细胞悬浊液、蛋白酶K要置于冰上。
（3）在混合细胞悬浊液和1% Seakem Gold：1%SDS时要避免气泡的产生。
脉冲场电泳
脉冲场凝胶电泳- 高分子量DNA琼脂糖凝胶块制备和加工1．收集10ml全血，加入30ml细胞裂解液。
置冰浴中至少20min直至红细胞完全溶解。
2．2000r/min离心10min，移去红色上清液，再次用细胞裂解液洗涤细胞，然后用PBS重悬细胞。
3．稀释单细胞悬液并取一小份用Neubauer腔计数细胞。
4．用PBS重悬细胞，以达到40μl PBS中含1百万个细胞比例（1百万个二倍体哺乳动物大约含有基因组DNA 10μg）5．用PBS配制2％浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50℃。
6．将等体积（各1ml）细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀，立即倒入凝胶块模具中。
7．静置20min让琼脂糖固化，用无菌塑料杯（通常用作划菌）将凝胶块自模具中取出并置入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml的蛋白酶K。
8．将带有凝胶块的蛋白酶K缓冲液于50℃保持2～3天。
每个盛有50ml蛋白酶缓冲液的Falcon管可容纳多达100个凝胶块。
9．蛋白酶K消化后，可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4℃。
10．此外，继续将凝胶块用高压消毒过的TE缓冲液冲洗数遍的步骤。
11．将凝胶块放入装有TE及0.04mg/ml PMSF溶液的Falcon试管中，灭活残留的蛋白酶K。
12.室温下用TE溶液漂洗凝胶块数次,将凝胶块放入另一干净的试管，可直接用于酶切反应或用0.5mol/L EDTA，（pH8.0）4℃保存凝胶块。
13．若用EDTA保存凝胶块，取出后应用TE溶液室温下漂洗30 min×2次。
脉冲场凝胶电泳- 大小标准物的制备λ多联体1．以TE缓冲液悬浮λ多联体（Boehringer MA宝灵曼公司产品），浓度为4μg/40μl。
2．用等体积TE配制的2％低熔点琼脂糖（温度保持在45℃）混匀。
3．移去混合液注入预冷的凝胶块模具中。
4．室温下用TE及100 mmol/L NaCl溶液温育2天。
酵母染色体1．从YPD（酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖）培养基瓶皿中挑选单一克隆加入10ml YPD预培养的肉汤中，30℃下剧烈震荡生长24小时，然后加入200ml YPD肉汤，剧烈振荡24～48h（产量大约100块）。
副溶血弧菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)标准操作方案
提前准备 从检测培养基上挑取单菌落，划种于含 5%绵羊红细胞的胰蛋白胨大豆琼脂 （TSA-SB）平板（或相当的培养基）上培养；用同一个接种针或接种环穿刺或 划种于小螺帽管中的 TSA-SB 或相似培养基，以保证必要时重复检测同一个克 隆。37℃培养 14～18 小时。
第二天 凝胶块内 DNA 的酶切 1、 2、 在 1.5ml eppendorf 管上标记好相应的样品及 H9812 的名称。 按照下面的比例配制酶切缓冲液的稀释液，混匀。
试剂 纯水 Buffer H 总体积
µL/胶块 180µl 20µl 200µl
µL /10 胶块 1800µl 200µl 2000µl
酶 SfiI（40U/µl） 1.25µl 总体积 注意： 200µl
（1） 将酶置于冰上，用后立即放在－20℃保存。 （2） 用枪头吸出缓冲液 H，避免损伤胶块。 （3） H9812 的胶块使用 XbaI 进行酶切。 （4） 酶切体系可根据不同生产厂家推荐反应体系计算。 9、 用 NotI 酶配制酶切反应体系： 试剂 纯水 Buffer H µL/胶块 176µl 20µl µL /10 胶块 1936µl 220µl 44µl 2200µl
凝胶块中细胞的裂解 注意：同一菌株的两个凝胶块（可重复使用制胶模具）或 3-4 个凝胶块（丢弃式 制胶模具）可用同一个 50ml 管裂解。 1、 在 50ml 的聚丙烯螺帽管上做好标记。 2、 配制 CLB/蛋白酶 K 混合液：每 5ml 细胞裂解液（CLB）加入 25µl 蛋白酶 K（20mg/ml） ，使其终浓度为 0.1mg/ml，然后颠倒混匀。 注意：蛋白酶 K 要置于冰上，配制好的混合液也要置于冰上。 3、 每个管子加入 5ml CLB/蛋白酶 K 混合液。 4、 把凝胶块移入相应螺帽管：若想使胶块平齐，可用刀片削去模具表面多余 的部分。 可重复利用的模具：打开模具，用 6mm 宽小铲将胶块移入相应的螺帽 管中。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶系统操作规范文件编号：VBQW11##-##版本号：A0制定：制定日期：审核：审核日期：批准：批准日期：颁发部门：质量保障中心发行日期：文件更改记录版本号发行日期变更原因、依据及详细变更内容制定人分发部门具体部门目录1. 目的 (4)2. 适用范围 (4)3. 职责 (4)4. 操作规范 (4)4.1 简介 (4)4.1.1. 技术原理 (4)4.1.2 主要仪器设备和试剂 (4)4.2 准备工作 (5)4.3 灌胶 (5)4.4 上样 (6)4.5 主机程序设置 (6)4.6 凝胶染色和观察 (6)4.7 电泳槽清理 (7)5. 注意事项 (8)6. 常见故障及解决方法 (8)7. 关于参数设置的几点建议 (9)8. 试剂配制 (11)1.目的指导技术员规范地使用脉冲场凝胶系统。
2.适用范围本标准适用于利用脉冲场凝胶系统对相关产品进行检测。
3.职责分子部门负责本文件的编写，质量保障部及检验人员负责本标准的监督。
4.操作规范4.1简介4.1.1. 技术原理常规的琼脂糖凝胶电泳采用单一的均匀电场，一定大小的线状DNA分子经凝胶的分子筛作用以一定的速率由负极向正极移动。
但当DNA分子的长度超过一定极限后，其迁移率于则于分子大小无关，而主要是决定于电场强度。
实践表明，长度大于50kb的DNA不能在恒场强的琼脂糖凝胶电泳中较好的分离。
脉冲场凝胶系统(Pulsed field gal electrophoresis, PFGE)正好解决这一问题。
PFGE采用两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，DNA的电泳方向随着电场的变化而改变，大分子的DNA得以分离。
严格来讲，“脉冲”场电泳有些用词不当，应称作“交替”场电泳。
电场变换方向的间隔时间为脉冲时间，其分为从数秒到几小时。
通常脉冲时间越长分辨的DNA片段越长。
图一. 脉冲场电泳交变示意图图一是根据Carle和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1 field gel electrophoresis，OFAGE) 绘制的PFGE示意图。
金黄色葡萄球菌脉冲场凝胶电泳实验步骤
金黄色葡萄球菌脉冲场凝胶电泳实验步骤提前准备从检测培养基上挑取单菌落，接种于含5%去纤维蛋白羊血的哥伦比亚琼脂平板（或相当的培养基）上培养，37℃孵育箱培养16-20小时。
同时接种标准株H9812。
第一天步骤1 细菌的包埋1、打开水浴摇床（54℃）、水浴箱（56℃）。
2、用TE缓冲液（具体试剂配制方法见附件）制备1%Seakem Gold：1%SDS琼脂糖，以配制25ml体积为例说明，方法如下：(1)准确称取0.25g SeaKem Gold agarose, 放入250ml的蓝色瓶内。
(2)加入25ml TE缓冲液，轻柔摇荡瓶子使琼脂均匀散开。
(3)微松瓶盖，将玻璃瓶放于微波炉内高火加热30秒，取出轻柔摇荡，再次加热30秒，重复操作直至琼脂彻底溶解（无颗粒物、悬浮物，透光均一，无明显异常折光，无气泡）。
(4)将溶解的SeaKem Gold agarose放入56℃水浴箱内备用。
3、在Falcon 2054管（或其他相当的管）上标记样品名称和空白对照；在1.5ml 微量离心管上标记好对应样品的名称。
4、在Falcon 2054管中分别加入约2ml细胞悬浊液TE（配制方法见附件）。
注：使用测定细菌浓度的容器不同加入TE的量也不同。
5、从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于TE中。
调整细胞悬液浓度至指定范围。
用eppendorf分光光度计在600nm波长测其OD值，调整至5.5～6.5之间。
6、取400µl细菌悬浊液于相应的1.5ml微量离心管中，置于37℃水浴中孵育5分钟。
将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备完毕。
7、从水浴箱中取出微量离心管，每管加入3µl溶葡萄球菌酶（储存液浓度1mg/ml）混匀。
8、加入400µl的1%Seakem Gold到上述装有400µl细菌悬液的微量离心管内，用枪头轻轻混匀，避免有气泡产生。
（此时1%Seakem Gold需置于56℃水浴中）注：没有用完的Seakem Gold agarose可放于室温，并可重复使用1-2次。