动植物细胞大规模培养
微生物发酵简答题
简答题1、请简述发酵工程发展史上的四个转折点。
答：第一个转折点：非食品工业；第二个转折点：青霉素→抗菌素发酵工业；第三个转折点：切断支路代谢:酶的活力调控,酶的合成调控(反馈控制和反馈阻遏),解除菌体自身的反馈调节, 突变株的应用,前体、终产物、副产物等；近代转折点：基因、动物、海洋2、请简述20世纪70年代现代生物技术取得的标志性进展有哪些？答：细胞融合技术、基因操作技术等生物技术发展，打破了生物种间障碍，能定向地制造出新的有用的微生物；基因组与基因组功能；细胞大规模培养──微生物、动植物细胞、藻类细胞等。
3、请简述工业化生产对菌种的要求有哪些？答：能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物；有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强；遗传性能要相对稳定；不易感染它种微生物或噬菌体；生产菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）；生产特性要符合工艺要求。
4、请简述菌种选育与分子改造的目的与方法。
答：目的：防止菌种退化；解决生产实际问题；提高生产能力；提高产品质量；开发新产品。
方法：基因突变：自然选育、诱变育种；基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程；基因的直接进化：点突变、易错PCR、同序法DNA Shuffling 等.5、请简述工业生产对发酵培养基的要求。
答：1.培养基能够满足产物最经济的合成。
2.发酵后所形成的副产物尽可能的少。
3.培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。
4. 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。
6、请解释在发酵培养基中添加产物促进剂为什么能够提高产量？答：促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。
有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产；也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。
植物细胞的大规模培养
影响悬浮细胞生长的因素：
起始愈伤组织的质量
接种细胞密度 培养条件：方式、温度 继代周期
细胞生长情况分析测定方法：
1、细胞计数：单位体积细胞浓度；
2、细胞体积：培养物离心后测定细胞层所占的体积； 3、细胞鲜重或干重：过滤或干燥后称重 4、有丝分裂指数：有丝分裂细胞占总细胞的百分数
细胞活力测定
质不断补充，细胞保持在增值最快的对数生长期
封闭式：回收流出的细胞于培养系统中，细胞数目增加 开放式：流出的细胞不回收于培养系统中，但进行细胞收获 半连续培养：新鲜培养液每隔一段时间添加，用过的培养液平衡排 出，营养物质不断补充
细胞培养同步化：
1、物理法
1）体积分选 2）冷处理法 2、化学法
1）饥饿法
植物细胞固定化的技术
按其支持物可分为两大类： 1.包埋式： 琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺
维
悬浮培养
悬浮培养优点：
增加培养细胞与培养液的接触面积，改善营
养供应
避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而
对细胞自身产生毒害
保证氧气的充分供应等。
悬浮细胞培养的类型有：
成批培养：只有一定的气体交换，营养物质耗尽，细胞和产物一次 性收获。
连续培养：新鲜培养液连续添加，用过的培养液平衡排出，营养物
特点：细胞固定，而培养液循环流动
细胞固定化意义（优点）：
1）细胞生长较慢，有利于次生代谢物的积累。
2）易控制化学环境、收获次生代谢产物。 3）细胞经包埋后受剪切力损伤小。 4）有利于进行连续培养和生物转化。
动植物细胞大规模培养
动物细胞大规模培养技术-培养基组成
二、动物细胞培养基组成及制备
1、培养基组成
天然培养基
使用最早，营养成分高，也最为有效。 成分复杂，个体差异大，来源也缺乏，因而使用受到限制。 动物血清是细胞培养中用量最大的天然培养基
合成培养基
合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合 成的，具有一定的组成。 它给细胞提供了一个近似体内生存环境，又便于控制和标 准化的体外生存环境。 合成培养基的种类虽多，但一般都含有氨基酸、维生素、 碳水化合物、无机盐和一些其它辅助性成分。
营养成分 尽管植物细胞能在简单的合成培养基生长，但营养成
分对植物细胞培养和次生代谢产物的生成仍有很大的影响。营养 成分一方面要满足植物细胞的生生长所需，另一方面要使每个细 胞都能合成和积累次生代谢产物。普通的培养基主要是为了促进 细胞生长而设计的，它对次生代谢产物的产生并不一定最合适。
植物细胞大规模培养技术-培养因素
从培养方式来看，动物细胞无论是贴壁培养或是悬浮培养， 均可采用分批式、分批补料式、半连续式、连续式等多种培 养方式。从培养系统来看，主要采用中空纤维培养系统和微 载体系统，且以灌注式连续培养方式为佳。
动物细胞大规模培养技术-培养方法
三、动物细胞培养方法和环境要求
2、动物细胞培养的环境要求
影响动物细胞生长、繁殖的环境因素很多，主要有细胞生长 的支持物、气体交换、培养温度、pH、渗透压及其它因素等 方面。
一、植物细胞培养基组成及制备
植物细胞培养，不同培养阶段必需采用不同培养基。培养基 主要由碳源、有机氮源、无机盐、植物生长激素、有机酸和一些 复合物质组成。
碳源
蔗糖或葡萄糖是常用的碳源。通常增加培养基中蔗糖的含量，可 增加培养细胞的次生代谢产物量。
动物细胞和植物细胞培养反应器
六叶罗式搅拌器实物图
后来，有人使用锚式搅拌器和螺旋式搅拌器进行植物细胞的培养，
也取得了较好的效果。一般认为螺旋式搅拌器效果最优。
锚式搅拌器和螺旋搅拌器植物细胞培养反应器
吸筒式搅拌器和帆式搅拌器也常用于植物细胞的悬浮培养中， 其结构如下图所示。吸筒式搅拌器的结构原理在本章动物细胞培养 反应器中会有详细介绍，帆式搅拌器结构相对简单，由四片较大的 搅拌叶组成。这两种搅拌在使用时转速都不高，一般在30～80转/分。
吸管式搅拌器和帆式搅拌器
搅拌桨是用尼龙丝编织带制成帆形，搅拌轴用磁力驱动旋转， 转速为20~50r/min，氧气通过插入溶液中的硅胶管扩散到培养 液内，以维持培养液内一定的溶解氧水平。
带帆形搅拌器的连续灌注系统培养反应器
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第
三
章
植物细胞和动物细胞 培 养 反 应 器
动植物细胞培养与微生物细胞培养有很大的不同。 动物细胞培养与微生物培养区别： • 动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固体或半固 体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨基酸、维生素、盐类、 葡萄糖或半乳糖外，还需有血清。动物细胞对环境敏感，包括pH、 溶氧、温度、剪切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监 测和控制。 植物细胞培养与微生物培养区别： • 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细胞培养一 般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养产物，以及植物细胞生 长较微生物要缓慢，长时间的培养对无菌要求及反应器的设计也提 出特殊的要求。
悬浮培养瓶
小规模悬浮培养
3、固定化培养：是指采用吸附（固体吸附剂）、共价贴附 （与固相载体结合）、共价交连（用试剂处理使细胞间形 成桥而絮结）、包埋（将细胞包埋在多孔材料内）等方法 将细胞固定在支持物上，或将细胞嵌入微囊或高分子聚合 物的网络中进行培养。该方法对贴壁依赖性细胞与非贴壁 依赖性细胞均适用。
动植物细胞培养
动植物细胞培养动植物细胞培养是指动、植物细胞在体外条件下的存活或生长。
动植物细胞培养与微生物细胞培养有很大的不同（表14-1）。
由于动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血清。
动物细胞对环境敏感，包括pH值、溶氧、C02、温度、剪切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测和控制。
相比之下，植物细胞对营养要求较动物细胞简单。
但植物细胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养产物，而且植物细胞生长较微生物要缓慢，因此长时间的培养对无菌条件及反应器的设计具有特殊的要求。
在生物技术中，人们已经利用细菌、丝状真菌的大量培养来生产各种酶、抗生素、蛋白质、氨基酸等产物，但是很多有重要价值的生物物质，如毒素、疫苗、干扰素、单克隆抗体、色素、香味物质等，必须借助于动、植物细胞的大规模培养来获得。
从20世纪50年代以来，这方面已取得一些进展。
但是，目前的技术还远不能满足细胞生物产品应用的要求，随着动植物培养技术研究的深入，显示出广阔的发展前景。
表14-1 动植物、微生物细胞的培养特征第一节动物细胞大规模培养技术动物细胞体外培养的历史可追溯到1907年，美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基成功地在试管中培养了蛙胚神经组织达数周，创立了体外组织培养法。
1962年，其规模开始扩大，随着细胞生物学、培养系统及培养方法等领域的不断丰富和完善，动物细胞培养技术得到了很大的发展。
发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。
其发展简史见表14-2。
利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50%。
大量资料表明，生物技术药物是当前新药开发的重要领域，生物技术制药工业是下一个10年制药工业的重要新门类，期间将有数百种生物技术新药上市。
动植物细胞大规模培养
动植物细胞大规模培养
一、植物细胞培养过程特点
1 、植物细胞的特性－－成团 植物细胞要大得多，其平均直径要比微生物细胞
大30～100倍。 同时植物细胞通常是以细胞数在2～200之间，直
径为2mm左右的非均相集合细胞团的方式存在。 细胞团通常由以下几种方式存在： ①在细胞分裂后没有进行细胞分离； ②在间歇培养过程中细胞处于对数生长后期时，
时间后，以一定速度连续采集细胞与培养液， 并以同样速度供给新鲜培养基，此种培养方式 可使细胞生长环境长期维持恒定。 连续培养法细胞生产能力一般较分批法高，但 因细胞生长缓慢，培养时间长，要维持系统无 菌状态，技术条件要求相当苛刻。
动植物细胞大规模培养
植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于 植物细胞培养一般要求在高密度下才能得到一 定浓度的培养产物，以及植物细胞生长较微生 物要缓慢，长时间的培养对无菌要求及反应器 的设计也提出特殊的要求。
动植物细胞大规模培养
动植物、微生物细胞的培养比较
微生物
动物细胞
植物细胞
大小
1-10
10-100
10-100
动植物细胞大规模培养
二、培养基
培养基的成分由无机盐类、碳源、维生 素、植物生长激素、有机氮源、有机酸 和一些复合物质组成。
选择培养基的基本原则： ✓ 需要根据不同培养对象、培养目的及培
养条件探索适宜培养基。 ✓ 选择的培养基在培养过程使细胞总体积
倍增时间1天左右为宜。
动植物细胞大规模培养
三、培养方式
低 动植物细胞大规模培养
较复杂 慢，倍增时间 24-74小时 内部、激素 能忍受广泛范围 有 高 有时使用
低
第一节 植物细胞培养技术
医药生物技术分类与详解
医药生物技术分类与详解（一）医药生物技术1、新型疫苗具有自主知识产权且未曾在国内外上市销售的、预防重大疾病的新型高效基因工程疫苗，包括：预防流行性呼吸系统疾病、艾滋病、肝炎、出血热、大流行感冒、疟疾、狂犬病、钩虫病、血吸虫病等人类疾病和肿瘤的新型疫苗、联合疫苗等，疫苗生产用合格实验动物，培养细胞及菌种等。
2、基因工程药物具有自主知识产权，用于心脑血管疾病、肿瘤、艾滋病、血友病等重大疾病以及其他单基因遗传病治疗的基因工程药物、基因治疗药物、靶向药物，重组人血白蛋白制品等。
3、重大疾病的基因治疗用于恶性肿瘤、心血管疾病、神经性疾病的基因治疗及其关键技术和产品，具有自主知识产权的重大疾病基因治疗类产品，包括：恶性肿瘤、遗传性疾病、自身免疫性疾病、神经性疾病、心血管疾病和糖尿病等的基因治疗产品；基因治疗药物输送系统等。
4、单克隆抗体系列产品与检测试剂用于肝炎、艾滋病、血吸虫病、人禽流感、性病等传染性疾病和肿瘤、出生缺陷及吸毒等早期检测、诊断的单克隆抗体试剂，食品中微生物、生物毒素、农药兽药残留检测用单克隆抗体及试剂盒；重大动植物疫病、转基因生物检测用单克隆抗体及试剂盒，造血干细胞移植的分离、纯化和检测所需的单克隆抗体系列产品；抗肿瘤及抗表皮生长因子单克隆抗体药物；单克隆抗体药物研究关键技术和系统；先进的单克隆抗体规模化制备集成技术、工艺和成套设备；新型基因扩增(PCR)诊断试剂及检测试剂盒和人源化/性基因工程抗体。
5、蛋白质/多肽/核酸类药物面向重大疾病——抗肿瘤蛋白药物(如肿瘤坏死因子)，心脑血管系统蛋白药物(如纤溶酶原，重组溶血栓)，神经系统蛋白药物尤其是抑郁药物，老年痴呆药物，肌肉关节疾病的蛋白质治疗药物，以及抗病毒等严重传染病蛋白药物的研究与产业化技术；各类细胞因子(如促红细胞生成素，促人血小板生长因子，干扰素，集落刺激因子，白细胞介素，肿瘤坏死因子，趋化因子，转化生长因子，生长因子)等多肽药物的开发技术；抗病毒、抗肿瘤及治疗自身免疫病的核酸类药物及相关中间体的研究及产业化技术等。
大规模植物细胞培养生产药用
3 大规模植物细胞培养生产药用成分植物细胞的大量培养是利用植物细胞体系,通过现代生物工程手段进行工业规模生产,以获得各种产品的一门新兴的跨学科技术。
首次提出从植物细胞培养物中合成天然药物的是1956年美国的Routier 和Nickell ,1967 年Kaul 和Staba 采用多升发酵罐对小阿米( Ammi visnaga) 进行了细胞大量培养的研究,并首次用此方法得到了药用成分呋喃色酮(Visnagin) 。
七八十年代,植物组织培养、植物原生质体培养等各种植物培养技术与植物细胞培养技术共同发展,在培养基配方、环境条件控制、悬浮培养技术等研究方面相互借鉴、相互促进[1 ] ;而大规模培养技术方面,得益于微生物发酵技术的飞速发展,各种各样的反应器如气升式、气泡柱式、模式等反应器相继得到应用,使得植物细胞大量培养的研究迅速得到借鉴发展。
这些年来植物细胞培养技术主要致力于高产细胞株选育方法、悬浮培养技术、多级培养和固定化细胞技术、培养工艺优化控制、生物反应器研制、下游纯化技术等方面的研究,并取得了较大进展[2 ] 。
近几年有些技术用于植物细胞培养对提高产物含量,降低成本有一定的作用。
这些技术有: (1) 发状根培养技术和冠瘿组织细胞培养技术。
发状根(Hairy root ) 和冠瘿组织(Crown gall tissue) 在离体培养时都具有激素自主、增殖较常规细胞培养快、次生代谢物含量一般比悬浮培养细胞高、且能合成某些悬浮培养细胞不能合成的次生代谢物以及能引入外源基因表达等特点,从而引起人们利用它们生产药用次生代谢物的重视。
如利用桔味薄荷(Mentha citrata) 冠瘿细胞生产萜烯,洋地黄( Digitalis) 冠瘿细胞生产强心甙, 丹参冠瘿细胞生产丹参酮[3 ] ,长春花冠瘿细胞生产吲哚生物碱[4 ] ,人参发状根培养生产人参皂甙, 长春花发状根培养生产长春碱,青蒿发状根培养生产青蒿素[5 ] ,萝芙木发状根培养生产生物碱[6 ]等等。
八细胞培养产酶
气升式生物反应器
中空纤维反应器 3、中空纤维式生物反应器
由数百乃至数千根中空纤维集束组成的反应器，纤维的 材料为聚砜或丙烯共聚物，纤维壁厚为50-100m，呈多孔 性，内层为超滤膜，内腔直径为200m，两端用环氧树脂 等材料将纤维粘和在一起，并使内腔开口于外加的塑料圆 筒，使形成两个隔开的腔。
工作任务 7.3 （二）植物细胞培养和发酵 植物细胞培养简介
第一节 基本概念 第一节 基本流程
植物细胞培养流程
第一节 基本概念
请比较：植物组织培养过程
离体的植物器官、 组织或细胞（外植体） 脱分化 愈伤组织 再分化 根、芽
植物体
补充：愈伤组织的形成
愈伤组织：在 人工培养基上 由外植体长出 来的一团无序 生长的薄壁细 胞（细胞排列 疏松、无规 则）。
膜式生物反应器
5、固定床或流化床式生物反应器 结构较简单，装填的材料可以是一切 对细胞无毒、又有利于细胞贴附的材 料，有实心载体和有孔载体两类。
动物细胞生物反应器的检测控制系统
1、培养过程需检测的物化参数 直接在线检出 取样离线检测 检测后计算 2、主要参数的检测和控制方法 ①温度 ②pH a在培养初期，偏碱，控制进二氧化碳量 b当细胞密度提高后控制NaHCO3的量 ③溶氧 ④搅拌 ⑤进出液流量
是动植物细胞的大规模培养可以获得一些微生物培养所不能得到的重 要的酶制剂产品。
特点：1、对环境条件要求高，对环境变化反应十分敏感；2、对营养
素要求严格；3、生长相对缓慢。
学习情境八 细胞培养产酶
工作任务 （一）动植物细胞的特点 工作任务 （二）植物细胞培养和发酵 工作任务 （三）动物细胞发酵产酶
植物细胞生物反应器
植物细胞易聚集，较脆弱，代谢途径和代谢产物累积 与细胞生长关系复杂，选择合适的培养方法和反应器 细胞培养周期长，次生代谢产物含量相对较低，提取物反应器性能比较
细胞工程名词解释
名词解释动物细胞培养（animal cell culture）：是将来自动物体的某些器官或组织的细胞，在模拟体内生理条件下在体外进行培养，使之存活并生长。
原代培养(primary culture)：以直接取自生物体细胞、组织、或器官的培养。
传代培养（passage culture）：将原代培养的细胞继续转接培养的过程。
细胞的体外大量增殖是通过传代培养实现的。
细胞系(cell line)由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细胞为主，能在体外生存的不均一细胞群体,。
第一次传代培养后的细胞即为细胞系。
细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群叫细胞株(cell strain).接触抑制：动物细胞体外培养的方式之一，指由于细胞相互接触而抑制细胞运动性现象。
密度抑制：细胞接触汇合成片后，只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，但当细胞密度达到一定程度后，营养相对缺乏，代谢产物增多，发生抑制现象。
动物细胞大规模培养：指人工条件下高密度大量培养有用动物细胞生产珍贵药品的技术,是生物工业中大量增殖基因工程、融合或转化细胞所所不可缺少的培养技术。
传代细胞：二倍体细胞，具二倍染色体，具有贴壁和接触依赖性，有限增殖能力，无致瘤性转化细胞：是通过正常细胞转化而来到的分化不成熟、具有无限增殖能力的细胞株。
微载体：依赖贴壁生长的细胞可以附着在微珠的表面繁殖，载体携带细胞在容器中呈悬浮状进行大量培养。
半连续式培养（Semi-continuous culture）：在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间从中取出部分培养液或者细胞剩余的细胞作为种子，再用新的培养液补足到原有体积。
灌流式培养（Perfusion culture）：是把细胞和培养基一起加入生物反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分培养液取出，同时又连续不断地补充新的培养液。
干细胞：具有自我更新，高度增值，多向分化潜能的细胞群体胚胎干细胞：一种全能干细胞，是从着床前胚胎内细胞团经过体外分化抑制培养的一种全能干细胞系，可以分化为任何一种组织类型的细胞成体干细胞：成体组织内能够自我更新分化为一种或几种组织细胞的未成熟细胞可塑性：一种组织的成体干细胞向另一种组织的特化细胞分化的能力组织工程：利用生命科学，医学，工程学原理与技术，单独会是组合的利用生物材料，细胞因子实现组织修复再生的一门技术种子细胞：用于组织修复或是再生的细胞材料支架材料：替代细胞外基质使用的生物医学材料生长因子：细胞对外界环境产生的应答通过感知某种化学信号或刺激，并将之传递到细胞核中，调控基因的表达过程单抗：由一个只识别一种抗原决定簇的B细胞克隆产生的同源抗体胚胎工程：是指所有对胚胎进行认为的干预，使其环境因素，发育模式或局部组织功能，发生变化的综合技术胚胎移植：将一头良种母畜配种后形成的早期胚胎取出，移植到另一头同种的，生理状态相同的母畜生殖器官的相应部位，使之发育成为新的个体体外受精：将哺乳动物卵母细胞取出，在体外与精子结合受精的过程胚胎分割：将一个胚胎分割成1/2或1/4胚，移植后获得同卵双生或多生的后代胚胎融合：将两个或几个胚胎的部分或整体融合在一起，使之发育成一个胚胎，然后移植到受体母畜体内让其继续发育成一种嵌合体的技术试管婴儿：从母体中取出卵母细胞在体外进行体外受精，培养形成在其胚胎以后移植到子宫内，使之在子宫内着床，妊娠克隆动物：指不经过生殖细胞而直接采用体细胞的细胞核移植到去核的卵细胞中的方法，获得遗传性状与供核动物完全相同的后代胚胎核移植：将动物早期的胚胎细胞核或卵裂球通过人工操作，移植到去核卵细胞中，重组成新的胚胎并发育成与供体胚胎基因相同的后代的过程体细胞核移植：将动物体细胞经过抑制培养使其处于休眠状态，利用细胞融合技术将体细胞与去核的卵细胞融合重组成新胚胎。
第三章生物制药工艺技术基础(1)
• E.细菌污染的控制：除了要彻底灭菌外， 还可以加入一定量的抗生素，如青霉素 和链霉素等
• F.培养温度和时间的控制：细胞的温度一 般为37度，时间一般为2—4天。
• 3.真菌 （注：真菌也可以用来产抗生素，是脂环芳香类 或简单类氧杂环类，多数为酸性化合物）
• （1)酶 （2）有机酸 （3）氨基酸 （4）核酸及有关物质 （5）维生素 （6) 促生素 （7）多糖
• 4.酵母菌 （1）维生素 （2）蛋白质与多肽 （3）核酸
（六）开发生物新资源 （1）动植物细胞的大规模培养 （2）应用基因工程技术建立工程菌或工 程细胞
（四）.动物细胞的保存
• 疫苗的制备一般有以下几步： • 1.灭活：用甲醛溶液或酚溶液等。 • 2.纯化：用乙醚纯化或进透析、浓缩、超
速离心等。 • 3.冻干 ： 在2—8摄氏度下可保存12个月。
当温度升高，很快就会失活，水分保持 在3%以下。 •
• （四）微生物菌种的选育与保存 • （将在微生物制药中将会重点讲解）
鞣质等。
• （五）微生物 1.细菌 常用细菌发酵法生产乳酸、醋酸、丙酮、丁醇。 主要有： （1）氨基酸 利用微生物酶可转化对应的α-酮酸或羟基酸 作用产生氨基酸。 （2）有机酸 柠檬酸、苹果酸、乳酸 （3）糖类 利用细菌可制取葡聚糖、聚果糖、 聚甘露糖、脂多糖。
• （4）核苷酸类 用细菌可生产5‘－AMP， 5’－肌苷酸 （5）维生素 VB1,VB2，VB6, Vc （6）酶 淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、弹 性蛋白酶
微生物的组织、器官、细胞与代谢产物。应用 动植物细胞培养与微生物发酵技术也是获得生 物制药原料的重要途径。基因工程技术与细胞 工程技术和酶工程技术更是开发生物制药资源 的新途径。
动植物细胞的培养
大规模培养的方法
1. 悬浮培养：即让细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖。它适用于一切种类
的非贴壁依赖性细胞(悬浮细胞)，也适用于兼性贴壁细胞。该培养方法的优
点是操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模， 在培养设备的设计和实际操作中可借鉴许多有关细菌发酵的经验。不足之 处是由于细胞体积较小，较难采用灌流培养(perfused culture)，因此细胞密 度一般较低。目前在生产中用于悬浮培养的设备主要是通气搅拌罐式生物
养箱中价值的生物制品，如病毒疫苗、干扰素、
单克隆抗体等。
2. 应用于基因工程(作受体细胞)。 3. 检测有毒物质，判断某种物质的毒性。 4. 培养正常或各种病变的细胞，用于生理、病理、药理
等方面的研究。
细胞的冻存和复苏
1. 细胞的冻存 细胞和整体生物一样，当温度降低时，它的代谢也降低，从而大大的延 长了它的存活期。因此目前为了保存细胞，都采用液氮低温(-196 ℃)冻存的 方法。用该法细胞可保存几年，甚至几十年。在冻存过程中，渗透压的改变 会影响到脂蛋白，使细胞膜破裂。为了防止电解质过分浓缩，可采用某些保 护剂，如甘油和二甲基亚砜。它们的相对分子质量低，溶解性好，容易渗入 细胞。在冷冻时，冷冻速度很重要，不能太快也不能太慢。太慢会产生冰晶 损伤细胞，太快不足以使水分排出。一般要求以 1℃/min 的速度下降为宜。 在无定速降温设备时，可按如下三种方法之一处理：①将安瓿(bù)放在 壁厚为 1.5 cm 的聚乙烯盒内，然后放在 -70℃ 冰箱内 2 h，再转入液氮。②先 将安瓿臵 4℃ 冰箱 4~5h 或过夜，再移至 -70℃ 冰箱内 2 h，再悬于液氮罐颈 口 1 h，最后浸人液氮。③放在冻存简易装臵内，里于液氮罐颈口，离液氮面 5~10 cm，2~3 h 后浸入液氮。
动物细胞大规模培养和专用生物反应器
贴壁培养细 胞转瓶机
细胞转瓶培养器
转瓶培养系统：
为最初采用系统;一般用 于小量培养到大规模培养的过 渡阶段;或作为生物反应器接 种细胞准备的一条途径 细胞 接种在旋转的圆筒形培养器— —转瓶中;培养过程中转瓶不 断旋转;使细胞交替接触培养 液和空气;从而提供较好的传 质和传热条件
转瓶机
转瓶培养的优 缺点
优点：
结构简单;投资少;技术成 熟;重复性好;放大只需简 单的增加转瓶数量等
缺点：
劳动强度大;占地空间大;单位体 积提供细胞生长的表面积小;细 胞生长密度低;培养时监测和控 制环境条件受到限制
二 悬浮培养suspension culture
指细胞在反应器中自由悬浮生长的过 程 主要用于非贴壁依赖型细胞培养;如杂 交瘤细胞等;是在微生物发酵的基础上发 展起来的
通过植物组织培养的药物：奎宁 长春碱 洋地黄 紫 草素 人参皂甙等
1
大 规2 模 动 物3 细 胞 培 养4 工 艺 流5 程 图
6
8 7
9
10 细胞培养反应器
诱生剂
细胞
提取 纯化
产品肿瘤抗原
提取 纯化 产品干扰素
细胞
浓缩纯化
产品单克隆抗体
大规模培养动物细胞的方法：
• 贴壁培养 • 悬浮培养 • 固定化培养
一 贴壁培养attachment culture
细胞贴附在一定的固相表面进行的培养
1 生长特性：贴壁依赖型细胞在 培养时要贴附于培养瓶器皿壁上;细 胞一经贴壁就迅速铺展;然后开始有 丝分裂;并很快进入对数生长期 一般 数天后就铺满培养表面;并形成致密 的细胞单层
贴壁培养细 胞转瓶机
2 贴壁培养的优点：
2 连续式培养的特点： ●细胞维持持续指数增长；
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7.2 动物细胞培养技术
动物细胞培养的无菌技术
1、物理消毒
（1）射线消毒：60Co、X射线，用于血清和塑料制品灭菌。 （2）紫外线：器皿需结合75％酒精浸泡，照射30min。 （3）干热灭菌：160C，90～120 min。主要用于玻璃、金属器皿。 （4）湿热灭菌：121C，30 min；适用布、橡胶、某些塑料、金属、 玻璃等。 （5）过滤除菌：用孔径小于0.22μm的滤膜过滤，适用于培养用液 和其他不能高压灭菌的溶液。
第7章 动植物细胞大规模培养
7.1 动植物细胞大规模培养的意义
概念： 概念：动植物细胞培养是指动植物细胞在体外条件下的存活
或生长，此时细胞不再形成组织。 （组织培养：组织或细胞在体外培养使之生存和生长，并保持 组织培养： 组织培养 组织分化、组织结构和功能。）
意义： 意义：虽然微生物的培养已经用来生产大量的对人类有益的
7.2 动物细胞培养技术
培养基
A、物理性质
1、pH值： 正常成纤维细胞：pH7.4—7.7；转化细胞：pH7.0—7.4。 酚红的呈色： pH 呈色 6.5 黄色■ 7.0 橙色■ 7.4 红色■ 7.6 红带蓝■ 7.8 紫色■
2、缓冲盐：碳酸氢钠
3、渗透压
4、粘度
7.2 动物细胞培养技术
培养基
7.2 动物细胞培养技术
动物细胞培养工艺
1、培养流程
（1）将动物组织切成碎片； （2）用胰蛋白酶处理，分散组织得到单个细胞； （3）离心收集细胞； （4）植入营养培养基，细胞增值到覆盖瓶壁表面； （5）用胰蛋白酶消化使细胞从瓶壁脱落，再接种到培养瓶扩大培养； （6）获得足够量的细胞； （7）接入大规模培养生物反应器； （8）回收产品。
产品，但是动植物细胞的大规模培养可以获得一些微生物培养 所不能得到的重要的产品。表7.1－表7.2
特点： 特点：1、对环境条件要求高，对环境变化反应十分敏感；2、
对营养素要求严格；3、生长相对缓慢。
7.1 动植物细胞大规模培养的意义
表7.3 动植物细胞培养和微生物培养的比较 比较项目 大小 悬浮生长 营养要求 生长速率 代谢调节 微生物 1－10μm 可以 简单 哺乳动物细胞 10－100μm 多数细胞需贴 壁生长 非常复杂 植物细胞 10－100μm 可以，但易成 团，无单个细 胞 较复杂
7.2 动物细胞培养技术
动物细胞培养的无菌技术
2、化学消毒
（1）70％（75％）酒精：用于手、器械、工作台面。 （2）0.1％新洁尔灭：主要用于手的清洗和工作台面的清洗。 （3）来苏水：主要用于桌椅、墙壁、地面的消毒，也可用于空气消 毒。 （4）0.5%过氧乙酸：10min可将芽孢菌杀死，用于表面消毒。 （5）其他：乳酸、甲醛、高锰酸钾、氯等。
细胞培养的环境要求
A、支持物
1、玻璃 2、塑料 3、微载体
7.2 动物细胞培养技术
细胞培养的环境要求
B、气体交换
1、氧气：适合大气氧含量，一般不需特别调整。 2、二氧化碳：调整到5％。 C、培养温度 1、最佳温度的确定： a、动物体温；b、细胞所在身体部位；c、考虑一定的安全系数。 2、细胞耐冷不耐热
快，倍增时间为 慢，倍增时间 慢，倍增时间 0.5-5小时 为15－100小时 为24－74小时 内部 内部、激素 内部、激素
7.1 动植物细胞大规模培养的意义
表7.3 动植物细胞培养和微生物培养的比较（续） 比较项目 环境敏感性 细胞分化 剪切力敏感 传统变异、 筛选技术 细胞或产物 浓度 微生物 能忍受广泛范围 无 低 广泛使用 较高 哺乳动物细胞 非常敏感，仅 忍受很窄范围 有 非常高 不常使用 低 植物细胞 能忍受广泛范 围 有 高 有时使用 低
7.2 动物细胞培养技术
动物细胞的形态
A、贴壁依赖型
1、成纤维细胞（fibroblast 或mechanocyte type) 2、上皮细胞（epithilium cell) 3、游走细胞（wondering cell） 4、多形性细胞（polymorphic cell)
B、悬浮型或非贴壁依赖型
7.2 动物细胞培养技术
7.2 动物细胞培养技术
动物细胞培养工艺
2、培养方法
（1）分批培养； （2）流加培养； （3）半连续培养； （4）植物细胞培养流程
7.3 植物细胞培养简介
植物细胞培养基的组成
与动物细胞培养不同，植物细胞可在简单合成 培养基上生长。 （1）碳源 （2）有机氮源 （3）无机盐类 （4）植物生长激素 （5）有机酸 （6）复合物质
B、培养基的组成
1、氨基酸 2、维生素 3、盐 4、葡萄糖 5、有机添加剂 6、激素和生长因素
7.2 动物细胞培养技术
培养基
C、血清
1、常用血清： 小牛血清、胎牛血清、马血清、人血清 添加血清有助于细胞贴壁和生长。 2、血清提供的主要成分： 蛋白质、多肽、激素、代谢物和营养物、无机物
7.2 动物细胞培养技术
7.3 植物细胞培养简介
植物细胞培养的方法
（1）单倍体细胞培养 （2）原生质体培养 （3）固体培养 （4）液体培养 （5）悬浮培养 （6）固定化培养
7.3 植物细胞培养简介
影响植物细胞培养的因素
（1）细胞的遗传特性 （2）温度 （3）pH值 （4）营养成分 （5）光 （6）搅拌和通气 （7）前体 （8）生长调节剂