第三章 动植物细胞培养产酶
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植物细胞培养产酶的工艺流程
植物细胞培养产酶的工艺流程植物细胞培养是一种重要的生物技术手段，可以通过在无菌条件下培养植物细胞，利用其代谢产物来生产各种有用的化合物，其中包括酶。
植物细胞培养产酶的工艺流程主要包括以下几个步骤。
1. 细胞选择和预处理需要选择适合培养的植物材料，一般来说，具有高产酶能力的植物细胞株应该被选择出来。
然后，将选定的植物材料进行消毒处理，以去除外源微生物的干扰。
消毒处理通常使用酒精或含有抗生素的培养基进行，以确保培养过程的无菌性。
2. 培养基的准备培养基是植物细胞培养的基础，可以提供细胞所需的营养物质和生长因子。
常用的培养基包括MS培养基、B5培养基等。
在准备培养基的过程中，需要根据细胞的特性和所需产酶的要求进行调整，例如，添加适量的糖类、氨基酸、维生素等，以满足细胞的生长和代谢需要。
3. 细胞的接种和培养将预处理过的细胞接种到含有适量培养基的培养皿中，然后放入恒温摇床或培养箱中进行培养。
培养条件的选择应根据细胞的特性和产酶的要求来进行，如温度、光照、培养皿的摆放方式等。
在培养过程中，需要定期观察和检测细胞的生长情况，以及产酶的水平。
4. 酶的提取和纯化当细胞生长到一定程度时，可以进行酶的提取和纯化。
一般来说，细胞培养液中的酶可以通过离心、过滤和浓缩等步骤进行分离和富集。
然后，可以使用各种分离技术，如柱层析、电泳等，进一步纯化酶。
在纯化过程中，需要注意保持酶的活性和稳定性，以确保最终产酶的质量和纯度。
5. 酶的活性检测和分析纯化后的酶可以进行活性检测和分析，以确定其酶活性和产酶能力。
常用的酶活性检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、比色法、荧光法等。
此外，还可以通过分析酶的底物转化率、产物生成量等指标来评估酶的产酶能力。
6. 酶的应用纯化和活性检测合格的酶可以进行进一步的应用。
根据具体需求，酶可以用于医药、食品、农业、环境等领域的生产和研究。
例如，一些酶可以用于生产药物、酿造啤酒、提取果汁等。
植物细胞培养产酶的工艺流程包括细胞选择和预处理、培养基的准备、细胞的接种和培养、酶的提取和纯化、酶的活性检测和分析以及酶的应用等步骤。
动植物细胞中酶生物合成的调节
第三章 动植物细胞培养 产酶
动植物细胞培养是通过特定技术获得优良的 动物和植物细胞，然后在人工控制条件的反 应器中进行细胞培养，以获： 离心分离技术 杂交瘤技术 胰蛋白酶消化处理技术 植物细胞获得： 机械捣碎或酶解外植物体 诱导愈伤组织（常用）
动植物细胞中酶生物合成的调节
诱导酶是抗体酶制备的主要方法，根据所采用的抗 原不同，诱导法又有半诱导法和酶蛋白诱导法
细胞分化改变酶的生物合成
• 多细胞组成的动物和植物，同一生物个体的不同细胞都含 有相同的染色体DNA，即所含有的基因的种类和数量一样， 但是在个体发育的不同阶段和不同类型的分化细胞中，由 于受到不同的调节控制，基因的表达有很大的差异酶的生 物合成有显著的不同，这就说明基因的表达具有时间性和 空间性。 • 例如，胰蛋白酶主要在胰细胞中合成，木瓜蛋白酶主要在 果皮细胞中合成等。其中，与细胞的的衰老和癌症的发生 有密切关系的端粒酶是细胞分化改变酶生物合成的一个典 型的例子。
• • • • 细胞分化改变酶的生物合成 基因扩增加速酶的生物合成 增强子促进酶的生物合成 抗原诱导抗体酶的生物合成
动植物细胞中酶生物合成的调节
• •
合成原理：动植物细胞酶生物合成的途径与微生物相似， 都是由DNA转录成RNA，加工成核酸酶，或者生成的 RNA翻译成多肽链，加工成蛋白质多肽酶。 动植物细胞与微生物细胞相比，结构要复杂得多，除了受 转录水平和翻译水平的调节之外，还受到激素水平等的调 节，到目前为止还没有完整的理论和模型来阐述动植物细 胞中酶生物合成的调节规律。这里我们从细胞改变酶的生 物合成，基因扩增酶加速的生物合成，增强子促进酶的生 物合成抗原诱导抗体酶的生物合成等方面介绍动植物细胞 酶生物合成的调节。
基因扩增加速酶的生物合成
动植物细胞培养是通过特定技术获得优良的 动物和植物细胞，然后在人工控制条件的反 应器中进行细胞培养，以获： 离心分离技术 杂交瘤技术 胰蛋白酶消化处理技术 植物细胞获得： 机械捣碎或酶解外植物体 诱导愈伤组织（常用）
动植物细胞中酶生物合成的调节
诱导酶是抗体酶制备的主要方法，根据所采用的抗 原不同，诱导法又有半诱导法和酶蛋白诱导法
细胞分化改变酶的生物合成
• 多细胞组成的动物和植物，同一生物个体的不同细胞都含 有相同的染色体DNA，即所含有的基因的种类和数量一样， 但是在个体发育的不同阶段和不同类型的分化细胞中，由 于受到不同的调节控制，基因的表达有很大的差异酶的生 物合成有显著的不同，这就说明基因的表达具有时间性和 空间性。 • 例如，胰蛋白酶主要在胰细胞中合成，木瓜蛋白酶主要在 果皮细胞中合成等。其中，与细胞的的衰老和癌症的发生 有密切关系的端粒酶是细胞分化改变酶生物合成的一个典 型的例子。
• • • • 细胞分化改变酶的生物合成 基因扩增加速酶的生物合成 增强子促进酶的生物合成 抗原诱导抗体酶的生物合成
动植物细胞中酶生物合成的调节
• •
合成原理：动植物细胞酶生物合成的途径与微生物相似， 都是由DNA转录成RNA，加工成核酸酶，或者生成的 RNA翻译成多肽链，加工成蛋白质多肽酶。 动植物细胞与微生物细胞相比，结构要复杂得多，除了受 转录水平和翻译水平的调节之外，还受到激素水平等的调 节，到目前为止还没有完整的理论和模型来阐述动植物细 胞中酶生物合成的调节规律。这里我们从细胞改变酶的生 物合成，基因扩增酶加速的生物合成，增强子促进酶的生 物合成抗原诱导抗体酶的生物合成等方面介绍动植物细胞 酶生物合成的调节。
基因扩增加速酶的生物合成
02第二章 微生物发酵产酶 第三章 动植物细胞培养产酶
Amylase from Bacillus Protease from Bacillus Phosphatase from Bacillus Glucoamylase from Aspergillus …… Plant cell culture Animal cell culture
Few examples
30
进 位
成肽 转 位
31
合成终止
32
高效率的蛋白 质合成体系
33
蛋白质的折叠
蛋白质的空间结构如何形成？ 功能与结构如何统一？ 体外、体内的结构如何变化？
蛋白质分子设计及蛋白质工程的需要 越来越多的基因工程产物需要复性复活, 要求蛋白质折叠 的理论及技术的指导。基因工程重组蛋白类产物必须要形 成正确的折叠才能表现出功能和活性。
19
蛋白质合成的几个要素-遗传密码，nucleotide triplet codon
mRNA分子中,每三个相邻的核苷酸组成的三联体 代表某种氨基酸或其它信息，称为密码子或三联 密码。 四种核苷酸编成三联体可形成43个即64个密码子。 其中： 一个起始密码: AUG
三个终止密码: UAA
可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) （一种变构蛋白），通过与效应物 (effector) （包括诱导物和辅阻遏物）的特异 结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因 的结合力。 调节基因常位于调控区的上游。
38
启动基因（promotor gene）（启动子）：
有两个位点： （1）RNA聚合酶的结合位点 （2）cAMP-CAP的结合位点。 CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。 只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA 聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才 能开始。 P S DNA O R
第三章酶的生产
第三章酶的生产
2023年5月15日星期一
第三章 酶的生产制备
酶的生产方式
1.提取法: 植物、动物、微生物
2.化学合成法
生物合成法： 利用植物、动物、微生物细胞合成。 上个世纪50年代起利用微生物生产酶
。 1949年细菌发酵生产淀粉酶
上个世纪70年代以来利用植物细胞和 动物细胞培养技术生产酶。
木瓜细胞培养生产木瓜蛋白酶和木瓜 凝乳蛋白酶 人黑色素瘤细胞培养生 产血纤维蛋白溶酶原激活剂
34
2.生长偶联型中的特殊形式——中期合成型
酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生 长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。 特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。
所对应的mRNA是不稳定的。
枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线 35
3.部分生长偶联型（又称延续合成型）
酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入 平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。 特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。
所对应的mRNA相当稳定。
黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线 36
4. 非生长偶联型（又称滞后合成型）
只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并 大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 特点：受分解代谢物的阻遏作用。
所对应的mRNA稳定性高。
黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线 37
总结：影响酶生物合成模式的主要因素
②发酵代谢调节：理想诱导物的添加，解除 反馈阻遏和分解代谢物阻遏（难利用的碳 氮源的使用，补料发酵）。
③降低产酶温度。
二、细胞生长动力学
微生物细胞生长的动力学方程：
Monod方程：
S－限制性基质浓度； μm—最大比生长速率； Ks —Monod常数
2023年5月15日星期一
第三章 酶的生产制备
酶的生产方式
1.提取法: 植物、动物、微生物
2.化学合成法
生物合成法： 利用植物、动物、微生物细胞合成。 上个世纪50年代起利用微生物生产酶
。 1949年细菌发酵生产淀粉酶
上个世纪70年代以来利用植物细胞和 动物细胞培养技术生产酶。
木瓜细胞培养生产木瓜蛋白酶和木瓜 凝乳蛋白酶 人黑色素瘤细胞培养生 产血纤维蛋白溶酶原激活剂
34
2.生长偶联型中的特殊形式——中期合成型
酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生 长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。 特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。
所对应的mRNA是不稳定的。
枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线 35
3.部分生长偶联型（又称延续合成型）
酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入 平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。 特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。
所对应的mRNA相当稳定。
黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线 36
4. 非生长偶联型（又称滞后合成型）
只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并 大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 特点：受分解代谢物的阻遏作用。
所对应的mRNA稳定性高。
黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线 37
总结：影响酶生物合成模式的主要因素
②发酵代谢调节：理想诱导物的添加，解除 反馈阻遏和分解代谢物阻遏（难利用的碳 氮源的使用，补料发酵）。
③降低产酶温度。
二、细胞生长动力学
微生物细胞生长的动力学方程：
Monod方程：
S－限制性基质浓度； μm—最大比生长速率； Ks —Monod常数
酶工程第3版
一、动植物细胞的特点: 动植物细胞的特点
• 1、体积比微生物大； 、体积比微生物大； • 2、对剪切力敏感； 、对剪切力敏感； • 3、生长和代谢速率低，生长倍增时间和发酵 、生长和代谢速率低， 周期长； 周期长； • 4、动物细胞营养要求复杂； 、动物细胞营养要求复杂； • 5、发酵产物不同 、
三、动物细胞发酵
1、动物细胞可以生产多种具有较高价值的药物，特 、动物细胞可以生产多种具有较高价值的药物， 别是疫苗、激素、单克隆抗体和酶等。 别是疫苗、激素、单克隆抗体和酶等。 由动物细胞培养生产的酶有胶原酶， 由动物细胞培养生产的酶有胶原酶，血纤蛋白溶 酶原活性剂等。 酶原活性剂等。 2、动物细胞培养方法： 、动物细胞培养方法： 悬浮培养； 悬浮培养；固定化细胞培养 3、动物细胞发酵工艺植物细胞发酵技术和特点： 、植物细胞发酵技术和特点： 植物细胞发酵技术 发酵特点（与直接提取分离相比较而言）： 发酵特点（与直接提取分离相比较而言）： （1）提高产率； ）提高产率； （2）缩短周期 ）缩短周期; （3）易于管理、减轻劳动强度； ）易于管理、减轻劳动强度； （4）提高质量。 ）提高质量。
2、植物细胞发酵技术 、 (I)高产细胞系的选择： 主要有以下几个途径： 高产细胞系的选择： 高产细胞系的选择 主要有以下几个途径： 材料选择，克隆选择，抗性选择，诱变选择,细 材料选择，克隆选择，抗性选择，诱变选择 细 胞工程和基因工程选择； 胞工程和基因工程选择； (II)影响产物产量的因素： 材料来源 培养基成分， 影响产物产量的因素： 材料来源,培养基成分 培养基成分， 影响产物产量的因素 光照和温度， ，细胞形态分化程度等; 光照和温度，pH，细胞形态分化程度等 (III)提高产物产量的途径： 选择高产细胞系，控 提高产物产量的途径： 提高产物产量的途径 选择高产细胞系， 制细胞生长和分化程度，加入诱导物或前体， 制细胞生长和分化程度，加入诱导物或前体， 两相培养和产物释放，毛壮根培养技术。 两相培养和产物释放，毛壮根培养技术。 (IV)植物细胞培养系统专用的生物反应器。 植物细胞培养系统专用的生物反应器。 植物细胞培养系统专用的生物反应器
南京林业大学酶工程-3 动、植物细胞发酵产酶讲解
一般为无机氮源。 一般以蔗糖为碳源。
植物细胞培养的工艺条件及其控制（续）
（三）温度的控制 室温（25℃）、 （四）pH值的控制 微酸性（pH5～6） （五）溶解氧的调节控制 代谢慢，耗氧少，对剪切力敏感，搅拌不宜强烈。 （六）光照的控制 （七）前体的添加 提高次级代谢物的产量。 （八）刺激剂(electior)的应用 强化次级代谢产物的生物合成。常用微生物细胞 壁碎片和胞外酶。
动、植物细胞培养与微生物培养区别
动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固 体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨 基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血 清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪 切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测 和控制。 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细 胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养 产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的 培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。
紫草宁及其结构
植物细胞培养的特点（续）
ห้องสมุดไป่ตู้
（2）缩短周期 发酵周期10～30天，种植周期几个月～几年。 （3）易于管理 减低劳动强度；不受地理环境和气候条件等影响。 （4）提高产品质量 主要产物浓度高，易于分离纯化，减少环境中各种有 害物质污染和侵蚀。 （5）其它 生物反应器的设计工艺条件注意的问题。
主要产物
醇类，有机酸， 色素，香精， 激素，疫苗， 氨基酸，抗生素， 药物，酶 单克隆抗体， 酶，核苷酸 酶
二、植物细胞培养的特点
（1）提高产率
例如,紫草宁(shikonin) 生产，发酵细胞中的紫 草宁比 紫菜根 (Lithospermum erythrorhizon)中高10 倍，比产率达到种植紫 草的830倍。
第三章酶的生物合成法生产
• 10）红曲霉
• 淀粉酶、糖化酶、蛋白酶
• 11）啤酒酵母
• 啤酒和酒类生产 • 转化酶、丙酮酸脱羧酶
• 12假丝酵母
• 脂肪酶、尿酸酶、转化酶、醇脱氢酶
2植物细胞
• 植物细胞培养主要用于:色素、药物、香精 和酶蛋白的生产 • 其中用于产酶的细胞 • 番木瓜细胞------木瓜蛋白酶 • 大蒜细胞----------超氧化物歧化酶 • 胡萝卜细胞-------糖苷酶
•解除反馈阻遏 选育结构类似物抗性突变株 •解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株
2. 基因工程育种
（二）条件控制 1. 添加诱导物
酶的底物类似物最有效。
2. 降低阻遏物浓度
除去终产物 产物阻遏 添加阻止产物形成的抑制剂 避免使用葡萄糖 分解代谢物阻遏 避免培养基过于丰富 添加一定量的cAMP
固定化原生质体技术
• 20世纪80年代发展 • 便于胞内酶的分离纯化
微生物酶的类型
1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、
纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的 大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞 内也能维持较低水平，受到的调节控制少。 2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶， 酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控。
所需的 酶
分离纯化技术
酶的发酵液
第一节 细胞的选择
• • • • • • 用于酶生产的细胞必须具备条件： 1）酶的产量高； 2）容易培养和管理； 3）产酶稳定性好； 4）利于酶的分离纯化； 5）安全可靠，无毒性。
大多数酶采用微生物发酵生产，部分采用 植物细胞和动物细胞
1产酶微生物
• 利用微生物产酶优势：
4动物细胞培养基
酶工程 1~10章题目及答案
第一章绪论试题精选一、名词解释1、酶2、酶工程3、核酸类酶4、蛋白类酶5、酶的生产6、酶的改性7、酶的应用8、酶的专一性9、酶的转换数二、填空题1、根据分子中起催化作用的主要组分的不同，酶可以分为_蛋白类酶_和核酸类酶_两大类。
2、核酸类酶分子中起催化作用的主要组分是_核糖核酸，蛋白类酶分子中起催化作用的主要组分是_蛋白质_。
3、进行分子内催化作用的核酸类酶可以分为_自我剪切酶_，_自我剪接酶_。
4、酶活力是_酶量_的量度指标，酶的比活力是_酶纯度_的量度指标，酶的转换数的主要组分是_酶催化效率_的度量指标。
5、非竞争性抑制的特点是最大反应速度Vm_减小_，米氏常数Km__不变_。
三、选择题1、酶工程是（C）的技术过程。
A、利用酶的催化作用将底物转化为产物B、通过发酵生产和分离纯化获得所需酶C、酶的生产与应用D、酶在工业上大规模应用2、核酸类酶是（D）。
A、催化RNA进行水解反应的一类酶B、催化RNA进行剪接反应的一类酶C、由RNA组成的一类酶D、分子中起催化作用的主要组分为RNA的一类酶3、RNA剪切酶是（B）。
A、催化其他RNA分子进行反应的酶B、催化其他RNA分子进行剪切反应的R酶C、催化本身RNA分子进行剪切反应的R酶D、催化本身RNA分子进行剪接反应的R酶4、酶的改性是指通过各种方法（A）的技术过程。
A、改进酶的催化特性B、改变酶的催化特性C、提高酶的催化效率D、提高酶的稳定性5、酶的转换数是指（C）。
A、酶催化底物转化成产物的数量B、每个酶分子催化底物转化为产物的分子数C、每个酶分子每分钟催化底物转化为产物的分子数D、每摩尔酶催化底物转化为产物的摩尔数四、判断题（V）1、相同的酶在不同的pH条件下进行测定时，酶活力不同。
（V）2、竞争性抑制的特点是最大反应速度Vm不变，米氏常数Km 增大。
（X）3、催化两个化合物缩成一个化合物的酶称为合成酶。
（X ）4、RNA剪切酶是催化RNA分子进行剪切反应的核酸类酶。
第三章 酶的修饰方法
抗原诱导抗体酶的生物合成 抗体酶/催化性抗体是一种具有催化功能的抗体分子。
抗体是由抗原诱导产生的能与抗原特异结合的免疫球蛋白。
重链 哺乳动物有5种重链：α、δ、ε、γ和μ，对应组成的抗体为 IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM。 不同的重链在大小和组成上有所区别。 恒定区和可变区。 轻链 哺乳动物有2种轻链（λ型和κ型） 恒定区和可变区。 每个抗体包含的2条相同的轻链；哺乳动物抗体的轻链只有 一个型:κ或λ型。 Fc段和Fab段 Fc段抗体标记部位；ELISA 过程中抗体固定的部位，结合 二抗的部位。 Fab抗原结合部位。
具有高效的催化活性。一般抗体酶催化反应速度比非酶催化反应速 度快102-106倍，有的反应速度已接近于天然酶促反应速度。
抗体酶具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等。
第二节 植物细胞培养产酶
植物是各种色素,药物，香精和酶等天然产物的主要来源。 目前已知的天然化合物30000多种，80%以上来自植物； 从植物中得到的药物有17类。 我国普遍使用的中草药及其制剂80%以上来自植物。 美国每年使用的植物来源的药物价值超过30亿美元。 植物来源的物质与人们生活密切相关。
增强子促进酶的生物合成
增强子是一段能够增强或促进基因转录的DNA序列。 1.比如，胰岛素基因增强子和胰凝乳蛋白酶基因的增强子都能够促进氯霉素乙酰 转移酶基因的表达（胰脏细胞） 2.NF-κB促进CASP9基因表达
增强子特点。 （1）无方向性； （2）不受增强子与其调控基因的之间距离影响。 （3）有些增强子有细胞和组织特异性。
第一节 动植物细胞中酶生物合成的调节
酶合成原理：遵循中心法则。
酶生物合成的调节： 转录水平调节 蛋白翻译水平调节 激素水平调节 神经水平调节等， 但是到目前为止还没有完整的理论和模型来阐述动植物细胞中酶合成 的调节规律。
动植物细胞培养产酶
合成其所对应的酶；mRNA稳定性差的，就随着细胞生长进入
平衡期而停止酶的生物合成； 不受培养基中存在的某些物质阻遏的，可以伴随着细胞生长 而开始酶的合成；受到培养基中某些物质阻遏的，则要在细胞 生长一段时间甚至在平衡期后， 酶才开始合成并大量积累。
第三节 酶生物合成的模式
理想的酶合成模式
发酵产酶， 为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合 成模式应是延续合成型：在发酵过程中没有生长期和产酶期的 明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平 衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。 对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程\细胞工程等先 进技术,选育得到优良的菌株, 并通过工艺条件的优化控制, 使他 们的生物合成模式更加接近于延续合成型。
and
Monod的工作：
第三节 酶生物合成调节
第三节 酶生物合成调节
3、分解代谢物阻遏：
分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直 接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程 中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。
第三节 酶生物合成的模式
细胞在一定条件下培养生长， 其生长过程一般经历调整 期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段 。 把酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型，延续 合成型，中期合成型和滞后合成型。
。 机与速度。
4.结构基因：决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关 系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。
第三节 酶生物合成调节
2、原核生物酶合成调节的操纵子类型： （1）诱导 Induction 组成酶(constitutive enzymes)：细胞固有的酶类。 诱导酶(inducible enzymes：细胞为适应外来底物或其结构类似 物临时合成的一类酶。 。
酶工程3 动、植物细胞培养产酶
在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入 含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的半固 体MS培养基中，在25℃，600lux，12h/d光 照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18 天继代一次。
(2)大蒜悬浮细胞培养
将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈 伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4D和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体 MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃， 600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d， 使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。
2. 植物细胞的获取
直接分离法, 愈伤组织诱导法 原生质体再生法
直接分离法:
植物细胞可以直接从外植体中分离得到。分为机械法和酶 解法两种。
1）机械捣碎法分离植物细胞是先将叶片等外植体轻轻捣碎, 然 后通过过滤和离心分离细胞。
优点: 获得的植物细胞没有经过酶的作用, 不会受到伤害; 不需要经过质壁分离, 有பைடு நூலகம்于进行生理和生化研究。
常用的刺激剂：
微生物细胞壁碎片和果胶酶、纤维素酶等微生物 胞外酶。
四、植物细胞培养产酶的工艺过程
以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例
(1)大蒜愈伤组织的诱导 选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去
除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升 汞消毒10min，然后无菌水漂洗3次。
然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团 或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25℃,600lux， 12h/d光照条件下震荡培养18d。
(3)酶的分离纯化
细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破 碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。
(2)大蒜悬浮细胞培养
将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈 伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4D和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体 MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃， 600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d， 使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。
2. 植物细胞的获取
直接分离法, 愈伤组织诱导法 原生质体再生法
直接分离法:
植物细胞可以直接从外植体中分离得到。分为机械法和酶 解法两种。
1）机械捣碎法分离植物细胞是先将叶片等外植体轻轻捣碎, 然 后通过过滤和离心分离细胞。
优点: 获得的植物细胞没有经过酶的作用, 不会受到伤害; 不需要经过质壁分离, 有பைடு நூலகம்于进行生理和生化研究。
常用的刺激剂：
微生物细胞壁碎片和果胶酶、纤维素酶等微生物 胞外酶。
四、植物细胞培养产酶的工艺过程
以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例
(1)大蒜愈伤组织的诱导 选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去
除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升 汞消毒10min，然后无菌水漂洗3次。
然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团 或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25℃,600lux， 12h/d光照条件下震荡培养18d。
(3)酶的分离纯化
细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破 碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。
酶工程：动植物细胞培养产酶
四、植物细胞培养产酶的工艺过程
以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例
SOD是生物体内清除超氧化物阴 离子自由基(O 2—)的重要金属酶 类。它和过氧化氢酶、过氧化物 酶一起构成了生物体内重要的酶 促反应防御体系，从而维护生物 体内细胞正常的生理代谢和生化 反应。衰老自由基学说认为衰老 源于机体正常代谢过程中产生过 量的自由基对机体损害的结果。 超氧化物歧化酶(SOD)作为能催化 超氧阴离子发生歧化反应的自由 基清除剂，具有延缓衰老的作用。
(2)大蒜悬浮细胞培养
将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈 伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D 和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体MS 培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃， 600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d，使 愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。 然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞 团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25℃,600lux， 12h/d光照条件下震荡培养18d。
二、动物细胞培养的特点
（1）主要用于生产各种功能蛋白质； （2）生长缓慢； （3）需加抗生素防污染； （4）细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感； （5）具锚地依赖性，宜贴壁培养；部分用悬浮培养； （6）培养基成分复杂，反应过程成本高，产品价格贵 ；
二、植物细胞培养的特点
（1）提高产率
例如：紫草宁的生产， 发酵细胞中的紫草宁比 紫草根中高10倍。
紫草宁的结构
（2）缩短周期 发酵周期10～30天，种植周期几个月～几年。 （3）易于管理 减低劳动强度；不受地理环境和气候条件等影 响。 （4）提高产品质量 主要产物浓度高，易于分离纯化，减少环境中 各种有害物质污染和侵蚀。 （5）其它 设计植物细胞生物反应器和控制工艺条件时应 注意一些问题。
酶工程思考题汇总
酶工程思考题第一章绪论1、酶工程的主要任务是什么？2、简述酶工程的主要内容。
3、简述影响酶催化作用的因素。
4、简述酶活力测定步骤。
5、为什么要对酶的特性进行改良？如何改良？6、两大类酶分类与命名的基础是什么？分类与命名的原则是否相同？7、酶的比活力、酶的转换数与催化周期、酶结合效率与活力回收率、相对酶活力这些概念分别有什么作用？第二章微生物发酵产酶1、简述用于酶的生产的细胞应具备的条件。
2、原核生物酶生物合成调节控制模式的实质分别是什么？在酶的发酵生产中如何运用？3、在DNA分子中，与酶的生物合成有密切关系的基因是什么？它们有什么特点和作用？4、在酶的发酵生产中，为什么应尽量控制溶氧速度等于或稍高于耗氧速度？5、在酶的发酵生产中，如何提高酶产量？6、在酶的发酵生产中，为什么延续合成型是最理想的合成模式？对于其它合成模式的酶，如何使它们接近延续合成型？7、什么是生长和产酶动力学？二者的基本动力学方程是什么？8、绘出微生物发酵产酶的一般工艺流程图。
9、在碳源的选择和使用上，如何注意酶生物合成的调节作用？第三章动植物细胞培养产酶1、简述植物细胞的特性。
2、简述植物细胞培养的特点。
3、简述动物细胞的特性。
4、简述动物细胞培养的特点。
第四章酶的提取与分离纯化1、为什么要对细胞进行破碎？如何破碎？2、简述影响酶提的主要因素。
3、简述沉淀分离的主要方法和原理。
4、简述影响离心分离的主要因素。
5、简述层析分离的主要方法和原理。
6、在离子交换层析中，为什么要对离子交换剂进行处理？如何处理？7、在电泳分离中，颗粒的泳动速度受到哪些因素的影响？第五章酶分子修饰1、在限定位点进行修饰的方法有（）。
2、能探酶活性中心位置的方法有（）。
3、既是修饰方法，又是固定化方法有（）。
4、不改变酶的组成单位及其基团的修饰方法有（）。
5、采用定点突变技术的修饰方法有（）。
6、只适用于酶分子中含有金属离子的修饰方法有（）。
7、目前应用最广泛的修饰方法有（）。
酶工程第三章 动植物细胞培养产酶
制备微载体的材料主要有：
葡聚糖（DEAE—Sephadex A50及A25 ） 塑料 明胶 玻璃 纤维素
四、动物细胞培养的工艺条件及其控制
种质细胞：体细胞、杂交瘤细胞； 工艺过程：
胰蛋白酶
种质 细胞
悬浮 细胞
悬浮培 养或贴 壁培养
收集培 养液、 分离纯 化
（一）动物细胞培养基组成成分
生产组织纤溶酶原活化剂的工艺过程
１、人黑色素瘤细胞培养基；
２、人黑色素瘤细胞培养；
３、组织纤溶酶原激活剂的分离纯化。
动、植物细胞培养与微生物培养区别
动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固 体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨 基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血 清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪 切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测 和控制。 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细 胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养 产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的 培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。
1、氨基酸：各种必需氨基酸，谷氨酰胺等， 作为碳源和能源利用； 2、维生素：血清中，B族和维C； 3、无机盐：调节渗透压； 4、葡萄糖：作为碳源和能源； 5、激素：胰岛素、生长激素、氢化可的松； 6、生长因子：如表皮生长因子、神经生长 因子、成纤维细胞生长因子。
（二）动物细胞培养基的配制
首先配制各类母液，使用前混合过滤除菌， 使用时稀释至所需浓度； 各种动物培养基已商品化。
（六）溶解氧的控制
溶解氧的供给对动物细胞培养至关重要； 采用调节混合气体的量与比例的方法。
酶的生物合成
生产酪氨酸脱羧酶、链激酶、链道酶、双链酶等(有溶解血栓、血 块，加速伤口愈合等作用)
产生葡萄糖异构酶
.
8
2、 放线菌
菌种
(1) 链霉菌属
(Streptomyces)
委内瑞拉链霉菌 (S. venezulae)
灰色链霉菌 (S. griseus) 白色链霉菌 (S. albus)
不产色素链霉菌 (S. achromogenes)
(4) 透明质酸酶
治疗关节损伤、关节周围炎症及膝外伤，传染性肝炎及肝硬 化等
用做药物扩散剂
.
22
四、 产酶微生物的来源
1、土壤中的产酶微生物 2、水体中的产酶微生物 3、空气中的产酶微生物 4、极端环境中的产酶土壤是微生物生活的大本营，为微生物生长繁 殖及生命活动提供了各种条件
用于分析组成和杂质浓度的分析方法的细节
酶或微生物的毒理数据
微生物必须是非致病性的 微生物一定不能产生真菌素或其他毒性化合物 微生物一定不能产生抗生素
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二、 微生物酶的发酵生产
1、酶的发酵生产方法 2、培养基的配制 3、种子培养 4、微生物发酵产酶的一般工艺
.
34
1、 酶的发酵生产方法
(1) 固体培养法 (2) 液体培养法
酶)
.
13
4、 霉菌
菌种 (4) 青霉(Penicillium)
酶及功能
点青霉 (P. notatum) 产紫青霉 (P. ururogenum)
产黄青霉 (P. chrysogenum)
橘青霉 (P. citrinum)
(5) 犁头霉(Absidia)
葡萄糖氧化酶
葡萄糖氧化酶，中性、碱性蛋白酶和青霉素V酰化酶 5’-磷酸二脂酶(水解RNA，生产4种5’-单核苷酸，肌苷酸和鸟苷
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二、植物细胞培养产酶
与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞 具有各自不同的特性，需采用各自不同的 培养工艺。 1.植物细胞的特性
植物、动物、微生物细胞的特性比较
细胞种类 植物细胞 微生物细胞
1～10 0.3-6 简单
动物细胞
10～100 ﹥15 复杂
细胞大小/um 200～300 倍增时间/h 营养要求 ﹥12 简单
•细胞具有锚地依赖性（宜采用贴壁培养）和接触抑制性
•原代细胞一般繁殖50代
2.培养方式
(1)悬浮培养 (2)贴壁培养
滚瓶培养 微载体培养(microcarrier culture)
3.工艺流程
种质细胞 （体细胞；杂交瘤细胞） 分散成悬浮细胞 细胞悬浮或贴壁培 养 收集 分离纯化 产物
胰蛋白酶消化
2、抗体结合位点化学修饰法：
抗体酶和酶一样也可以用化学修饰法加以改造。 对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方 法在抗体结合位臵或附近引入具有催化功能的基因。 游离巯基就是适合的基团之一，它具有高亲核性， 易于氧化，及能通过二硫化物进行交换反应或亲电 反应而选择性修饰的特点。
三、抗体酶的应用
1.戒毒:
用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原， 产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，水解后的可卡 因片断失去可卡因刺激功能。
2.肿瘤治疗
抗体介导前药治疗技术:将能水解前药释放 出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶 联，则酶通过和肿瘤结合的抗体存在于细胞 的表面。静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细 胞的表面或附近，抗体酶将前药迅速水解释 放出抗肿瘤药物。
第三章
动Hale Waihona Puke 植物细胞培养产酶定义：动、植物细胞培养是通过特定技术 获得优良的动、植物细胞，然后在人工控 制条件的反应器中进行细胞培养，以获得 所需产物的过程。
一、动植物细胞中酶生物合成的调节
1.细胞分化改变酶的生物合成（如端粒酶） 2.基因扩增加速酶的合成 3.增强子促进酶的生物合成 4.抗原诱导抗体酶的生物合成
(2)大蒜悬浮细胞培养
将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组 织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，加入灭菌的玻 璃珠，25℃，600lux，12h/d光照条件下震荡培养 10-12d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。 然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单 细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体 MS培养基中，25℃,600lux，12h/d光照条件下震荡 培养18d。
机械法 酶法
③细胞悬浮培养：转新培养基，在生物反 应器中进行培养 ④分离纯化：生化技术
4.植物细胞培养产酶实例
以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例
(1)大蒜愈伤组织的诱导
选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外 皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min， 然后无菌水漂洗3次。 在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有 3mg/L 2,4-D（二氯苯氧乙酸）和1.2mg/L 6-BA（苄 基腺嘌呤）的半固体MS培养基中，在25℃，600lux， 12h/d光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18 天继代一次。
(3)酶的分离纯化
细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞 破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。
三、动物细胞培养产酶
1.动物细胞培养的特点
•动物细胞可以产生各种有效高价值的物质 •需添加抗生素（常用青霉素和链霉素联合） •细胞生长速度慢 •细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感
•反应过程成本高（P81），产品价格贵
IgG与抗原形成 的交联晶格
3.酶与底物形成过渡态理论
酶的催化在于能结合底物产生过渡态，降低 能障（反应的活化能）。 以过渡态类似物作为半抗原，诱导与其 互补构象的抗体，使其具有催化活性，可观 察到抗体催化相应底物发生化学反应。
二、抗体酶的制备
1. 诱导法
用设计好的半抗原，通过与载体蛋白（如牛血清 白蛋白）偶联制成抗原。然后对动物进行免疫，使 宿主有机体针对抗原产生抗体，取免疫动物的脾细 胞与骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞既能产生抗体又能 在体外培养。将杂交体克隆化，即能产生单一均匀 的抗体酶。
光照要求
对剪切力 主要产物
大多数要求
敏感
不要求
大多数不敏感
不要求
非常敏感
色素、药物、 醇、有机酸、氨 疫苗、激素、 香精、酶等 基酸、抗生素、 单克隆抗体、 核苷酸、酶等 酶等
2.培养基特点
应用最广的是MS培养基 常用的MS培养基和B5培养基的组成列于 P73表3-3
3.培养工艺：——悬浮细胞培养
4.产酶实例
以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原 激活剂为例 纤溶酶原
纤溶酶原激活剂
纤溶酶
①种质细胞用胰蛋白酶处理，分散，pH7.4磷酸 盐洗涤。稀释成细胞悬浮液 ②接种到反应器中，与37℃ CO2培养箱中，长成 致密单层 ③去培养液，用pH7.4磷酸盐冲洗细胞 ④换无血清Eagle培养液(P83)，继续培养 ⑤每3-4天，取出培养液分离纯化 ⑥再加新鲜Eagle培养液，继续培养 ⑦亲和层析进行分离
细胞生产滚瓶培养装臵
第三章
小结：
1.概念：外植体；愈伤组织；微载体培养 2.何谓抗体酶？试述获得抗体酶的主要方法。 3.论述植物细胞培养产酶的条件控制。 4.动物细胞培养的特点有哪些？ 5.举例说明动物细胞培养产酶的工艺过程。
补充：
抗体酶
一、抗体酶的理论基础
1.抗体酶又称催化抗体（Catalytic antibody)是抗体的高度选 择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催 化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性。 2.抗原与抗体：当外源物性物质，如蛋白质、毒素、糖蛋白、脂 蛋白、核酸、多糖、颗粒（细菌、细胞、病毒）进入人或动物体 内时，机体的免疫系统便产生相应的免疫球蛋白（immune globin），并以之结合，以消除异物的毒害。此反应称为免疫反 应，此异物便是抗原，此球蛋白便是抗体。
工艺流程 外植体→细胞的获取→细胞培养→分离→纯化 产物 ①外植体选择和处理
选取那些无病虫害、生长旺盛、生长规则植株，把 茎、叶、根、芽，花、果实等切成小片段或小块。 用70%-75%乙醇，0.1%升汞消毒，无菌水漂洗。
外植体
水稻的外植体（幼 胚）和愈伤组织
愈伤组织
②植物细胞获取
直接分离法 愈伤组织诱导法 原生质体再生法