动植物细胞培养产酶
酶的来源介绍
酶的生产目前只宜直接从生物体中提取分离。 早期酶的生产多以动植物为主要原料，如激肽释放酶、菠萝蛋白酶、 木瓜蛋白酶。 近10年来，研究发展了动植物组织培养技术，但周期长、成本高。 工业生产一般都以微生物为主要来源。目前使用的千余种商品酶， 大多数是微生物生产的。
二、酶的来源
利用微生物生产酶制剂，其特点是： 1. 微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都年从微生物中
三、酶的产生菌
目前常用的产酶微生物：
1. E.coli ：是应用最广泛的产酶菌。分泌胞内酶，经细胞破碎分离得 到。在工业上用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、β-半 乳糖苷酶。
2. 枯草杆菌：主要用于生产α-淀粉酶、β-葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯 酶。
3. 啤酒酵母：丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶等。 4. 曲霉（黑曲霉和黄曲霉）：主要生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果 胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶。 5. 其他产酶菌：青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉菌等。
A-L-Ala A-D-Ala
储 罐
固定化 酶柱子
泵
离心机
反应产物 L-Ala A-D-Ala
晶体 L-Ala
消旋 反应器
三、酶的产生菌
生产菌的来源：
1. 菌种保藏机构和有关研究部门获得； 2. 大量要从自然界中分离筛选；自然界是产酶菌种的主要来源，土壤、 深海、温泉、火山、森林等都是菌种采集地。
筛选产酶菌的方法：采集、菌种的分离初筛、纯化、复筛和生产性能鉴 定等。
菌种改良的途径：应用遗传学原理进行基因突变、基因转移和基因克隆
得到； 2. 微生物生长繁殖快、生产周期短、产量过控制培养条件
来提高酶的产量； 4. 微生物具有较强的适应性和应变能力，通过各种遗传变异的手段，
酶工程期末复习题
第一章绪论问题：试述木瓜蛋白酶的生产方法？答：木瓜蛋白酶可以采用提取分离法、基因工程菌发酵法、植物细胞培养法等多种方法进行生产。
(1)提取分离法：从木瓜的果皮中获得木瓜乳汁，通过各种分离纯化技术获得木瓜蛋白酶。
(2)发酵法：通过DNA重组技术将木瓜蛋白酶的基因克隆到大肠杆菌等微生物中，获得基因工程菌，在通过基因工程菌发酵获得木瓜蛋白酶。
(3)植物细胞培养法：通过愈伤组织诱导获得木瓜细胞，在通过植物细胞培养获得木瓜蛋白酶。
第二章微生物发酵产酶1、解释酶的发酵生产、酶的诱导、酶的反馈阻遏(产物阻遏)、分解代谢物阻遏。
诱导物的种类？答：酶的发酵生产：利用微生物的生命活动获得所需的酶的技术过程；酶的诱导：加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为诱导作用；产物阻遏（反馈阻遏）：指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。
分解代谢物阻遏（营养源阻遏）：是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏其他酶合成的现象。
诱导物的种类：诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物，有的也是反应产物。
2、微生物产酶模式几种？特点？最理想的合成模式是什么？答：（1）同步合成型特点：a.发酵开始，细胞生长，酶也开始合成，说明不受分解代谢物和终产物阻遏。
b.生长至平衡期后，酶浓度不再增长，说明mRNA很不稳定。
（2）延续合成型特点：a.该类酶一般不受分解代谢产物阻遏和终产物阻遏。
b.该酶对应的mRNA是相当稳定的。
（3）中期合成型特点：a.该类酶的合成受分解代谢物阻遏和终产物阻遏。
b.该酶对应的mRNA不稳定。
（4）滞后合成型特点：a.该类酶受分解代谢物阻遏和终产物阻遏作用的影响，阻遏解除后，酶才大量合成。
b.该酶对应的mRNA稳定性高。
选择：在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的合成模式是延续合成型。
3、可以添加什么解除分解代谢物阻遏？表面活性剂的作用？答：（1）一些酶的发酵生产时要控制容易降解物质的量或添加一定量的cAMP，均可减少或解除分解代谢物阻遏作用。
文档：酶的制备
酶的制备酶的制备主要有两种方法，即直接提取法和微生物发酵生产法。
早期酶制剂是以动植物作为原料，从中直接提取的。
由于动植物生长周期长，又受地理、气候和季节等因素的影响，因此原料的来源受到限制，不适于大规模的工业生产。
目前，人们正越来越多地转向以微生物作为酶制备的主要来源。
—、酶的微生物发酵生产法1.微生物发酵生产法的优点酶的品种齐全微生物种类繁多，目前已鉴定的微生物约有20万种，几乎自然界中存在的所有的酶，我们都可以在微生物中找到。
酶的产量高微生物生长繁殖快，生活周期短，因而酶的产量高。
许多细菌在合适条件下20min左右就可繁殖一代，为大量制备酶制剂提供了极大的便利。
生产成本低培养微生物的原料，大部分比较廉价，与从动、医学教育|网搜集整理植物体内制备酶相比要经济得多。
便于提高酶制品获得率由于微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱变等方法培育出高产量的菌种。
另外，结合基因工程、细胞融合等现代化的生物技术手段，可以完全按照人类的需要使微生物产生出目的酶。
正是由于微生物发酵生产具有这些独特的优点，因此目前工业上得到的酶，绝大多数来自于微生物，如淀粉酶类的α一淀粉酶、β一淀粉酶、葡萄糖淀粉酶以及异淀粉酶等都是从微生物中生产的。
2.微生物发酵生产法中尚待解决的问题尽管微生物发酵法生产酶制剂存在上述优点，但仍存在一些问题需要解决。
消除毒性微生物发酵法生产的酶制品中会带人一些细菌自身的生理活性物质，这些生理活性物质往往对人体有害，因此进行毒性实验是必需的。
优良产酶菌种的筛选、培育目前，大多数工业微生物制酶生产采用的菌种较少，仅局限于11种真菌、8种细菌和4种酵母菌。
只有不断寻找更多的适用的产酶菌种，才可能使越来越多的酶采用微生物发酵法进行工业化生产。
3.微生物发酵生产法的条件控制微生物酶的发酵生产是在人为控制的条件下有目的迸行的，因此条件控制是决定酶制剂质量好坏的关键因素。
条件控制包括以下几个方面。
莘例说明植物细胞培养产酶的工艺流程
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酶工程 复习资料
第一章绪论1.何谓酶工程，试述其主要内容和任务。
酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。
酶工程的主要内容包括：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。
酶工程的主要任务是经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。
2.酶有哪些显著的催化特性？酶是生物催化剂，与非酶催化剂相比，具有专一性强、催化效率高和作用条件温和等显著特点。
3.简述影响酶催化作用的主要因素。
酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。
5.简述酶活力单位的概念和酶活力的测定方法。
酶活力单位：在特定条件下（温度可采用25℃，pH等条件均采用最适条件），每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位，这个单位称为国际单位（IU）。
在特定条件下，每秒催化1mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特（kat）酶活力的测定方法：振荡测定法，酶柱测定法，连续测定法，固定化酶的比活力测定，酶结合效率与酶活力回收率的测定，相对酶活力的测定。
或者测定方法：化学测定法、光学测定法、气体测定法其它.酶的发展历史：4000多年前的夏禹时代——酿酒技术。
3000多年前的周朝——制造饴糖、食酱等食品。
1833年——佩恩和帕索兹从麦芽的水抽提物中得到淀粉酶。
19世纪中叶——巴斯德对酵母的乙醇发酵进行研究。
1913年——米彻利斯和曼吞根据中间产物学说，推导出米氏方程。
1926年——萨姆纳得到脲酶结晶，并证明它具有蛋白质的性质。
1960年——雅各和莫诺德提出操纵子学说。
1982年——切克发现核酸类酶。
1983年——阿尔特曼发现核糖核酸酶P的RNA 部分M1RNA具有核糖核酸酶P的催化活性。
酶的专一性分为绝对专一性和相对专一性。
相对专一性又可分为键专一性和基团专一性米氏方程：酶的可逆性抑制作用可以分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。
植物细胞培养产酶的工艺流程
植物细胞培养产酶的工艺流程植物细胞培养是一种重要的生物技术手段，可以通过在无菌条件下培养植物细胞，利用其代谢产物来生产各种有用的化合物，其中包括酶。
植物细胞培养产酶的工艺流程主要包括以下几个步骤。
1. 细胞选择和预处理需要选择适合培养的植物材料，一般来说，具有高产酶能力的植物细胞株应该被选择出来。
然后，将选定的植物材料进行消毒处理，以去除外源微生物的干扰。
消毒处理通常使用酒精或含有抗生素的培养基进行，以确保培养过程的无菌性。
2. 培养基的准备培养基是植物细胞培养的基础，可以提供细胞所需的营养物质和生长因子。
常用的培养基包括MS培养基、B5培养基等。
在准备培养基的过程中，需要根据细胞的特性和所需产酶的要求进行调整，例如，添加适量的糖类、氨基酸、维生素等，以满足细胞的生长和代谢需要。
3. 细胞的接种和培养将预处理过的细胞接种到含有适量培养基的培养皿中，然后放入恒温摇床或培养箱中进行培养。
培养条件的选择应根据细胞的特性和产酶的要求来进行，如温度、光照、培养皿的摆放方式等。
在培养过程中，需要定期观察和检测细胞的生长情况，以及产酶的水平。
4. 酶的提取和纯化当细胞生长到一定程度时，可以进行酶的提取和纯化。
一般来说，细胞培养液中的酶可以通过离心、过滤和浓缩等步骤进行分离和富集。
然后，可以使用各种分离技术，如柱层析、电泳等，进一步纯化酶。
在纯化过程中，需要注意保持酶的活性和稳定性，以确保最终产酶的质量和纯度。
5. 酶的活性检测和分析纯化后的酶可以进行活性检测和分析，以确定其酶活性和产酶能力。
常用的酶活性检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、比色法、荧光法等。
此外，还可以通过分析酶的底物转化率、产物生成量等指标来评估酶的产酶能力。
6. 酶的应用纯化和活性检测合格的酶可以进行进一步的应用。
根据具体需求，酶可以用于医药、食品、农业、环境等领域的生产和研究。
例如，一些酶可以用于生产药物、酿造啤酒、提取果汁等。
植物细胞培养产酶的工艺流程包括细胞选择和预处理、培养基的准备、细胞的接种和培养、酶的提取和纯化、酶的活性检测和分析以及酶的应用等步骤。
02第二章 微生物发酵产酶 第三章 动植物细胞培养产酶
Amylase from Bacillus Protease from Bacillus Phosphatase from Bacillus Glucoamylase from Aspergillus …… Plant cell culture Animal cell culture
Few examples
30
进 位
成肽 转 位
31
合成终止
32
高效率的蛋白 质合成体系
33
蛋白质的折叠
蛋白质的空间结构如何形成？ 功能与结构如何统一？ 体外、体内的结构如何变化？
蛋白质分子设计及蛋白质工程的需要 越来越多的基因工程产物需要复性复活, 要求蛋白质折叠 的理论及技术的指导。基因工程重组蛋白类产物必须要形 成正确的折叠才能表现出功能和活性。
19
蛋白质合成的几个要素-遗传密码，nucleotide triplet codon
mRNA分子中,每三个相邻的核苷酸组成的三联体 代表某种氨基酸或其它信息，称为密码子或三联 密码。 四种核苷酸编成三联体可形成43个即64个密码子。 其中： 一个起始密码: AUG
三个终止密码: UAA
可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) （一种变构蛋白），通过与效应物 (effector) （包括诱导物和辅阻遏物）的特异 结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因 的结合力。 调节基因常位于调控区的上游。
38
启动基因（promotor gene）（启动子）：
有两个位点： （1）RNA聚合酶的结合位点 （2）cAMP-CAP的结合位点。 CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。 只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA 聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才 能开始。 P S DNA O R
第三章酶的生产
2023年5月15日星期一
第三章 酶的生产制备
酶的生产方式
1.提取法: 植物、动物、微生物
2.化学合成法
生物合成法： 利用植物、动物、微生物细胞合成。 上个世纪50年代起利用微生物生产酶
。 1949年细菌发酵生产淀粉酶
上个世纪70年代以来利用植物细胞和 动物细胞培养技术生产酶。
木瓜细胞培养生产木瓜蛋白酶和木瓜 凝乳蛋白酶 人黑色素瘤细胞培养生 产血纤维蛋白溶酶原激活剂
34
2.生长偶联型中的特殊形式——中期合成型
酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生 长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。 特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。
所对应的mRNA是不稳定的。
枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线 35
3.部分生长偶联型（又称延续合成型）
酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入 平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。 特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。
所对应的mRNA相当稳定。
黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线 36
4. 非生长偶联型（又称滞后合成型）
只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并 大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 特点：受分解代谢物的阻遏作用。
所对应的mRNA稳定性高。
黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线 37
总结：影响酶生物合成模式的主要因素
②发酵代谢调节：理想诱导物的添加，解除 反馈阻遏和分解代谢物阻遏（难利用的碳 氮源的使用，补料发酵）。
③降低产酶温度。
二、细胞生长动力学
微生物细胞生长的动力学方程：
Monod方程：
S－限制性基质浓度； μm—最大比生长速率； Ks —Monod常数
酶工程第3版
一、动植物细胞的特点: 动植物细胞的特点
• 1、体积比微生物大； 、体积比微生物大； • 2、对剪切力敏感； 、对剪切力敏感； • 3、生长和代谢速率低，生长倍增时间和发酵 、生长和代谢速率低， 周期长； 周期长； • 4、动物细胞营养要求复杂； 、动物细胞营养要求复杂； • 5、发酵产物不同 、
三、动物细胞发酵
1、动物细胞可以生产多种具有较高价值的药物，特 、动物细胞可以生产多种具有较高价值的药物， 别是疫苗、激素、单克隆抗体和酶等。 别是疫苗、激素、单克隆抗体和酶等。 由动物细胞培养生产的酶有胶原酶， 由动物细胞培养生产的酶有胶原酶，血纤蛋白溶 酶原活性剂等。 酶原活性剂等。 2、动物细胞培养方法： 、动物细胞培养方法： 悬浮培养； 悬浮培养；固定化细胞培养 3、动物细胞发酵工艺植物细胞发酵技术和特点： 、植物细胞发酵技术和特点： 植物细胞发酵技术 发酵特点（与直接提取分离相比较而言）： 发酵特点（与直接提取分离相比较而言）： （1）提高产率； ）提高产率； （2）缩短周期 ）缩短周期; （3）易于管理、减轻劳动强度； ）易于管理、减轻劳动强度； （4）提高质量。 ）提高质量。
2、植物细胞发酵技术 、 (I)高产细胞系的选择： 主要有以下几个途径： 高产细胞系的选择： 高产细胞系的选择 主要有以下几个途径： 材料选择，克隆选择，抗性选择，诱变选择,细 材料选择，克隆选择，抗性选择，诱变选择 细 胞工程和基因工程选择； 胞工程和基因工程选择； (II)影响产物产量的因素： 材料来源 培养基成分， 影响产物产量的因素： 材料来源,培养基成分 培养基成分， 影响产物产量的因素 光照和温度， ，细胞形态分化程度等; 光照和温度，pH，细胞形态分化程度等 (III)提高产物产量的途径： 选择高产细胞系，控 提高产物产量的途径： 提高产物产量的途径 选择高产细胞系， 制细胞生长和分化程度，加入诱导物或前体， 制细胞生长和分化程度，加入诱导物或前体， 两相培养和产物释放，毛壮根培养技术。 两相培养和产物释放，毛壮根培养技术。 (IV)植物细胞培养系统专用的生物反应器。 植物细胞培养系统专用的生物反应器。 植物细胞培养系统专用的生物反应器
动植物细胞培养产酶
(2)大蒜悬浮细胞培养
将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈 伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4D和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体 MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃， 600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d， 使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。
然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团 或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25℃,600lux， 12h/d光照条件下震荡培养18d。
(3)酶的分离纯化
细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破 碎、提取、分离得到超氧化物式图
1.动物细胞培养的特点
•细胞生长速度慢。（需添加抗生素） •细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。 •反应过程成本高，产品价格贵。 •细胞具有锚地依赖性。 •原代细胞一般繁殖50代。
愈伤组织：
将上述外植体植入诱导培养基中，于25℃左 右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小 细胞团。
外植体
水稻的外植体（幼 胚）和愈伤组织
愈伤组织
4. 培养条件的影响与控制
（1）温度 （2）pH （3）通气与搅拌 （4）光照的控制 （5）前体的添加（饲喂） （6）刺激剂（elector）的应用
2.培养基特点
应用最广的是MS培养基和LS培养基
MS培养基是1962年由Murashinge和 Skoog为烟草细胞培养而设计的培养基。LS 培养基是在其基础上演变而来的。
3.培养方法：悬浮细胞培养
①细胞株的建立；外植体与愈伤组织 ②扩大培养； ③大罐培养；
外植体：
从植株取出，经过预处理后，用于植物组织 培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、 果实、种子等）的片段或小块。
第三章 动植物细胞培养产酶
大多数要求 不要求 敏感
大多数不敏感 非常敏感
色素、药物、 醇、有机酸、 疫 苗 、 激 素 、 香精、酶等 氨基酸、抗生 单 克 隆 抗体 、 素、核苷酸、 酶等 酶等
三者之间的差异主要有：
•植物细胞>动物细胞>微生物细胞。
•动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。
•植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。
•植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的 光照。 •植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。 •植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。
第二节 植物细胞培养产酶
1902年，德国植物学家G.Haberlandt就预言植物细 胞培养的可能性。 1937年前后，法国和美国科学家分别成功的进行 了胡萝卜和烟草的组织培养。 1966年Klein指出，能利用植物细胞培养物代替收 集或栽培植株来生产生化制品。 近40年来，植物细胞培养研究成功的例子已有不 少，如用紫草悬浮培养物生产紫草宁；烟草细胞的大 量培养等等。
植物细胞培养基的组成
植物细胞培养基通常包括无机盐、碳源、维生素、 生长调节素和有机添加剂等。 无机盐类 包括：大量元素 无机盐 微量元素主要包括碘、硼、锰、锌、钼、 铜、钴、铁等。 碳源和能源 蔗糖（植物细胞碳源和能源相同） 维生素 植物细胞的生长都需要硫胺素。可在 植物细胞培养基中加入烟酸、吡哆醇、泛酸、生物素和 叶酸等。原生质体培养通常需要大多数必需维生素。
（4 ）分离纯化 如利用大蒜细胞悬浮培养完成后，收集细胞，经过 细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。
水稻的外植体（幼 胚）和愈伤组织
4、植物细胞培养的条件控制
• • •温范围（25℃） （2）pH的控制 在微酸性范围 pH5.0-6.0 （3）溶解氧的控制 （4）光照的控制 （5）前体的添加 （6）刺激剂的添加
动植物细胞培养产酶
合成其所对应的酶；mRNA稳定性差的，就随着细胞生长进入
平衡期而停止酶的生物合成； 不受培养基中存在的某些物质阻遏的，可以伴随着细胞生长 而开始酶的合成；受到培养基中某些物质阻遏的，则要在细胞 生长一段时间甚至在平衡期后， 酶才开始合成并大量积累。
第三节 酶生物合成的模式
理想的酶合成模式
发酵产酶， 为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合 成模式应是延续合成型：在发酵过程中没有生长期和产酶期的 明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平 衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。 对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程\细胞工程等先 进技术,选育得到优良的菌株, 并通过工艺条件的优化控制, 使他 们的生物合成模式更加接近于延续合成型。
and
Monod的工作：
第三节 酶生物合成调节
第三节 酶生物合成调节
3、分解代谢物阻遏：
分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直 接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程 中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。
第三节 酶生物合成的模式
细胞在一定条件下培养生长， 其生长过程一般经历调整 期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段 。 把酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型，延续 合成型，中期合成型和滞后合成型。
。 机与速度。
4.结构基因：决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关 系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。
第三节 酶生物合成调节
2、原核生物酶合成调节的操纵子类型： （1）诱导 Induction 组成酶(constitutive enzymes)：细胞固有的酶类。 诱导酶(inducible enzymes：细胞为适应外来底物或其结构类似 物临时合成的一类酶。 。
酶工程：动植物细胞培养产酶
四、植物细胞培养产酶的工艺过程
以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例
SOD是生物体内清除超氧化物阴 离子自由基(O 2—)的重要金属酶 类。它和过氧化氢酶、过氧化物 酶一起构成了生物体内重要的酶 促反应防御体系，从而维护生物 体内细胞正常的生理代谢和生化 反应。衰老自由基学说认为衰老 源于机体正常代谢过程中产生过 量的自由基对机体损害的结果。 超氧化物歧化酶(SOD)作为能催化 超氧阴离子发生歧化反应的自由 基清除剂，具有延缓衰老的作用。
(2)大蒜悬浮细胞培养
将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈 伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D 和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体MS 培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃， 600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d，使 愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。 然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞 团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25℃,600lux， 12h/d光照条件下震荡培养18d。
二、动物细胞培养的特点
（1）主要用于生产各种功能蛋白质； （2）生长缓慢； （3）需加抗生素防污染； （4）细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感； （5）具锚地依赖性，宜贴壁培养；部分用悬浮培养； （6）培养基成分复杂，反应过程成本高，产品价格贵 ；
二、植物细胞培养的特点
（1）提高产率
例如：紫草宁的生产， 发酵细胞中的紫草宁比 紫草根中高10倍。
紫草宁的结构
（2）缩短周期 发酵周期10～30天，种植周期几个月～几年。 （3）易于管理 减低劳动强度；不受地理环境和气候条件等影 响。 （4）提高产品质量 主要产物浓度高，易于分离纯化，减少环境中 各种有害物质污染和侵蚀。 （5）其它 设计植物细胞生物反应器和控制工艺条件时应 注意一些问题。
酶工程第三章 动植物细胞培养产酶
制备微载体的材料主要有：
葡聚糖（DEAE—Sephadex A50及A25 ） 塑料 明胶 玻璃 纤维素
四、动物细胞培养的工艺条件及其控制
种质细胞：体细胞、杂交瘤细胞； 工艺过程：
胰蛋白酶
种质 细胞
悬浮 细胞
悬浮培 养或贴 壁培养
收集培 养液、 分离纯 化
（一）动物细胞培养基组成成分
生产组织纤溶酶原活化剂的工艺过程
１、人黑色素瘤细胞培养基；
２、人黑色素瘤细胞培养；
３、组织纤溶酶原激活剂的分离纯化。
动、植物细胞培养与微生物培养区别
动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固 体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨 基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血 清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪 切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测 和控制。 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细 胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养 产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的 培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。
1、氨基酸：各种必需氨基酸，谷氨酰胺等， 作为碳源和能源利用； 2、维生素：血清中，B族和维C； 3、无机盐：调节渗透压； 4、葡萄糖：作为碳源和能源； 5、激素：胰岛素、生长激素、氢化可的松； 6、生长因子：如表皮生长因子、神经生长 因子、成纤维细胞生长因子。
（二）动物细胞培养基的配制
首先配制各类母液，使用前混合过滤除菌， 使用时稀释至所需浓度； 各种动物培养基已商品化。
（六）溶解氧的控制
溶解氧的供给对动物细胞培养至关重要； 采用调节混合气体的量与比例的方法。
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理化性质
• 英文名：Paclitaxel, Taxol® or
Ph3
O C6H5
Ph2
C6H5 O N H
3' 2' 1'
18 12
AcO
11
10 9 17 2 16
O19
8 3
OH
6 5 20 O
O C6H5
OH
二、动物细胞培养产酶
动物细胞的特性 动物细胞培养特点与培养方式
动物细胞培养的工艺条件控制
动物细胞培养产酶的工艺过程
典型动物细胞培养产酶的工艺过程
2.1 动物细胞的特性
动物细胞的形态
A、贴壁依赖型
1、成纤维细胞（fibroblast 或mechanocyte type)
2、上皮细胞（epithilium cell)
缺点：1、合成过程烦琐复杂，几十步
2、费用高，化学试剂昂贵 3、总收率太低（2%）
• 半合成
以10-DABⅢ和Baccatin Ⅲ作为半合成原料获得 紫杉醇 新方法用10-DAT
优点：1、原料枝叶含量丰富、 提取相
对容易，充分利用再生资源 2、产率较高； 3、可以规模化制备； 4、获取紫杉醇构效关系信息，进 行结构改造; 缺点：合成过程相对复杂 （11步化学转化和7步分离）
3、游走细胞（wondering cell）
4、多形性细胞（polymorphic cell)
B、悬浮型或非贴壁依赖型
1、动物细胞的特性
动物细胞的特性
动物细胞没有细胞壁，适应环境能力差； 动物细胞的体积大，稍小于植物细胞； 大部分细胞具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制 性；
动物细胞的营养要求较为复杂；
植物细胞组织培养
外植体
愈伤组织
新植株
3）植物细胞的培养
将获得的植物细胞在无菌条件下，转入新的液体培养基，
在人工控制条件的生物反应器中，进行细胞悬浮培养获 得所需产物；
培养方法：固体培养、液体浅层培养和液体悬浮培养；
4）细胞培养产物的分离纯化
细胞培养完成后，分离收集细胞或者培养液，采用各种 分离技术从细胞或培养液中得到所需产物 ；
年 代
1958 1967 1968 1971 1979
进
展
NCI开始大规模植物药研发筛选 发现紫杉醇抗癌活性 从红豆杉中分离出紫杉醇 完成结构鉴定 发表作用机制
•NCI称其为过去15 年中开发的最好的抗 癌药物 •20世纪90年代抗肿 瘤药的三大成就之一 •汤姆森科技桂冠奖
1983
1985 1991 1992
2.2 动物细胞培养特点与培养方式
临床Ⅰ试验
临床II期 临床III期 FDA批准上市
Ramesh Panchagnula, International Journal of Pharmaceutics.1998(172)1-15.
市场需求
抗癌一线用药
销售额年增长率5亿美元 理论需求量 2g /人, 500万人/年 1000kg/年 实际销量 350 kg/年 紫杉醇供需相差十分悬殊
组成：在配制1升（1000毫升）培养基时，加硝酸铵1.65
克、硝酸钾1.9克、氯化钙0.44克、硫酸镁0.37克、磷酸
二氢钾0.17克、碘化钾0.83毫克、硼酸5.2毫克、硫酸镁 22.3毫克、硫酸锌3.6毫克、钼酸钠0.25毫克、硫酸铜
0.025毫克、氯化钴0.025毫克、硫酸铁27.8毫克、蔗糖30
药源问题解决办法（三）
– 生物方法
优点：1、摆脱自然因素，可长期稳定 生长 2、适应市场、方便调节 3、成分简单，有利于分离纯化 4、成本低、生长周期短 5、为半合成提供原料 6、有望工业化生产
• 细胞培养
细胞培养35天，最高产量885.9mg/L
• 微生物发酵
缺点：1、一般缺乏合成途径； 2、产量低、不稳定 （25－50ng/L）
在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3
mg/L和 2,4-D和1.2mg/L 6-BA的液体培养基中，25℃、 600lux，12h/d的光照条件条件下培养18天； 3）SOD的分离纯化 细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎，用pH7.8的 磷酸缓冲液提取、有机溶剂沉淀等，分离得到SOD
克和琼脂7克。
3.3 植物细胞培养的工艺条件控制
温度的控制：室温25（20～35℃）；
pH值的控制：5.0-6.0；
溶解氧的控制：对氧一般要求，但要求低剪切力； 光照控制：一般要求光照，如欧芹细胞只有在光照 下才能形成类黄酮化合物；蓝光可以显著促进玫瑰 茄细胞培养生产花青素；
3.3 植物细胞培养的工艺条件控制
30 25 20 15 10 5 0.8 0 1992 1994 1995 1998 1999 2000 2001 2002 3.4 14.8 12 6.6 18.2 20 25
图2：国际紫杉醇销售额（亿美元）
1000 800 600 400 200 0 2000年 2002年 2004年 300 350 480 需求量 620 1000 780
图1：国际紫杉醇原料药需求走势图（单位：公斤）
紫杉醇开发的关键问题
• 上游产业——药源问题
• 下游产业——制剂问题
– 药效（活性、水溶性） – 安全性 – 生物相容性
药源
• 红豆杉
国家一级保护野生植物，全球十大 濒危物种之一
• 生长缓慢 分布有限 Taxol含量低
树皮中Taxol含量:0.00001-0.069% 3000棵树=10吨树皮=1kg Taxol=500病人
剂，可使细胞积累小孽碱的量4倍；
3.4 典型的植物细胞培养产酶工艺过程
—大蒜细胞培养产SOD
研究背景
SOD的作用： 抗氧化、抗衰老、抗辐射，药用酶；
传统SOD制备方法: 动物血液提取：杂蛋白多，难以达到药用要求； 植物中提取：受生长环境及生长周期影响；
植物细胞培养优势：
周期短，培养15天达到自然生长大蒜中含量，可控性好；
药源问题解决办法（一）
– 人工栽培
采用种子繁殖、扦插等无性繁 殖方法快速、大面积人工繁育 红豆杉幼苗 缺点：1、紫杉醇含量低 生长缓慢 2、提取工艺复杂
– 寻找红豆衫的替代物
从红豆杉非树皮部位提取 产紫杉醇的非红豆杉植物
药源问题解决办法（二）
– 化学合成 • 全合成
1994年获得成功 现有六种途径
前体的添加：添加前体能提高次级代谢物的产量，如
苯丙氨酸的添加能促进辣的应用：常用刺激剂有微生物细胞碎片和果胶
酶、纤维素酶等微生物胞外酶；如Rolfs等用霉菌细胞 壁碎片促进花生细胞中L－苯丙氨酸裂合酶的含量增加 4倍，同时使二苯乙烯合酶的量提高20倍；Funk等人 采用酵母葡聚糖（酵母细胞壁的主要成分）作为刺激
常用的植物细胞培养基举例： MS培养基
Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特
点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，
它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植 物细胞的营养和生理需要,因而适用范围比较广，多数植 物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基
Ph1
13 15 14 1
H
4
7
HO O O
H AcO
• • •
TM 分子式：C47H51NO4 水溶性：0.7mg／ml 稳定性：
– – – –
Paclitaxel (Taxol)
pH4～8 稳定； pH <4较稳定； pH >8 易分解； 在特定条件下紫杉醇可被氧化， 但极难还原；
紫杉醇研发过程
3.4 典型的植物细胞培养产酶工艺过程
—大蒜细胞培养产SOD
1）大蒜愈伤组织的诱导
选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，在4℃冰箱中放 置3周，以打破休眠。去除外皮，先用70％乙醇消毒20s， 再用70％乙醇消毒20s，再用0.1%的氯化汞消毒10min， 然后用无菌水漂洗3次；
在无菌条件下，切成0.5cm3左右的小块，植入含有
2、没有放大研究价值
一、植物细胞培养产酶
1、植物细胞的特性 2、植物细胞的培养特性 3、植物细胞培养的工艺条件控制 4、典型的植物细胞培养产酶工艺
1、植物细胞的特性
植物细胞培养产酶实例
植物细胞比微生物细胞大，体积比微生物细胞 大103－106； 植物细胞生长速率和代谢速率比微生物低，生 长周期长；
（4）植物生长激素
（5）有机酸 （6）复合物质
植物细胞培养基的特点
•
需要大量的无机盐：除P,S,N,K,Na,Ca,Mg等大量元素
（102～3×103mg/L）外，还需要Mn,Zn,Co,Mo,Cu,B,I等
微量元素（10－2～30mg/L）； • 需要多种维生素和植物生长激素：如硫胺素、吡多素、 烟酸、肌醇、生长素、分裂素等； • 氮源一般为无机氮源，可同化硝酸盐和铵盐； • 碳源一般为蔗糖，浓度一般为2-5%；
3. 植物细胞培养的工艺条件控制
3.1 植物细胞培养的工艺流程
外植体细胞的获取细胞培养分离纯化产物
1）外植体的选择与处理
外植体选择原则：无病虫害、生长力旺盛、生长有规则的
植株；若是用于生产次级代谢产物，则从产生该次级代谢
产物的组织部位切取部分组织； 处理方法：将外植体切成0.5~1cm的片段或小块，用70 ％～75％乙醇溶液或5％次氯酸钠、10％漂白粉、0.1%升 汞溶液等进行消毒处理，再用无菌水充分漂洗，以洗去残