超氧阴离子产生速率测定

超氧阴离子产生速率测定

羟氨氧化法

(王爱国，罗广华．植物的超氧物自由基与羟胺的反应[J]．植物生理学通讯，1990，(6)：55-57) 一、原理

植物组织器官的衰老总是伴着细胞内膜结构的破坏，表现为细胞内的电解质大量渗漏出来。很多研究结果表明，细胞衰老过程中膜的破坏是由细胞中(特别是线粒体和叶绿体)产生的自由基(如O2·¯、OH·、O2等)使膜脂中的不饱和脂肪酸发生过氧化作用而造成的。膜脂过氧化作用中产生的自由基，它不仅能连续诱发膜脂过氧化作用，而且还可以使蛋白质脱H+而产生蛋白质自由基，使蛋白质分子发生链式聚合，从而使细胞膜变性，最终导致细胞损伤、衰老和死亡。

二、材料、仪器设备与试剂

(一)材料

植物叶片、花瓣等器官

(二)仪器设备

低温高速离心机、微量加样器(1mL、20uL)、精密电子天平、分光光度计、试管、

研钵、剪刀、镊子、烧杯、试管架

(三)试剂

(1)0.05 mol·L-1磷酸缓冲液PH=7.8(0.66304g的NaH2PO4.2H2O和16.3849g的

Na2HPO4.12H2O定溶1000mL，校正PH)

(2)10m mol·L-1盐酸羟胺(NH2OH·HCl，69.49，溶于水)0.3475g定溶到500mL，(冷)

(3)17m mol·L-1对氨基苯磺酸(C6H7NO3S 173.19 1.4721g) 或者(C6H7NO3S·H2O 191.21 1.6253g)定溶到500mL，(冷，磁)

(4)7m mol·L-1α-萘胺，0.5012g定溶到500mL，(乙醇溶解，定溶，溶解完全)

三、试验步骤

(1)制做亚硝酸根标准曲线

2mL系列浓度的NaNO2(5,4,3,2,1,0.5μg/L)加入4mL对氨基苯磺酸和4mLa－萘胺于25℃保温20min，然后测定OD530以［NO2－］和测得的OD530值互为函数作图，制的亚硝酸根标准曲线

(2)取0.2g植物材料，加入1.0mL 0.05 mol·L-1磷酸缓冲液(PH7.8)于冰浴研磨

(3)研磨物以12000r/min离心15min，取上清液0.5mL加入0.5mL磷酸缓冲液和1mL 10m

mol·L-1盐酸羟胺，25℃静置1h

(4)加入1mL17m mol·L-1对氨基苯磺酸和1mL7m mol·L-1α-萘胺，25℃静置20min，测其

530处OD值

四、计算

根据测得的OD值，查标准曲线将花瓣中氧自由基含量的OD值转换成[NO2－]，依据羟胺与O2－的反应式：

NH2OH+2O2－+H+→NO2－+H2O2+H2O

从[NO2－]对[O2－]进行化学计算，将[NO2－]乘以2得到[O2－]。

五、注意：

加样的顺序不能颠倒，25℃是它的反应温度。