草鱼内脏蛋白质水解特性的研究

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Байду номын сангаас
(北京工商大学食品学院，北京市食品风味化学重点实验室/食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北
Hydrolysis Characteristics of the proteins from Grass Carp Viscera
QING Yuting , CONG Yanjun* (Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry and Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, School of Food Science, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China) Abstract: The effects of papain, alcalase, flavorzyme, pepsin, trypsin, and neutral on the proteolytic activities of protein from the grass carp viscera were studied. Protein extracts were obtained by centrifugation. The molecular formula weight of proteins was measured by SDS-PAGE.The results showed that the molecular formula of proteins were 39.4KDa, 13.2KDa, 2.8KDa, respectively. The ammoniacal nitrogen contents in the hydrolyzates increased rapidly in the first 6 hours, then were stable. The peptide nitrogen contents reached the peaked at the sixth hour for other protease except alcalase at the ninth hour. Ammonia nitrogen contents of hydrolyzates were the highest for flavorzyme, and the differences were significant with each other except between alcalase and neutral. The peptide nitrogen contents of papain were higher than those by the other enzymes, while those by flavorzyme were the lowest. The taste of the hydrolyzates were constantly changing along with the enzymatic hydrolysis proceeded. As the release of amino acid and peptide, fresh flavor became notable. The umami of flavorzyme were significantly notable. Keywords: the grass carp viscera;protein; hydrolysis;taste
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2012-12-11
1.3.5 氨态氮的测定[11] 取 5mL 酶解液于烧杯中，加入 75mL 去二氧化碳蒸馏水，电磁搅拌器搅拌，在精密 pH 计指示下 用 NaOH 标准溶液滴定（N=0.01mol/L）至 pH 值为 8.2，再加入 20mL 中性甲醛溶液，搅拌 1min 后 用蒸馏水作空白进行滴定， 重新滴定至溶液 pH 值为 9.2， 记录第二次滴定消耗的 NaOH 溶液体积 V1， 记录消耗的 NaOH 溶液体积 V0。
表 1 各种蛋白酶的最适酶解条件 Table 1 The hydrolysis conditions of each emzyme 蛋白酶 Neutrase（中性蛋白酶） Papain(S)（木瓜蛋白酶） Pepsin（胃蛋白酶） Trypsin（胰蛋白酶） Flavorzyme（风味蛋白酶） Alcalase（碱性蛋白酶） 水解 pH 值 7.0 7.5 2.0 7.5 7.0 8.0 水解温度 T（℃） 50 65 37 50 50 65
网络出版时间：2012-12-19 08:51 网络出版地址：/kcms/detail/11.2206.TS.20121219.0851.009.html
2012-12-11
草鱼内脏蛋白质水解特性的研究
苘钰婷 , 丛艳君 京 100048) 摘 要：以草鱼内脏为原料，脱脂离心制备蛋白质粗提液，用 SDS-PAGE 方法测定蛋白质分子量，然后以 制备的草鱼内脏蛋白质为底物，比较研究木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和 中性蛋白酶的水解特性，结果表明，蛋白质分子量分别约为 39.4KDa，13.2KDa，2.8KDa。6 种酶解液中氨 基酸的含量在前 6 小时迅速增加，后趋于平稳；而多肽含量除碱性蛋白酶在酶解第 9 个小时时达到最大值 外，胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶在第 6 小时达到最大值。风味蛋白酶的 氨态氮含量最高，除碱性蛋白酶和中性蛋白酶之间差异不显著外，其他各种蛋白酶两两之间差异都显著； 肽态氮含量木瓜蛋白酶最高，而风味蛋白酶的最低。随着酶解的不断进行，酶解液的呈味效果不断发生着 变化，酶解液的呈味特性随着氨基酸和多肽的释放，鲜味逐渐明显，以感官评价为指标风味蛋白酶的鲜味 最强，六种蛋白酶互相之间差异都显著。 关键词：草鱼内脏；蛋白质；水解；呈味 中图分类号：TS254.9 文献标识码：A
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通讯作者：丛艳君（1978-） ，女，副教授，研究方向为蛋白质化学与工程，e-mail:cyj_win@
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2012-12-11
液中增加了更多的可溶性氮和游离的氨基酸[4-5]，这些可溶性氮和游离氨基酸是微生物生长的优质氮 源。同时，酶解液具有氨基酸含量高，种类齐全，味道鲜美等特点[6]，符合基础调味料的特点，这就 为鱼内脏酶解液的研究利用提供了新的方向。 本文以草鱼内脏蛋白质为原料，比较研究了 6 种蛋白酶的水解特性，以期为草鱼内脏蛋白质的高 值化利用提供新的理论依据。 1 1.1 材料与方法 材料与试剂 草鱼内脏，购于北京市四道口水产品批发市场； 蛋白酶：风味蛋白酶(Flavourzyme)，中性蛋白酶(Neutrase)，地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶(Alcalase) 购于诺维信中国公司；木瓜蛋白酶(papain)，胃蛋白酶(pepsin)，胰蛋白酶(Trypsin)购于 Sigma 公司。 试剂：乙醚，浓硫酸，盐酸，氢氧化钠，甲醛，硼酸，硫酸铜，硫酸钾均为分析纯；混合指示剂 溴甲酚绿-甲基红；去离子水。 1.2 仪器与设备 DKB-501A 超级恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司；PHS-3D 功能型 pH 计，上海三信仪表 厂；TB214 型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；CR22G 型离心机，日本 Hitachi 公司； Kejeltic 2100 型凯氏定氮仪，Foss 公司；D2004W 电动搅拌器，上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司； Spectrumlab 22pc 可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；DYY-10C 电泳仪 ，北京市六一仪器厂。 1.3 方法 1.3.1 基本成分的测定方法 粗蛋白质含量分析：采用微量凯氏定氮法，参照 GB/T 5009.5-2010； 粗脂肪含量分析：采用索氏抽提法，参照 GB /T 9695.7-2008； 水分含量分析：采用干燥法，参照 GB /T 9695.15-2008； 灰分含量分析：采用马福炉法，参照 GB/T 5009.4-2010； 碳水化合物含量分析：采用苯酚-硫酸法，参照 GB/T 9695.31-2008。 1.3.2 草鱼内脏脱脂粗蛋白的制备 将去除胆囊和鱼鳔的草鱼内脏清洗，绞碎，置于 95℃水浴锅中 15min，灭内源酶活[7-8]。冷却后 按 1:1（w/v）加入去离子水，在 4℃，8000r/min 的条件下离心 10min，去除上层液体，收集下层沉淀
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。重复上述操作，即到粗脱脂草鱼内脏蛋白质。 取脱脂草鱼内脏蛋白质提取液 10ul，按 1:1 加样品处理液，100℃煮沸 5min，然后 8000r/min 离
1.3.3 草鱼内脏脱脂粗蛋白分子量的测定[10] 心 5min，取上清液进行 SDS-PAGE 电泳测分子量。 1.3.4 脱脂草鱼内脏蛋白质的酶解 准确称量六份脱脂草鱼内脏蛋白，90℃加热处理 20min，冷却，按底物浓度 3%加入蒸馏水，加 酶量为 30000U/g 蛋白质，调节温度、pH 为各种酶的最适反应条件，进行酶解，每隔 3h 取一次样， 直至酶解到 48h。每次取出的酶解液在 95℃水浴中灭酶 15min。
酶解液中的氨基氮量（%） (V V ) 0.014 N 2 1000 1 0 M
V1:样品消耗的 NaOH 标准溶液的毫升数 V0:空白消耗的 NaOH 标准溶液的毫升数 N: NaOH 标准溶液的摩尔浓度 M:样品的质量（g） 1.3.6 肽态氮的测定[12] 1.3.6.1 标准曲线的绘制 取 18 支试管分两组，分别加入 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到 1 毫升， 然后加入 4 毫升双缩脲试剂。 充分摇匀后， 在 30℃下显色 30min， 于 540nm 处进行比色测定。 用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取三组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标， 光吸收值为纵座标绘制标准曲线。 1.3.6.2 样品测定 取 0.6ml 的酶解液加入 0.4ml15%TCA 静置 15 分钟后，5000r/min 离心[13]。取上清液 0.2ml 于试 管中，加蒸馏水 0.8ml，双缩脲试剂 4ml，混匀，30℃下放置显色 30min 在标准系列相同条件下比色 测定。记录样品管吸光值, 从标准曲线上查得测试液中蛋白质的含量( mg/ml)。 1.3.7 感官评定 酶解液在 pH4.0，活性炭用量 0.5%，脱色温度 50℃，振荡采用粉状活性炭进行脱色脱腥 40min， 离心，去上清液进行鲜味评价[14-15]。 感官评价采用排序检验法测定[16-17]。10mmol/L 谷氨酸钠作为阳性对照样品，并通过水浴加热保 持对照、样品温度在 40℃左右。请 12 名感官评价员比较待测样品与对照样品中鲜味感差别，评定小 组人员均受过相关培训，将酶解液作为品尝对象，评价其鲜味。解液放入口中 15s 吐出，每个样品给 两次，打分采用五分制。评定前用清水漱口，评定时拒绝交流，且样品需用带中性的文字标明，避免 主观评价。