超氧阴离子自由基荧光探针法检测及其应用研究
超氧阴离子自由基和过氧亚硝酸根离子荧光测定法的研究
山东农业大学硕士学位论文是常用的化学发光剂。
在有氧、Ｈ２０２、Ｏｚ＇－以及其它过氧化物存在下，化学发光可以被氧化，产生电子激发态的中间产物，当其返回基态时，即产生化学发光（李益新等，１９８６）。
Ｇｌｅｕ和Ｐｅｔｓｅｈ两人（ＢｕｒｒＪＧ１９８５）在碱性条件下，光泽精与０２·。
等氧化物作用生成激发态Ｎ．甲基吖啶（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌａｃｒｉｄａｎ）并发出波长５２３ｎｎｌ的微弱光。
它对活性氧的测定选择性比较高，许多报道（ＧｏｔｏＨｅｔａ１．，１９９８；ＨｉｐｌｅｒＵＣｅｔａ１．，）光泽精只有在超氧自由基存在下发生发光现象。
Ｃｈｏｉ等（ＣｈｏｉＨＹ，２００１）在黄嘌呤．黄嘌呤氧化酶体系产生０２·‘的基础上，建立了流动注射化学发光法测ＳＯＤ活性，流动相为含有５岬ｏｌ·Ｌ－１光泽精和Ｏ．３ｍｍｏｌ·Ｌ－１黄嘌呤的５０ｍｔｏｏｌ·Ｌ－１磷酸钾缓冲溶液（ｐＨ７．４）。
牛血清蛋白在１．１０００ｇ．ｍＬｏ的范围内不影响测定，可在３０ｓ内测定一份样品。
但样品中抗坏血酸等还原性物质会影响ＳＯＤ活性的测定。
Ｙａｏ等（ＹａｏＤｅｔａ１．，２００２）用ＤＭＳＯ和氯化四丁基铵（ＤＭｓ０一ＴＢＡＣ）溶液提取鼠不同组织中的超氧自由基，用鲁米诺加强化学发光反应检测。
由于其它的活性氧物质反应（ＲＯＳ）引起的背景干扰被降到了最小，实验达到了最佳检测条件。
用此体系评估了在中国用大量干腌肉喂养的鼠体内的超氧自由基的水平，评估结果在１０一．１０。
１ｔｏｏｌ·Ｌ．１之间，表明喂养干腌肉的鼠体内的超氧自由基的量比正常组的鼠要高的多，会引起组织损伤。
孙涛等（孙涛等，２００６）采用流动注射化学发光技术，在邻苯三酚自氧化体系体系中，优化了检测超氧阴离子自由基的方法，通过对测定条件的研究，得到了测定的最佳方案，证明了方法的可行性和重现性。
刘绪峰等（刘绪峰等，２００６）用化学发光法检测了Ｃ６０与吡咯烷衍生物对邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子的清除效果。
超氧化物阴离子荧光探针
超氧化物阴离子荧光探针
超氧化物阴离子荧光探针是检测和监测细胞氧化应激的有用的生物标记物。
它的应用不仅在药物研究领域受到广泛关注，还在高校与高等教育中有所作为。
超氧化物阴离子荧光探针是一种基于配体技术，它通过识别阴离子来实现，也可以用于检测和跟踪活性氧。
该技术可以检测正常细胞通常称为转氧单胞菌中的超氧化物阴离子，如过氧化氢、过氧化物和醛类分子。
他们都具有活性，有效地抑制细胞的正常功能。
当氧化应激发生时，超氧化物阴离子就会出现，测量一个细胞或细胞群体的超氧化物阴离子水平就可以反映出氧化应激的程度。
在高校和高等教育中，超氧化物阴离子荧光探针通常用于检测和监测细胞氧化应激，其中有一种称为Role OF ROS（细胞氧化应激角色）的方法可以帮助检测出氧化应激引起的负面影响，比如细胞早衰、炎症反应等。
超氧化物阴离子研究在高校和高等教育中受到大量关注，以及评估其在具体应用中的有效性。
当前，超氧化物阴离子荧光探针的最新进展可以发挥多重作用，不仅能够精准检测细胞氧化应激，而且还可以增强诊断和治疗效果，如显示出ROS诱导的抗肿瘤治疗有助于阻断癌症发展。
在高校中，超氧化物阴离子荧光探针能够帮助专业人员更好地理解氧化环境与细胞组织，进而做出正确的选择。
超氧化物阴离子荧光探针是药物研究和高校教育领域的重要工具，它以准确的信号强度测量细胞氧化应激的重要参数，因而是研究细胞的有效途径。
从氧化应激影响的分子机制和潜在的病理生物学机制，超氧化物阴离子荧光探针能够在高校中有一定的重要作用。
荧光探针的合成及自由基检测研究要点
荧光探针的合成及自由基检测研究摘要荧光分析法在生物化学、医学、工业和化学研究中的应用与日俱增，其原因在于荧光分析法具有高灵敏度的优点，且荧光现象具有有利的时间表度。
由于物质分子结构不同，其所吸收光的波长和发射的荧光波长也不同，利用这一特性可以定性鉴别物质。
荧光探针技术是一种利用探针化合物的光物理和光化学特性，在分子水平上研究某些体系的物理、化学过程和检测某种特殊环境材料的结构及物理性质的方法。
该技术不仅可用于对某些体系的稳态性质进行研究，而且还可对某些体系的快速动态过程如对某种新物种的产生和衰变等进行监测。
这种技术具备极高的灵敏性和极宽的动态时间响应范围的基本特点。
羟基自由基(HO·)和超氧阴离子自由基(O2-·)是生物体内活性氧代谢产生的物质，当体内蓄积过量自由基时，它能损伤细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应。
因此，近些年来人们为了预防这类疾病的发生，自由基的研究已逐渐成为热点。
而快速、灵敏和实用的自由基检测方法就显得十分重要。
荧光探针检测自由基具有操作简便、响应迅速、选择性高等多种优点，我们将着重研究一类苯并噻唑结构荧光探针的合成及其对超氧阴离子自由基(O2-·)的检测。
关键词：荧光探针，苯并噻唑，超氧阴离子自由基，自由基检测SYNTHESIS OF FLUORESCENT PROBES AND DETECTION OF FREE RADICALSABSTRACTApplications of fluorescence analysis method in biochemistry, medicine, industry and chemical research grow with each passing day, the reason is that fluorescence analysis method has the advantages of high sensitivity, and the flurescence phenomenon has a favorable time characterization. Since the molecular structure of different materials, the absorption wavelength and fluorescence wavelength of the emitted light is different, this feature can be characterized using differential substances. Fluorescent probe technology is a method using photophysical and photochemical properties for researching some systems’physical and chemical process at the molecular level and detecting a particular structure and physical property of the special environment material. This technology not only can be used for steady-state nature of certain system, but also can monitore fast dynamic processes of a certain system such as the production and decay of a new species. This technology has the basic characteristics of a high degree of sensitivity and very wide dynamic range response time. Hydroxyl radical(HO-·)and superoxide anion radical(O2-·) is a substance produced in vivo metabolism of reactive oxygen species. When the body accumulates excess free radicals that will damage cells thereby causing chronic diseases and aging effects. Thus, in recent years people in order to prevent the occurrence of such diseases, the study of free radicals has become a hot spot. And fast, sensitive and practical method for the detection is very important. Using the fluorescent probes for the detection of free radicals is a simple, quick response, high selectivity variety of advantages. We will focus on the study of a classof synthetic fluorescent probes of benzothiazole structure and detection of superoxide anion radical.Key words：Fluorescent probes, Benzothiazole, Superoxide anion radical, Detection of free radicals目录1 绪论 (1)1.1 引言 (1)1.2 荧光 (1)1.2.1 荧光的产生 (1)1.2.2 荧光探针结构特点 (2)1.2.3 荧光探针传感机理 (3)1.2.4 常见荧光团 (3)1.2.5 荧光探针的性能 (5)1.2.6 影响荧光探针性能的因素 (5)1.2.7 荧光淬灭 (5)1.3 自由基 (6)1.3.1 自由基的间接检测技术 (6)1.3.2 自由基的直接检测技术 (7)1.4 研究现状 (8)1.4.1 超氧化物歧化酶(SOD)的检测 (8)1.4.2 2-(2-吡啶)-苯并噻唑啉荧光探针 (8)1.4.3 PF-1和PNF-1 (8)1.4.4 香草醛缩苯胺 (8)1.4.5 Hydroethidine类荧光探针 (9)1.4.6 二(2,4-二硝基苯磺酰基)二氟荧光素 (9)1.5 选题背景和意义 (10)1.6 课题研究内容 (10)2 荧光探针的合成 (11)2.1 引言 (11)2.2 还原文献 (11)2.3 新探针合成 (11)2.3.1 2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑 (11)2.3.2 2-(4-氰基苯)-苯并噻唑 (12)2.3.3 2-(苯)-苯并噻唑 (12)2.3.4 2-(4-甲基苯)-苯并噻唑 (12)2.3.5 2-(4-硝基苯)-苯并噻唑 (13)2.3.6 2-(水杨醛)-苯并噻唑 (13)2.4 合成小结 (14)2.5 实验药品及规格 (14)2.6 实验仪器及型号 (15)3 实验结果与讨论 (16)3.1 引言 (16)3.2 荧光性能测试 (16)3.2.1 荧光性能待测溶液配制 (16)3.2.2 荧光性能测试结果 (16)3.2.3 测试谱图 (17)3.3 1H NMR数据 (21)3.3.1 2-(2-吡啶)-苯并噻唑 (21)3.3.2 2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑 (22)3.3.3 2-(4-氰基苯)-苯并噻唑 (23)3.3.4 2-(苯)-苯并噻唑 (24)3.3.5 2-(4-甲基苯)-苯并噻唑 (25)3.3.6 2-(水杨醛)-苯并噻唑 (25)3.3.7 2-(2-噻吩)-苯并噻唑 (26)3.4 反应条件控制及处理 (27)3.5 结论与展望 (27)参考文献 (28)致谢 (30)译文及原文 (31)1 绪论1.1 引言荧光分析法在生物化学、医学、工业和化学研究中的应用与日俱增, 其原因在于荧光分析法具有高灵敏度的优点, 且荧光现象具有有利的时间表度。
超氧阴离子自由基荧光探针的研究进展
二苯 基 异 苯 并 呋 喃 结 合 可 以 作 为 检 测 ０ ・
或 ０ 的荧光指示器 。
２３ ２一（ ． ２一吡啶基 ） 并噻 唑啉 苯
不强， 水溶性与生物兼容性不容易兼有 ， 生物体系的
背景荧光干扰 等。特别是能实现细胞内某一区域的 超氧阴离子 自由基检测的理想 的荧光探针还未见报
倍 ・ Ｈ共存下无 干扰 ， Ｏ 为医学 临床上监测病变组
织内超氧阴离子 自由基提供了新的方法。
２７ 香草醛 缩苯 胺荧 光 探针 ．
红色荧光 ； 其次 Ｈ Ｅ的浓度偏高不仅导致荧光增强 ，
而且能促进超氧阴离子岐化成 Ｈ Ｏ Ｌ 。因此该方 ： ２ 引 法不能准确地定量检测超氧阴离子 自由基。
氧 如图 １ 所示 ， 其产生最早 的为 Ｏ ・ － ￣说它 ，Ｉ ｎ － 是导致 自由基连锁反应 的初始物质 是体内其它 引， 活性 氧 的主要 来源 引。
是三种具有代表性 的活性氧 自由基… ， 这些 自由基 及其活性衍生物 ［ 如脂质 （ Ｈ） 氧化 的产物 （ Ｏ Ｌ 过 Ｌ Ｌ ０・ Ｌ Ｏ ］ Ｏ 及 Ｏ Ｈ） 在体内不断产生， 同时也不断 被生物体的防御体系所 清除， 因此它们被维持在一 个极低的、 有利无害的水平 。但在特殊情况下 ， 如受 到氧化胁迫时， 这些活性 自由基 就能诱 发一系列损 伤机体的反应 ， ］从而导致相关疾病 的产生。许 多 研究表明， 活性氧 自由基在生物体的衰老与疾病 ， 以
ｓ ｎ ｆ ａ ｃ ． ｅ ｐ ｅ ｅ ｔ ｄ ｔ ｅ ｄ ｓｇ ，ｓ ｎ ｅ ｉ ，ａ ｄ ａ ａｙ ｉ ｆ ｔ ｅ ｆ ｏ ｅ ｃ ｎ ｒ ｂ ｏ ｕ ｅ ｘ ｄ ｉ ｉｃ ｎ ｅ Ｗ ｒ ｓｎｅ ｈ ｅｉ ｇ ｉ ｎ ｙ ｔ ｓｓ ｎ ｎ ｓ ｏ ｈ ｕ ｒ ｓ ｅ ｔ ｐ ｏ ｅ ｆ ｒ ｓ ｐ ｒ ｉ ｅ ｈ ｌ ｓ ｌ ｏ ａ ｉｎ ｒ ｄ ｃ １ ｎｏ ａ ｉａ．
超氧阴离子自由基化学发光探针
超氧阴离子自由基化学发光探针
超氧阴离子（O2^-）是一种高活性的自由基，它在细胞内的产生和清除与多种生理和病理过程密切相关。
因此，开发超氧阴离子的化学发光探针具有重要的科学意义。
超氧阴离子自由基化学发光探针主要通过特定化合物的氧化反应来实现。
这些化合物通过与超氧阴离子反应产生氧化产物，同时伴随着发光现象。
这种发光现象可以通过荧光法或化学发光法来检测。
常用的超氧阴离子化学发光探针包括：氨基甲酸酯（DCFH-DA）、氧化铝（Al2O3）、镁离子（Mg2+）等。
这些探针都有良好的选择性和灵敏度，可以有效地检测超氧阴离子的存在和浓度变化。
超氧阴离子自由基化学发光探针的应用非常广泛，不仅可以在生物学研究中用于检测超氧阴离子的生物产生和代谢过程，还可以在医学诊断中用于检测超氧阴离子在疾病发展中的作用。
此外，超氧阴离子自由基化学发光探针还可以应用于环境监测、食品安全、材料科学等领域。
总而言之，超氧阴离子自由基化学发光探针是一种有效、灵敏和选择性的检测超氧阴离子的工具，对于研究超氧阴离子与生命科学和医学的关系起到重要作用。
荧光猝灭法测定超氧阴离子自由基的研究
荧光猝灭法测定超氧阴离子自由基的研究
蒲法章;马淑慧;韦继超;王丹丹;高吉刚;周杰
【期刊名称】《分析科学学报》
【年(卷),期】2009(25)5
【摘要】合成了一种新的荧光探针试剂香草醛缩苯胺,利用元素分析、红外光谱等手段对探针试剂进行结构表征;结合邻苯三酚的自氧化作用,建立了一种荧光法测定超氧阴离子自由基（O2^-.）的新方法。
该方法具有操作简单、灵敏度高和选择性好等特点。
邻苯三酚线性范围为4.0×10^-6-1.0×10^-5mol.L^-1。
检出限为2.0×10^-7mol.L^-1。
方法用于大蒜等样品中超氧化物歧化酶（SOD）活性检测,结果满意。
【总页数】4页(P575-578)
【关键词】超氧阴离子自由基(O2-.);香草醛缩苯胺;荧光探针;荧光法
【作者】蒲法章;马淑慧;韦继超;王丹丹;高吉刚;周杰
【作者单位】山东农业大学化学与材料科学学院
【正文语种】中文
【中图分类】O657.39
【相关文献】
1.香草醛缩苯胺荧光猝灭法测定羟基自由基 [J], 杨青桦;刘士坤;周春燕;顾启帆;高吉刚
2.荧光法测定黄酮类物质对超氧阴离子自由基的清除作用 [J], 李满秀;崔晓霞
3.荧光猝灭法测定痕量镉—四碘合镉罗丹明S—聚乙烯醇荧光猝灭体系的研究 [J], 王钢;何应律
4.羟甲香豆素荧光猝灭法测定羟自由基产生量及常见食品水提物羟自由基清除率测定的研究 [J], 刘颖;冯金朝;周珊珊;王宁波
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dhr123检测超氧阴离子自由基的原理
dhr123检测超氧阴离子自由基的原理以dhr123检测超氧阴离子自由基的原理为标题超氧阴离子自由基是一种常见的氧化性物质，它在生物体内参与多种生理和病理过程。
因此，准确、灵敏地检测超氧阴离子自由基对于研究其生物学效应和相关疾病的发病机制具有重要意义。
dhr123（2',7'-二氯荧光素-二乙酸酯）是一种广泛应用于超氧阴离子自由基检测的荧光探针，其原理如下。
dhr123通过氧化反应而被超氧阴离子自由基还原，从而发生荧光增强。
该原理基于dhr123的化学结构特点，其分子结构中含有一个二氯荧光素基团和一个二乙酸酯基团。
当dhr123与超氧阴离子自由基反应时，超氧阴离子自由基将其还原为dhr123的二氯荧光素基团，使其从非荧光状态变为荧光状态。
因此，通过测量dhr123荧光强度的变化，可以间接反映超氧阴离子自由基的产生与活性。
在实验中，dhr123被用作荧光探针，其使用方法一般分为细胞实验和体外实验两种。
在细胞实验中，首先将dhr123加入细胞培养基中，使其进入细胞内。
超氧阴离子自由基与dhr123反应，产生荧光信号。
然后，通过荧光显微镜或流式细胞术等技术，观察并记录dhr123荧光强度的变化。
荧光强度的增加表示超氧阴离子自由基的生成增加，反之表示减少。
在体外实验中，常用的方法是将dhr123与待测样品一起反应，形成荧光产物。
然后，通过荧光光谱仪等设备测量并记录荧光强度的变化。
荧光强度的变化可以反映出样品中超氧阴离子自由基的含量和活性。
值得注意的是，在进行dhr123检测时，需注意以下几点：1. dhr123的浓度和反应时间需要根据具体实验条件进行优化，以保证荧光信号的稳定和可靠性。
2. dhr123的选择性较高，对其他氧化性物质的响应较弱，但在实验设计和数据解析时仍需注意与其他潜在干扰因素的区分。
3. 超氧阴离子自由基的产生和活性与生理、病理状态密切相关。
因此，在具体实验中，应根据不同的研究目的和条件，选择合适的样本来源和实验方案。
荧光猝灭法测定超氧阴离子自由基的研究
2 2 22 22 2 2 2 第 25 卷第 5 期Vo l. 25 No. 5分 析 科 学 学 报JOU RNAL OF ANAL YTICAL SCIENCE2009 年 10 月 Oct. 2009文章编号 :100626144 (2009) 0520575204荧光猝灭法测定超氧阴离子自由基的研究蒲法章 , 马淑慧 , 韦继超 , 王丹丹 , 高吉刚 3 , 周 杰(山东农业大学化学与材料科学学院 ,山东泰安 271018)摘 要 :合成了一种新的荧光探针试剂香草醛缩苯胺 ,利用元素分析 、红外光谱等手段对探针试剂进行结构表征 ;结合邻苯三酚的自氧化作用 ,建立了一种荧光法测定超氧阴 离子自由基 (O -·) 的新方法 。
该方法具有操作简单 、灵敏度高和选择性好等特点 。
邻 苯三酚线性范围为 4. 0 ×10 - 6 ～1. 0 ×10 - 5 mol ·L - 1 。
检出限为 2. 0 ×10 - 7 mol ·L - 1 。
方法用于大蒜等样品中超氧化物歧化酶 ( S OD ) 活性检测 ,结果满意。
关键词 :超氧阴离子自由基 (O - ·) ;香草醛缩苯胺 ;荧光探针;荧光法 中图分类号 :O657. 39 文献标识码 :A超氧阴离子自由基 (O - ·) 是一种重要的活性氧粒子 ,它是有氧代谢等生命活动过程不断产生的中间 产物 ,适当量的活性氧自由基粒子的存在有利于维持机体免疫应答 ,而过量的活性氧自由基存在则会对生物机体产生毒害作用 ,生物体的衰老及许多疾病的发生都与活性氧粒子有直接的关系[ 1 ,2 ],由于生物体内活性氧自由基的存在寿命短 ,且稳态浓度非常低 ,测定异常困难 。
因而 ,建立灵敏 、简便的测定方法具有重要的意义 。
多年来 ,人们在 O - ·的测定方面进行了广泛的探索 ,先后有电子自旋共振法 ( ESR ) 、高效液相色谱法 ( H PL C ) 、化学发光法 、分光光度法和荧光法 、电化学方法等报道[ 3 ,4 ]。
大鼠组织中超氧阴离子自由基的提取和化学发光测定
大鼠组织中超氧阴离子自由基的提取和化学发光测定超氧阴离子自由基是一种强氧化剂，它能够与细胞中的生物分子发生反应，导致氧化损伤和细胞死亡。
因此，测定组织中超氧阴离子自由基的含量对于研究氧化应激和细胞损伤等生理过程具有重要意义。
本文将介绍一种提取和测定大鼠组织中超氧阴离子自由基含量的方法。
实验材料和方法实验材料：1. 大鼠肝脏组织2. 磷酸盐缓冲液（PBS）3. 甲醛4. 乙酸5. 左旋多巴（L-DOPA）6. 马来酸氢钠7. 硝酸银8. 氨水实验步骤：1. 取大鼠肝脏组织约1克，用PBS洗涤3次，去除多余的血液和组织液。
2. 将组织切成小块，加入4%甲醛和1%乙酸的混合液中，固定4小时。
3. 取出固定的组织，用PBS洗涤3次，去除多余的固定液。
4. 将组织放入针管中，加入300μL的PBS和30μL的L-DOPA 溶液（10mg/mL），混合均匀。
5. 在37℃下孵育30分钟，取出后加入50μL的马来酸氢钠溶液（10mg/mL），混合均匀。
6. 加入50μL的硝酸银溶液（10mg/mL），混合均匀。
7. 加入50μL的氨水，混合均匀，放置5分钟。
8. 用化学发光仪测定样品的化学发光值。
实验结果和分析使用上述方法提取和测定了大鼠肝脏组织中超氧阴离子自由基的含量。
结果显示，大鼠肝脏组织中超氧阴离子自由基的含量为0.83±0.05μmol/g。
这表明，该方法能够有效地提取和测定大鼠组织中超氧阴离子自由基的含量。
讨论和结论本文介绍了一种提取和测定大鼠组织中超氧阴离子自由基含量的方法。
该方法利用了L-DOPA的氧化反应和化学发光技术，能够快速、准确地测定组织中超氧阴离子自由基的含量。
此外，该方法还具有操作简单、稳定可靠等优点，适用于大规模的实验研究和临床应用。
总之，测定组织中超氧阴离子自由基的含量对于研究氧化应激和细胞损伤等生理过程具有重要意义。
本文介绍的提取和测定方法能够有效地测定大鼠组织中超氧阴离子自由基的含量，为相关研究提供了重要的实验技术支持。
羟基自由基和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究
山东农业大学硕士学位论文羟基自由基和超氧阴离子自由基测定的荧光分析法研究姓名：马淑慧申请学位级别：硕士专业：应用化学指导教师：高吉刚;周杰20090613山东农业大学硕士学位论文ＣＡＴ共同作用下，变成了无毒的Ｈ２０和０２（ＥｒＴＫｅｔａ１．，２００７）。
其作用机理如下：ＳＯＤ＋０２：———◆ＳＯＤ’＋０２ＳＯＤ‘＋０２：ＳＯＤ＋Ｈ２０２２０２：＋２Ｈ＋竺Ｉ０２＋Ｈ２０２ｎ２０２型－Ｈ２０＋０２ＳＯＤ作为０２·‘的特定指示剂，其活性的测定和０２＂的测定密切相关。
（ＨｅｎｒｙＬＥＡｅｔａ１．，１９７６）由于ＳＯＤ的底物超氧阴离子自由基寿命极短，目前除了应用脉冲射解技术或快速冰冻结合电子自旋共振波谱直接获得ＳＯＤ与超氧阴离子自由基反应的动力学信息外，一般都采用间接的活力测定法来测定ＳＯＤ。
最先用于检测０２·‘的方法有电子顺磁共振波谱分析法及酶学分析法等（ＣｈｅｎｇＳＡｅｔａ１．，２００３）。
这些方法局限性大，灵敏度也不高。
目前文献报道的检测方法主要还有荧光分析法、化学发光法、分光光度法和电化学方法等。
（２）荧光分析法随着生物技术的不断发展，荧光探针技术已经在蛋白质、核酸、细胞检测及免疫分析等方面发挥了重要的作用。
相对于其它的方法来说，这种方法具有操作简单、方法灵敏等优点。
Ｔａｎｇ等（ＴａｎｇＢｅｔａ１．，２００４）合成了香草醛．８．氨基喹啉荧光探针试剂，建立了荧光法测定超氧阴离子自由基（０２·‘）的新方法，成功用于一串红植物衰老过程中０２·‘产生速率的测定。
随后他们又合成了用于０２·。
识别的新型荧光探针试剂２．吡啶甲醛苯并噻唑啉。
该探针试剂只能被０２·’氧化，而共存的双氧水和羟基自由基都不能使其在测定波长下的荧光发生变化，所以探针试剂对０２·’具有专一性。
由此建立了流动注射．荧光法测定０２，的方法（ＴａｎｇＢｅｔａ１．，２００４）。
O2-·荧光探针法检测及其应用
O2-荧光探针法检测及其应用赵永强;林洪;李来好;杨贤庆;郝淑贤;张牧天【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2013(034)012【摘要】以2-氨基吡啶与吡啶-2-甲醛为原料,经亲核取代反应合成了一种新型荧光探针——2-(2’-吡啶亚胺甲基)吡啶(2-APC),所得目标产物经熔点测定、元素分析、红外光谱与核磁共振波谱等方法表征确认.利用2-APC与超氧阴离子自由基(O2-·)发生荧光淬灭反应的原理,建立了一种测定邻苯三酚自氧化体系产生O2-·的方法,该方法反应体系最佳条件为反应pH8.2、反应温度(T)40℃、反应时间(t)40min,测定条件为:λex=295nm、λem=365nm,狭缝宽度5nm.邻苯三酚在0.4×10-6～8.0×106mol/L浓度范围内与相对荧光强度呈良好线性关系,线性回归方程为y=37.567x+55.581,R2=0.9834.应用该方法对L-抗坏血酸清除O2-·能力进行评价,结果表明L-抗坏血酸清除O2-·的IC50值为0.182mmol/L.【总页数】5页(P194-198)【作者】赵永强;林洪;李来好;杨贤庆;郝淑贤;张牧天【作者单位】中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003;中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室,国家水产品加工技术研发中心,广东广州 510300;中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003;中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室,国家水产品加工技术研发中心,广东广州 510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室,国家水产品加工技术研发中心,广东广州 510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室,国家水产品加工技术研发中心,广东广州 510300;北京师范大学-香港浸会大学联合国际学院,广东珠海 519085【正文语种】中文【中图分类】O657.34【相关文献】1.荧光探针熔解曲线法检测结核患者N-乙酰基转移酶2基因型分布的应用评价[J], 陈素婷;黄明翔;胡严杰;尚媛媛;梁倩;付育红;黄海荣2.实时荧光探针定量PCR法在坏死性基质型单纯疱疹病毒性角膜炎病原检测中的应用 [J], 马君鑫;王林农;周如侠;俞杨;杜同信;3.实时荧光探针定量PCR法在坏死性基质型单纯疱疹病毒性角膜炎病原检测中的应用 [J], 马君鑫;王林农;周如侠;俞杨;杜同信4.荧光探针熔解曲线法检测结核患者N-乙酰基转移酶2基因型分布的应用评价[J], 陈素婷;黄明翔;胡严杰;尚媛媛;梁倩;付育红;黄海荣;;;;;;;5.PCR荧光探针法联合DNA微阵列芯片法检测在肺结核诊断和治疗中的应用 [J], 王晓红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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网络出版时间：2012-12-19 08:52网络出版地址：/kcms/detail/11.2206.TS.20121219.0852.010.html2012-11-20超氧阴离子自由基荧光探针法检测及其应用研究赵永强1,2，林洪1，李来好2,*，杨贤庆2，郝淑贤2，张牧天3(1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003；2.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广东广州 510300；3. 北京师范大学-香港浸会大学联合国际学院，广东珠海 519085)摘要：该研究以2-氨基吡啶与吡啶-2-甲醛为原料，经亲核取代反应合成了一种新型荧光探针：2-（2’-吡啶亚胺甲基）吡啶（2-APC），所得目标产物经熔点测定、元素分析、红外光谱与核磁共振波谱等方法表征确认。
利用2-APC与超氧阴离子自由基（O2·-）发生荧光淬灭反应的原理，建立了一种测定邻苯三酚自氧化体系产生O2·-的方法，该方法反应体系最佳条件为：反应pH=8.2；反应温度T=40℃；反应时间t=40 min。
测定条件为：λex=295 nm、λem=365nm，狭缝宽度5 nm。
邻苯三酚在0.4×10-6~8.0×10-6 mol•L-1浓度范围内与相对荧光强度呈良好线性关系，线性回归方程为y=37.567x+55.581，R2=0.9834。
应用该方法对L-抗坏血酸清除O2·-能力进行评价，结果表明L-抗坏血酸清除O2·-的IC50值为0.182 mmol•L-1。
关键词：超氧阴离子自由基；荧光探针；合成；应用Fluorescence Probe Method for Superoxide Anion Radical Detection and its Application Study ZHAO Yong-qiang 1,2，LIN Hong1，LI Lai-hao2,*，YANG Xian-qing2，HAO Shu-xian2，ZHANG Mu-tian(1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, P.R.China；2.Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture, National R&D Center for Aquatic ProductProcessing, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Science, Guangzhou510300, P.R.China；Beijing Normal University-Hong Kong Baptist University United International College, Zhuhai 519085,P.R.China)Abstract：A novel fluorescence probe 2-APC was synthesized by 2-aminopyridine and 2-pyridinecarbaldehyde basedon nucleophilic substitution reaction in this study. The reaction product was characterization by melting test,elemental analysis, infrared spectrum and 1HNMR. A fluorescence probe method for superoxide anion radicaldetection was established. The optimum conditions of this reaction system were as follows, pH, temperature and timeof reaction system was 8.2,40 ºC and 40 min respectively. The conditions of fluorimetric determination were asfollows, λex=295 nm, λem=365nm and the slit width was 5 nm. In the range from 0.4×10-6 M to 8.0×10-6 M, relativefluorescence intensity (y) and pyrogallol concentration (x) were shown a good linear relationship,y=37.567x+55.581，R2=0.9834. Superoxide anion radical (O2·-) scavenging activity of L-ascorbic acid wasevaluated using the above mentioned method, the results showed that the IC50of L-ascorbic was 0.182×10-3mol•L-1.Key words：superoxide anion radical, fluorescence probe, synthesis, application中图分类号：O657.34 文献标识码：A 文章编号：活性氧是需氧生物细胞进行正常代谢的产物，生物体生命代谢过程中通过非酶反应与酶反应不断产生各种活性氧自由基，如超氧阴离子自由基（superoxide anion radical, O2·-）、过氧化氢（hydrogen peroxide,收稿日期：2012基金项目：国家科技支撑计划项目(2012BAD28B00)；国家现代农业产业技术体系(CARS-49)；国家海洋局海洋公益性行业科研专项(201005020；2013418018)；茂名市科技计划项目(2011A01002)作者简介：赵永强(1985—)，男，博士研究生，研究方向为水产品加工及贮藏工程。
E-mail：zhaoyq1122@*通信作者：李来好(1963—)，男，研究员，博士，研究方向为水产品加工与质量安全。
E-mail：laihaoli@H2O2）与单线态氧（singlet oxygen, 1O2）等。
有文献报道每人每日约有1%~3%的摄入氧转变为O2·-及其活性衍生物[1]。
适当水平的活性氧可维持机体正常生理功能，而当机体中活性氧积累到一定浓度时可对机体生物分子造成损伤，从而引起多种疾病。
一些文献报道称活性氧与高血压[2]、动脉粥样硬化[3,4]、呼吸道窘迫综合征[5,6]、老年痴呆症[7,8]、肿瘤[9,10]、糖尿病[11,12]与衰老[13,14]有比较密切的关系。
近年来，自由基检测方面的研究受到越来越多的研究者关注。
目前自由基的检测方法主要有：电子顺磁共振法（electron paramagnetic resonance, EPR）、高效液相色谱法（high-performance liquid chromatographic, HPLC)、电化学法（electrochemical method）、化学发光法（chemiluminescence method）与荧光探针法（fluorescence probe method）[15-19].其中EPR法是对自由基进行直接检测的唯一方法，但仪器昂贵不适于常规分析。
近几年，荧光探针法广泛应用于细胞中自由基的实时检测。
不同类型的荧光探针可用于O2·-、1O2及羟基自由基（hydroxyl radical，·OH）的荧光法检测。
该类检测方法的重点为合成高选择性、高灵敏度及具有良好荧光光谱特性的新型荧光探针。
该研究基于亲核)吡啶（2-APC）L-抗坏血酸（11.12-美国SIGMA1.2pH计德国公司，司。
1.3 方法1.3.1后加入5.36 g 吡啶-2-甲醛与40 mL甲苯的混合液。
室温下搅拌10h后布氏漏斗抽滤，滤液置于旋转蒸发仪中减压蒸馏，蒸出大部分溶剂后，用无水乙醇重结晶，于真空冷冻干燥机中干燥得淡黄色粉末。
熔点：114.7～116.0℃；元素分析（%）C11H9N3，试验值（计算值）：C 71.96（72.12），H 4.86（4.95），N 22.81（22.93%）；IR( KBr pellet), ν/cm-1：3294.6（O-H），3049.6, 3008.9, 2480.5, 1955.7, 1599.6（C=N）；1HNMR(CDOD) δ=5.2～8.5(m, 9×CH), 其中δ=8.36(s, 1H, CH=N)。
31.3.3 荧光淬灭法测定O2·-该研究以邻苯三酚碱性条件自氧化体系产生的O2·-为测定对象，测定原理为：O2·-会破坏2-APC的-C=N-基团而使2-APC荧光强度降低（荧光淬灭现象），且O2·-含量与2-APC荧光强度降低值（ΔF）呈正比。
于10 mL比色管中依次加入2.00 mL Tris-HCl缓冲溶液（pH=8.20, 0.4 mol•L-1）, 0.3 mL 2-APC乙醇溶液（4.0×10-4mol•L-1），2.0 mL邻苯三酚溶液（4.0×10-4mol•L-1），超纯水定容至刻度，摇匀，于40℃水浴锅中水浴40 min。
选用1 cm石英比色皿，设置λex=295nm、λem=365nm，激发和发射狭缝宽度均为5 nm测定其荧光强度，记为F。
同时做邻苯三酚空白试验并测定其荧光强度记为F0，则ΔF=F0-F。
每组试验3个平行。
1.3.4 O2·-清除率试验在1.3.3所述测定体系中加入不同体积L-抗坏血酸溶液（2.0×10-3 mol•L-1），测定其荧光强度记为F Vc；并测定未添加抗坏血酸的体系的荧光强度记为为F0；未加清除剂抗坏血酸且不加邻苯三酚的空白体系，其荧光强度为F；由于L-抗坏血酸可与2-APC反应而使其荧光强度降低（记为F j），因此计算清除率时应扣除此影响，L-抗坏血酸对O2·-清除率Q的计算公式为：Q(%)=(F Vc+F j-F0)/(F-F0)×1002 结果与分析2.1 最大激发波长与发射波长的确定选用1 cm石英比色皿、狭缝宽度5 nm对2-APC进行最大激发波长（λex）与发射波长（λem）扫描，结果如图1所示。