叶绿体的提取与荧光观察
实验五 叶绿体的分离与荧光观察
实验五叶绿体的分离与荧光观察叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。
由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。
叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。
实验目的一、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
二、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 mol／L氯化钠或0.4 mol／L蔗糖溶液)中进行．以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
将匀浆液在1000 r／min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。
然后，在3000 r／min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。
分离过程最好在0～5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。
某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。
若停止供能荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光．这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
叶绿体的分离与荧光观察
04 实验操作流程
实验材料准备
01
02
03
新鲜植物叶片
选择健康、无病虫害的植 物叶片，如菠菜、豌豆等。
实验试剂
包括分离液、荧光染色剂、 缓冲液等。
实验仪器
包括离心机、显微镜、染 色皿、吸管等。
叶绿体的分离
将新鲜叶片洗净，剪成小段， 放入离心管中。
加入适量的分离液，轻轻摇晃 ，使叶片充分浸泡在分离液中
荧光显微镜的工作原理和使用方法
工作原理
荧光显微镜利用特定波长的光激发细 胞内荧光染料或荧光探针发出可见光 ，通过光学系统放大并显示在屏幕上 。
使用方法
使用荧光显微镜时，需要先对样本进 行染色或标记，然后将其置于显微镜 下观察。观察时需要调整光源和滤光 片，以获得最佳的荧光效果。
荧光观察技术在叶绿体研究中的应用
叶绿体形态观察
荧光染料或荧光探针可以标记叶 绿体，通过荧光显微镜观察叶绿
体的形态、数量和分布情况。
叶绿体功能研究
荧光染料或荧光探针可以结合叶绿 体中的色素或蛋白质，通过观察荧 光信号的变化来研究叶绿体的功能 和代谢过程。
叶绿体动力学研究
利用荧光探针标记叶绿体，可以观 察叶绿体的运动和分布情况，了解 其在细胞内的动力学特征。
荧光观察
在荧光显微镜下观察叶绿体，发现叶绿体发出强烈的绿色荧光，表 明叶绿体含有丰富的叶绿素。
细胞壁与细胞质的分离
通过实验操作，成功将细胞壁与细胞质分离，便于后续实验的进行。
结果分析
1 2
叶绿体分离效果
实验结果表明，采用离心和密度梯度离心法能够 获得较为纯净的叶绿体，分离效果较好。
荧光观察的意义
荧光观察能够直观地展示叶绿体的存在和状态， 对于研究叶绿体的功能和结构具有重要意义。
高中生物实验 叶绿体的分离和荧光观察 实验报告
实验十一叶绿体的分离和荧光观察一．实验目的了解细胞匀浆和差速离心分级分离细胞组分的原理。
了解提取叶绿体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的叶绿体的一般形态，增加对叶绿体的感性认识。
掌握吖啶橙染色叶绿体的方法。
掌握显微数码拍照的方法。
二．实验内容提取叶绿体，吖啶橙染色，观察染色结果。
显微数码拍照。
三．实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
在一定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部。
叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/LNacl或0.4mol/L 蔗糖溶液）中进行。
离心后可得沉淀的叶绿体。
四．实验方法与步骤1．取嫩叶3g，洗净去柄去叶脉，剪碎放入研钵中。
2．加4ml0.35mol/LNacl，研磨匀浆，尼龙布过滤于离心管中1ml。
3．1000rpm离心2分钟弃去沉淀。
4．3000rpm离心15分钟，弃去上清液，将沉淀用少量0.35mNacl悬浮。
5．提取叶绿体观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。
6．撕取叶表皮观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。
a．在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色椒榄形，在高倍镜下看到叶绿体内部含有较深的绿色的绿色小颗粒即基粒。
b．在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光。
c．加入吖啶橙染后，叶绿体可发也桔红色荧光。
而其中混有的细胞核发出绿色荧光菠菜叶手切片观察。
d．在普通光镜下可以看到三种细胞：表皮细胞：为边缘吐锯齿表的鳞片状细胞。
保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。
叶肉细胞：为排成栅状的长形和椭圆形细胞。
5．显微数码拍照。
五．实验结果。
实验三 叶绿体的分离、提取、观察
实验三叶绿体的分离、提取、观察2011.03.23班级：姓名：一．试验目的1．学习使用差速离心方法分离获取叶绿体。
2．理解叶绿体的分离与保存环境。
3．叶绿体的形态观察、测量、叶绿体悬液的荧光现象观察。
二．实验原理1．叶绿体是植物叶肉细胞内重要的细胞器，是植物光合作用的场所。
分离提取得到的活体叶绿体，既能进行光合作用速率测定，也能进行叶绿体色素的分离提取。
2．差速离心法常用于获取细胞中的某一物质，其原理是在一定转速条件下，不同密度大小的物质沉降速度不一样，最终使有密度差异的物质得以分离。
三．实验用具1．材料与试剂：菠菜叶、0.35mol/L NaCL、95%乙醇、石英砂。
2．器具：离心机、天平、量筒、研钵、玻棒、纱布等四．实验步骤1．选用生长健壮的菠菜叶片洗净后去除中脉，然后放入0—4 ℃冰箱或冰瓶中预冷。
2．取叶片经滤纸吸干水后，称取5g剪成碎片，于10—15 mL0.35mol/L氯化钠溶液中，置于研钵中，加少量石英砂，手工快速研磨，(注意不要用力过猛，也不必研磨过细)。
3．研磨后将匀浆用2层新纱布过滤，滤液盛于烧杯中。
4．将滤液装入预冷过的离心管，经天平平衡后，以1200r/min离心2min，弃去沉淀。
5．上清液再经3000 r/min离心5 min ，倾去上清液，沉淀即为叶绿体。
6．沉淀用2 mL 0.35mol/L氯化钠溶液悬浮，备用。
7．用滴管取少量悬浮液于载玻片上，加盖玻片后，吸水纸吸去多余的溶液，置显微镜下镜检观察。
可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。
测量叶绿体的长轴和短轴，分别测量5~10个叶绿体，求其平均值。
8．称取叶片5g剪成碎片，加10—15 mL95%乙醇及少量石英砂，于研钵中快速研磨，然后2层纱布过滤，取滤液，将其装入离心管，以2500r/min离心3min，收集上清液于试管中。
9．叶绿体荧光现象的观察：用强的柱状光源照射盛装叶绿素提取液的试管，然后顺着光源方向观察提取液颜色，并和对着光管观察是的情况进行比较。
叶绿体的分离纯化及荧光观察
叶绿体的分离纯化及荧光观察叶绿体是植物细胞中的一种细胞器，它是进行光合作用的主要场所。
叶绿体具有一定的自复制能力，可以独立分离出来，纯化叶绿体样品可以方便地进行进一步的实验研究。
本文将详细介绍叶绿体的分离、纯化以及荧光观察的方法。
一、叶绿体的分离1.实验材料准备为了分离叶绿体，我们需要充足的植物组织样品。
可以选择新鲜的叶片或者细胞培养物作为实验材料。
同时，需要准备好一系列试剂，例如缓冲液、葡萄糖、EDTA、PEG等。
2.组织破碎和提取液的准备首先，将植物组织样品冷冻在液态氮中，然后用超声波处理器将样品破碎。
接下来，将破碎的样品用缓冲液溶解，加入适量的葡萄糖和EDTA。
将溶解后的样品在低温条件下离心，然后取出上清液。
3.叶绿体的沉淀将提取液中的上清液用PEG逐渐沉淀叶绿体。
首先加入PEG溶液，并轻轻搅拌。
然后，将样品在低温条件下离心，离心后会出现一个绿色的沉淀。
这个沉淀就是叶绿体。
4.叶绿体的洗涤和纯化将叶绿体的沉淀用缓冲液洗涤数次，然后用离心将叶绿体沉淀下来。
最后，将沉淀的叶绿体用缓冲液悬浮，即可得到纯化的叶绿体样品。
二、叶绿体的荧光观察1.荧光探针的准备为了观察叶绿体的荧光，我们需要准备好合适的荧光探针。
通常使用的探针有二苯基苯酚（DPBF）和二聚(4-乙基-5-（4-甲基吡啶氧基）-2-溴脱氧葡萄糖（DAB）等。
2.荧光探针的添加将纯化的叶绿体置于含有荧光探针的溶液中，静置一段时间。
荧光探针会与叶绿体中的一些分子发生作用，从而产生荧光。
3.荧光观察使用荧光显微镜观察叶绿体的荧光。
将样品放置于荧光显微镜下，设置合适的激发波长和观察波长。
然后观察荧光显微镜中的图像，即可看到叶绿体的荧光。
4.结果分析通过观察叶绿体的荧光，可以得到关于叶绿体活性和光合作用效率的信息。
例如，如果观察到荧光强度较高，可以推测叶绿体的光合作用效率较低。
总结：叶绿体的分离、纯化及荧光观察是研究植物生物学和光合作用的重要方法之一、通过正确的操作流程和合适的实验材料，可以得到纯化的叶绿体样品，并通过荧光观察了解叶绿体的活性和光合作用效率。
实验一：叶绿体的提取和荧光观察
叶绿体的提取和荧光观察一、实验目的：1. 学习分离制备叶绿体的方法，了解制备细胞器的一般程序，观察光镜下叶绿体的形态。
2. 学习和掌握离心机的原理和基本使用方法。
3. 学习荧光显微镜的使用方法及其应用。
二、实验原理及分析：细胞器分离的过程包括两个主要阶段：破碎细胞和细胞组分的分离。
细胞内各种结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同介质和不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。
在等渗溶液中进行组织匀浆、分离，叶绿体的分离采用差速离心或密度梯度离心法进行。
荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一种技术。
某些物质在—定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。
若停止供能荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
三、实验材料：菠菜叶片四、实验步骤：1. 菠菜叶片洗净吸干。
称取20克，剪成小块；加入40ml完全介质，在研钵中充分研磨。
2.浆状物用双层纱布过滤；3. 汁液置于离心管中，1100 rpm(200g)离心5Min；4. 弃去沉淀，取上清液1900 rpm(600g)离心12Min；5. 弃去上清液，沉淀加入15ml A液，轻轻吹打悬浮；6. 悬浮液600g离心12Min；7. 弃去上清液，取沉淀，悬浮于A液中；8.普通光学显微镜下观察；9. 荧光显微镜下观察1〕荧光镜下紫外直接观察；2〕滴加吖啶橙后观察五、实验结果及分析：在普通显微镜下，叶绿体呈现出绿色椭球形，为正常结构。
可能因为差速离心得到的样品不纯，还观察到一些组织碎片。
叶绿体分离与荧光染色观察
组织碎片
叶绿体经激发光波照射后，自 叶绿体次生荧光的来由, 结 普通光学显微镜下观察到 发荧光呈现火红色，因叶绿体 橘红色为叶绿体的荧光
果 叶绿体的正常结构。离心 在其悬液中呈现点状均匀分 效果，叶绿体的悬液中混
分 不纯导致混有其他组织碎 布，且悬液其他组分无自发荧 有的细胞核碎片中的核
析片
光反应,故观察到斑状分布的 酸经丫啶橙染色荧光反
火红色荧光效果
应呈现绿色
六．思考与讨论
1.注意事项 (１）要得到完整的、有活性的叶绿体,须在低温下迅速提取,涂片后立即观察,注意离心时的
时间及强度。
(２）利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察室，会收到许多因素的影响,如温度、光、 淬灭剂等。因此在进行荧光观察时应抓紧时间,必要时应立即拍照。
(３）在制作荧光显微标本时最好使用物荧光载玻片、无荧光盖玻片香柏油。 2．思考题 （１)在荧光显微镜下观察叶绿体的自发荧光时，更换滤片系统，叶绿体的颜色是否有变化? 有变化。因为叶绿体的颜色取决于发出荧光能量的高低，更换不同的滤片,激发光会不同， 叶绿体得到和辐射的能量就会不同，颜色也就会不一样 （２)游离的叶绿体和完整细胞内的叶绿体，在荧光显微镜下，颜色和荧光强度有无区别， 为什么? 有区别。因为完整细胞内的叶绿体还要进行光合作用，这会消耗掉一部分所吸收的光,所以 最后释放的荧光能量就会比游离核糖体所释放的小,颜色和荧光强度就会有差别。 (3）根据观察到的实验现象，简述自发荧光和次生荧光的区别？ 自发荧光指不需染色，只需在激发光照射下即可发荧光的现象，而次生荧光需要染色。因为 发光机制不同，所用的滤光片也会不同，最后发出的荧光颜色也会不同。 （4)叶绿体分离的原理是什么?操作过程应注意什么？ 采用的方法是差速离心法，利用不同颗粒大小、形状不同导致沉降速率不同,把叶绿体大小 的颗粒沉降出来。 叶绿体的分离应在等渗溶液（０．３5mol/L 氯化钠或０.4mol/Ｌ 蔗糖溶液）中进行，以免 渗透压的改变使叶绿体受到损伤;分离过程最好在０～4℃的条件下进行;如果在室温下，要 迅速分离和观察。 3.实验小结
实验二叶绿体的分离与荧光观察
叶绿体荧光产生的机制
荧光产生
叶绿体在接受光能后，将能量转化为活跃的化学能，这个过程会产生荧光。荧光是一种光发射现象，发生在叶绿 素和其他色素分子吸收光能后。
荧光类型
根据荧光产生的机制，可以将荧光分为自发性荧光和诱导荧光。自发性荧光是指色素分子自发地吸收光能后产生 的荧光；诱导荧光是指通过外部刺激使色素分子吸收光能后产生的荧光。
叶绿体的分离
01
02
03
04
制备匀浆
将新鲜叶片洗净后剪碎，加入 适量的磷酸缓冲液，用匀浆器
充分研磨的转速和时间进行离心分离，
使叶绿体沉淀到底部。
吸取上清液
将上清液吸出，留下叶绿体沉 淀。
重悬浮
将叶绿体沉淀重新悬浮在适量 的溶液中，以便进行后续的荧
光观察。
实验二叶绿体的分 离与荧光观察
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 实验结论
01
CATALOGUE
实验目的
掌握叶绿体的分离技术
叶绿体的分离
通过离心、密度梯度离心等技术，从植物组织中分离出叶绿 体。
叶绿体纯化
通过过滤、洗涤等步骤，去除杂质，获得纯度较高的叶绿体 。
了解叶绿体荧光的基本原理
叶绿体分离的原理与方法
原理
叶绿体分离主要依据其密度和大小差异进行。常用的分离方法有差速离心法和密度梯度离心法。差速 离心法是通过逐渐增加离心速度，使不同大小和密度的细胞器分批分离；密度梯度离心法则是在介质 中形成密度梯度，使不同密度的细胞器在梯度中停留并形成不同的区带。
方法
叶绿体分离通常包括细胞破碎、差速离心或密度梯度离心、洗涤和重悬浮等步骤。根据实验需求，可 以选择适当的方法分离纯化叶绿体。
叶绿体的分离及荧光观察
什么是荧光 ?
物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态（基态）时释放出的光。
三、荧光显微镜的成像原理
01
保持固有的荧光特性
02
荧光波长＞激发波长
03
荧光强度极小于激发光的强度
04
有不同程度的衰减
05
荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率
四、荧光的性质
五、荧光显微术应用
常用的细胞破碎方法
方法
技术
原理
效果
成本
举例
机 械 法
匀浆法
细胞被搅拌器劈碎或受剪切力而破碎
适中
适中
动植物组织或细胞
研磨法
细胞被研磨物磨碎
适中
便宜
植物组织
超声波法
用超声波的空穴作用使细胞破碎
剧烈
昂贵
细胞悬浮液小规模处理
珠磨破碎法
细胞被玻璃珠或铁珠捣碎
剧烈
便宜
细胞悬浮液和植物细胞大规模处理
化 学 法
渗透冲击
生物绘图 1．要求：细胞和组织绘图是根据显微镜下的观察内容绘制的，因此，首先要充分观察了解所绘材料的特点、排列及比例。选择有代表性的、典型的部位进行绘图。客观真实地反映材料的自然状态。即生物绘图要求具备高度的科学性和真实感，形态正确、比例适当、清晰美观。 2、用线条和圆点来完成全图。如，用线条描绘细胞壁与膜。用“点”表示明暗和颜色的深浅，给予立体感 3、不要只孤独的绘制一个细胞，要表现出显微镜下还有其他细胞的存在，
介质梯度应预先形成 ，离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面、底部或中间，离心后形成区带。
介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，通过离心自形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。
叶绿体的分离与荧光观察
叶绿体的分离与荧光观察实验目的和原理观察叶绿体的自发荧光和次生荧光．并熟悉荧光显微镜的使用方法。
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法，一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部．分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4moJ/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
将匀浆液在1000r/min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。
然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。
分离过程最好在0-5℃的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。
荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一种技术。
某些物质在—定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光．若停止供能荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。
因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。
另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片，盖玻片和无荧光油。
实验用品一、器材1、主要设备：普通离心机，组织捣碎机，粗天平，荧光显微镜。
2、小型器材：500ml烧杯2个，250ml量筒1个，滴管10支，10ml 刻度离心管20支，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。
实验二 密度梯度离心法分离提纯叶绿体及叶绿体荧光观察
轻轻吸取上清液。
5. 先将50%蔗糖溶液0.4ml加入离心管，再取 15%蔗糖溶液0.4ml小心沿管壁缓缓注入， 不能搅动50%蔗糖液面，使两种溶液界面 可见，制成密度梯度。
三、实验用品
1. 材料：新鲜菠菜叶 2. 器材：光学显微镜、台式高速冷冻离心机，
研钵、剪刀、托盘、玻皿等 3. 试剂： （1）匀浆介质（0.25 mol/L蔗糖、
0.05 mol/L Tris-HCI缓冲液，pH7.4）（2） 50%蔗糖溶液，（3）15%蔗糖溶液。
四、实验步骤
1. 洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去掉叶柄、 主脉后，称取2~3g，剪碎置研钵中。
6. 加入0.4ml上清液，严格平衡离心管后，用 水平转头8000r/min离心，20min。
7. 用滴管轻轻吸出界面处的溶液，滴于载玻 片上，盖上盖玻片后，显微镜下观察。另 取部分溶液在暗室内用荧光显微镜直接观 察。（角转取中间靠壁的叶绿体）
五、作业
• 分离的叶绿体是否纯净？试分析原因。 • 实验报告
实验二 密度梯度离心法 分离提纯叶绿体及叶绿体
荧光观察
一、实验目的
• 学习密度梯度法，分离提纯菠菜叶 绿体及叶绿体的荧光显微镜观察。
二、实验原理
❖一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗 粒的大小、形状和密度，也同离心力以及 悬浮介质的粘度有关；
❖用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在 离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小 的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降 系数较大的细胞组分沉到离心管底部， 这样，可粗略地分离叶绿体。
叶
高中生物 实验四：叶绿体的分离与荧光观察
6.沉淀用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮。 7.取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光 学显微镜观察。使用荧光显微镜观时，将叶绿体悬液滴在 无荧光的载玻片上，再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料， 盖上无荧光的盖玻片后即可观察。
8.观察叶绿体的形态结构、测量1~5个叶绿体的长轴和短
【ห้องสมุดไป่ตู้验原理】
某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光 能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间 内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就
称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体
内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧 光），如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧 光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧 光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光本实验利用 荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。
实验四：叶绿体的分离与荧光 观察
【实验目的】
了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用 荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。
【实验原理】
叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生 特有的能量转换。利用低速离心机可以分离叶绿 体，其分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或 0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，目的是为了防止渗 透压的改变引起叶绿体的损伤。将匀浆液在 1000r/min离心，去除其中的组织残渣和一些未 被破碎的完整细胞，然后，3000r/min离心，可 获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。在室温 下进行分离要迅速。
【仪器、材料与试剂】
仪器：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微 镜，载玻片，盖玻片，镊子，接种针，目镜测微尺，物镜测 微尺，恒温箱，培养皿，滤纸，试管，试管架，移液管，滴 管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管。 材料：菠菜叶片
实验二：叶绿体的分离与荧光观察
图：落射式荧光显微镜的光路
细胞生物学实验
荧光染料:吖啶橙(acridine orange )
吖啶橙是一种与DNA和RNA都能结合的荧光染料 在紫外光或蓝光(330～485nm)激发下，DNA可被激发 出530nm的荧光发射峰(细胞核发亮绿色荧光)，RNA 可被激发出640nm的荧光发射峰(核仁和胞质RNA发桔 红色荧光)。 产生两种不同荧光是由于吖啶橙与双链DNA 和单链 DNA或RNA的结合方式和结合量不同而决定的。DNA 是高度聚合物，它与DNA结合是潜入双链之间，结合 量相对少；而与单链DNA或RNA的结合则由静电吸引 堆积在磷酸根上，结合量相对多些。 我们推测，叶绿体的次生荧光的来由，大部分来自叶 绿体的吸附作用，极少部分来自叶绿体中的RNA.
速率-区带梯度离心和等密度梯度离心
细胞生物学实验
A、速率-区带梯度离心流程图
B、等密度梯度离心流程图
原理：根据分离的粒子在梯 度液中沉降速度的不同，通 过离心力场的作用，使不同 的颗粒在密度梯度层内形成 一系列区带，从而达到彼此 分离的方法。
原理：根据不同颗粒在密度梯度 介质中存在着浮力密度差，在离 心力场作用下，颗粒或向下沉降， 或向上浮起，一直移动到与它们 各自的密度恰好相等的位置上形 成区带，从而使不同浮力密度的 颗粒得到分离的方法。
细胞生物学实验
实验报告
记录荧光显微镜下观察的叶绿体自发荧光 和次生荧光现象，并分析结果，解释叶绿 体发出的自发荧光和次生荧光的作用机理 有何不同？
细胞生物学实验
思考题
1.分离叶绿体实验的原理是什么？操作 过程中应注意什么？ 2.普通光学显微镜和荧光显微镜的原理 有何异同点？ 什么叫离心力和转速，两者之间的关系 如何？ 什么叫沉降系数，其单位用什么表示， 如何定义
实验三叶绿体的提取与观察
实验三叶绿体的提取与观察实验题目：叶绿体的分离及荧光观察 2017.10.131.结果与分析图1光学显微镜下菠菜叶绿体观察（物镜×40倍）结果描述：光学显微镜下叶绿体呈较深的绿色，椭圆或圆形;视野中还有许多叶绿体碎片和被压碎的叶绿体。
叶绿体纯度：完整叶绿体/总叶绿体=23/50=46%结果分析：由于叶绿体处于高渗溶液中，所以会失水导致颜色加深且呈圆形；视野中的叶绿体碎片是由于研磨时外力作用破坏了叶绿体，被压碎的叶绿体是由于在制作装片时有外力作用到盖玻片上使原本完整的叶绿体破碎。
由于各种因素的影响使所提取到的叶绿体遭受损坏，所以最后叶绿体的纯度较低，为46%，由此也可以得知叶绿体较脆弱，易被破坏。
图2菠菜叶绿体荧光观察（放大倍数×40）结果描述：倒置荧光显微镜观察下，叶绿体反射红光，椭圆或圆形;视野中有许多叶绿体碎片和被压碎的叶绿体。
叶绿体纯度：完整叶绿体/总叶绿体=19/50=38%结果分析：由于叶绿体处于高渗溶液中，所以失水呈圆形。
视野中的叶绿体碎片完整叶绿体被压碎叶绿体叶绿体碎片完整叶绿体被压碎叶绿体叶绿体碎片是由于研磨时外力作用破坏了叶绿体，被压碎的叶绿体是由于在制作装片时有外力作用到盖玻片上使原本完整的叶绿体破碎。
荧光观察下，叶绿体纯度比光学显微镜观察下要低，原因可能是，光学显微镜视野较倒置荧光显微镜视野模糊，使光学显微镜视野里许多叶绿体碎片无法观察到，从而使总体叶绿体数目变少，纯度升高。
也有可能由于所选取的视野不同而导致的。
2.回答问题①根据结果，得到的叶绿体仍然是不纯的。
还是用差速离心方法，你如何将你得到的叶绿体进一步纯化？将实验所得的叶绿体进一步以1000rpm与3000rpm的中间值1500rpm的转速离心5min，各取其上清液与沉淀在显微镜下观察叶绿体的数量，含叶绿体较多的一组为进一步纯化的叶绿体。
若想得到更纯的叶绿体，可以按照以上步骤进一步取转速的中间值对上一步纯化的叶绿体进行离心，观察上清液与沉淀的叶绿体含量，取叶绿体含量较多的一组。
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叶绿体的次生 荧光的来由， 橘红色为叶绿 体的荧光效果 黑色部分来自 叶绿体悬液中 混有的细胞核 碎片中的DNA 和RNA，经吖
应，故观察到 斑状分布的火 红色荧光效 果。
啶橙染色荧光 反应呈现绿 色。.
六）注意事项 1、叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠)中进行,以免渗透压的 改变使叶绿体受到损伤。 2、分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和 观察。 3、离心机使用：离心管要平衡 4、凡是荧光染料都有一定毒性，请做好防护 5、在荧光观察时应抓紧时间,有必要时立即拍照。 6、在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。 7、汞灯开启后15min内不要关闭，关闭后3min内不要开启。
叶绿体的分离与荧光观察
一）实验目的： 1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。 二）实验原理：
细胞器分离的过程包括两个主要阶段：破碎细胞和细胞组分的分 离。在等渗溶液中进行组织匀浆、分离，叶绿体的分离采用差速离心或 密度梯度 光（次生/诱发荧光）。离心分离技术是分离细胞组分和生物大分子最 常用的分离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在 不同离心力不同介质沉降分离。
三）实验用品
材料： 菠菜叶片 试剂：蒸馏水，0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(AO) 仪器：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微镜，镊子， 培养皿，纸，移液管，滴管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管,吸 水纸等 四）实验步骤： 1、叶绿体悬浮液的制备 菠菜叶片(去叶脉)3g → 0.35mol/L氯化钠15ml→研磨→匀浆过滤(6层纱 布)→滤液在1000r/min离心2min→弃沉淀，上清液3000r/min离心5min → 去上清液→沉淀为叶绿体(混有部分细胞核)，用0.35mol/L氯化钠溶液悬 浮 →滴片观察 2、叶绿体的显微与荧光观察 取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用分别用普通光学显微镜 观察叶绿体的形态结构和荧光显微镜观察自发荧光。 将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上,再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染
吖啶橙是一种与DNA和RNA都能结合的荧光染料，在紫外光或蓝 光(330～485nm)激发下，DNA可被激发出530nm的荧光发射峰(细胞核 发亮绿色荧光)，RNA可被激发出640nm的荧光发射峰(核仁和胞质RNA 发桔红色荧光)。产生两种不同荧光是由于吖啶橙与双链DNA 和单链 DNA或RNA的结合方式和结合量不同而决定的。DNA是高度聚合物， 它与DNA结合是潜入双链之间，结合量相对少；而与单链DNA或RNA 的结合则由静电吸引堆积在磷酸根上，结合量相对多些。我们推测，叶 绿体的次生荧光的来由，大部分来自叶绿体的吸附作用，极少部分来自 叶绿体中的RNA.
料，盖上无荧光的盖玻片,使用荧光显微镜观察间接荧光 。
五）实验结果与分析：
1、实验结果：
2、结果与分析
观察方式
普通显微镜
观察结果
叶绿体为绿色 橄榄型，在高 倍镜下可看到 叶绿体均匀分 布，内部含有 较深的绿色颗 粒，即基粒。 另有其他组织 碎片。
荧光显微镜
叶绿体自发荧 光为火红色， 呈斑状分布， 其他部分为黑 色。
染色后荧光观 察
间接荧光为桔 红色，占很少 一部分，其他 大部分部位为 绿色。
结果分析
普通显微镜下 观察到叶绿体 正常结构，为 绿色橄榄形。 差速离心离心 不纯，故混有 其他组织碎 片。
叶绿体经激发 光波照射后， 自发荧光呈现 火红色。因叶 绿体在其悬液 中呈现点状均 匀分布，且悬 液其他组分无 自发荧光反