基于无机纳米粒子的蛋白质检测方法

用催化还原金属粒子沉积在微电极中间， 导致欧 姆电阻降低来对生物特异性反应进行电学检测。 压电阻抗技术已经成功地发展起来， 并且广泛应 用于对液相压电石英晶振行为的表征。
一些研究者将压电阻抗技术和电化学阻抗分 析 相 结 合［６］， 通 过 运 用 纳 米 金 修 饰 电 极 研 究 了 人 血 清 清 蛋 白 （ ＨＡＳ） 和 ｄｉａｚｅｐａｍ 之 间 的 相 互 作 用 ， 并 且 提 供 了 直 接 的 、 实 时 的 ＨＡＳ－ ｄｉａｚｅｐａｍ 结 合 的信息。实验结果显示， 纳米金扮演了导电通道 的角色； 与裸金电极相比， 纳米结构传感器具有 表面积大、更好地保持生物活性和生物兼容性等 许 多 优 势 。Ｗａｎｇ 等 ［７］ 使 用 纳 米 金 增 加 了 电 极 表 面抗体的固定量， 通过阻抗检测监控了抗原－ 抗 体 之 间 的 反 应 。 将 直 径 为 ６ ｎｍ 的 纳 米 金 固 定 在 用 ４－ 氨基苯硫酚（４－ ａｍｉｎｏｔｈｉｏｐｈｅｎｏｌ）修饰了的金电 极上形成自组装单分子层， 使得抗体的吸附更容 易。通过测定阻抗的变化， 反映出了抗体识别层 与抗原之间的相互作用。结果显示， 利用此方法 检测肝炎病毒表面抗 原 在 ０．５～２００ μｇ／Ｌ 范 围 内 具 有很好的相关性， 检测下限达 ５０ ｎｇ／Ｌ。
●技术与方法
《生命的化学》２００５ 年 ２５ 卷 ５ 期 ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２００５， ２５（５）
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１．２ 光学散射 无机纳米粒子除了有较大的消光 系数外， 还有很大的散射系数。据估计， 从一个 粒径为 ８０ ｎｍ 的粒子发出的散射光通量等同于 ６× １０６ 个 荧 光 分 子 发 出 的 荧 光 通 量［３］。 因 此 ， 标 记 有 无机纳米粒子的生物分子的散射光能够被灵敏地 成 像 和 放 大 。Ａｂｂｏｔｔ 实 验 室 成 员 首 先 将 散 射 光 用 于成像含有硒纳米粒子的微阵列， 在该项研究 中， 研究人员使用微阵列作为内部反射波导， 这 样通过阵列自身照亮玻片表面。这种方法产生了 具有深远意义的影响， 仅仅只有结合到阵列表面 的纳米粒子而决非悬浮于溶液中的纳米粒子才能 被照亮和成像。
寸、形状以及成分。因此， 通过吸光率可以精确 定量结合在阵列上的纳米粒子的密度， 甚至结合 在表面上的单个纳米粒子都可以通过透射电子显 微镜而被定位和成像， 并且可通过电子显微镜或 力学显微镜来证实。在组织化学上， 用表面吸附 有抗体分子的金纳米粒子（１０～４０ ｎｍ）特异性标记生 物样品， 实现了在生物样品的不同区域进行标记、 分 析 。Ｈａｎ 等 ［１］ 在 检 测 水 样 中 杀 虫 剂— ——二 氯 苯 代谢物（ ＢＡＭ） 的竞争性免疫实验中， 使用了抗体－ 金纳米复合物， 经扫描电子显微镜研究， 发现扫 描仪的检测信号与抗体－ 金纳米复合物的密度有 关， 且此扫描仪可检测到 ６×１０－１８ ｍｏｌ／Ｌ 的抗体－ 金 纳米粒子复合物， 并且金标免疫测定系统的检测 结果与荧光标记测定结果相当。
［１１］ Ｎｅｓｖｉｚｈｓｋｉｉ ＡＩ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ２００３， ７５（１７）： ４６４６—４６５８ ［１２］ Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＤＣ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ， ２００３， ２（２）： １３７—１４６ ［１３］ Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ ＥＦ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ， ２００４， ３（４）： ７６０—７６９ ［１４］ Ｃａｒｇｉｌｅ ＢＪ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２００４， ７６（２）： ２６７—２７５ ［１５］ Ｓｕｎ Ｗ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ， ２００４， ３（１２）： １１９４—１１９９
— — — — — — — — — — — 收稿日期 ： ２００５－ ０７－ ０８ 作 者 简 介 ： 朱 丽 华 （１９７９—）， 女 ， 硕 士 生 ， Ｅ－ ｍａｉｌ： ｚｈｕｌｉ－
ｈｕａ７９＠ｅｙｏｕ．ｃｏｍ； 莫志宏（１９６５—）， 男， 博士， 教授， 博士生导师， 联系作者， Ｅ－ ｍａｉｌ： ｚｈｉｈｍｏ＠ｃｑｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
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《生命的化学》２００５ 年 ２５ 卷 ５ 期 ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２００５， ２５（５）
●Ｔｅ ｃｈｎｉｑｕｅ ｓ ａ ｎｄ Ｍｅ ｔｈｏｄｓ
基于无机纳米粒子的蛋白质检测方法
１ 朱丽华 １，２ 莫志宏
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［ ６ ］ Ｈａｎ ＤＫ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２００１， １９（１０）： ９４６—９５１ ［ ７ ］ Ｍｏｏｒｅ ＲＥ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ， ２００２， １３： ３７８—３８６ ［ ８ ］ Ｅｎｇ ＪＫ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ， １９９４， ５（１１）： ９７６—９８９ ［ ９ ］ Ｆｅｎｙｏ Ｄ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ２００３， ７５（４）： ７６８—７７４ ［１０］ Ｋｅｌｌｅｒ Ａ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ２００２， ７４（２０）： ５３８３—５３９２
近年来， 纳米科技开辟了人类科学研究的一 个全新层次。由于纳米粒子的小尺寸效应、界面 效应和量子效应及优良的光学和电学特性， 使得 其在生物医学及生命科学中的应用成为研究的热 点， 尤其在蛋白质检测中的应用更为人们所关 注。最近， 一些研究团体使用无机纳米粒子替代 荧光有机染料作为标签， 建立起了蛋白质检测方 法。从大体上讲， 这些检测方法的构建都是基于 无机纳米粒子独特的物理特性， 包括消光系数和 散色系数大、催化活性强、表面电子数高以及在 溶液中有效的布朗运动等等。 １． 光学检测 １．１ 光学吸收 分析纳米粒子标记的表面或许最 简单的方法就是通过测定纳米粒子对光的吸收。 金属纳米粒子的消光系数是 １０６～１０１２ （ｍｏｌ／Ｌ）－１ｃｍ－１， 比有机染料的消光系数要大许多倍。金属纳米粒 子大的消光系数以及其水溶液的多彩颜色可以被 解释为金属中电子传导（ 或等离子体） 的集体响应。 纳米粒子的吸收光谱和吸收强度取决于粒子的尺
（ 重 庆 大 学 １ 化 学 化 工 学 院 、２ 生 物 医 学 工 程 学 院 ， 重 庆 ４０００４４ ）
摘要： 最近几十年， 纳米技术在蛋白质检测中的应用得到了飞速发展， 其突出的优点是灵敏度高、特异性强、 小型化、生物兼容性好。小的标记尺寸、生物联化学以及无机纳米粒子的非乎寻常的光学和电学特性， 使得 此项技术已经成为蛋白质检测的独特工具。该文对无机纳米粒子的优良特性及其在蛋白质检测中的具体应用作 了分析和评述， 并对其发展前景作了展望。 关键词： 无机纳米粒子； 蛋白质检测； 应用 中 图 分 类 号 ： Ｑ５０３
对 于 浓 度 在 １０－ １５～１０－ １２ ｍｏｌ／Ｌ 范 围 内 的 蛋 白 质 样品来说， 纳米粒子的表面密度太小了， 通过简 单的成像技术无法观测到。据报道， 免疫组织化 学样品的电子和光学显微镜成像中的银增强方 法， 改进晶体的能见度， 对分析信号进行放大， 提 高 了 纳 米 粒 子 阵 列 的 灵 敏 度 ， 并 实 现 了 １０ － １５ ｍｏｌ／Ｌ 浓 度 目 标 分 子 的 定 量 。 将 此 法 应 用 于 对 人 ＩｇＧ 的 检 测 中 ， 固 相 检 测 浓 度 达 １ ｐｇ， 液 相 为 ２．７５ μｇ／Ｌ， 并 且 样 品 浓 度 的 对 数 与 信 号 强 度 之 间 存 在 较 好 的 线 性 关 系 ［２］。
Ｗｕ 等 ［８］ 构 建 了 一 种 免 疫 电 容 传 感 器 ， 用 于 直接检测人类血清中的免疫球蛋白（ ＩｇＧ） 。此项技 术是基于金纳米粒子在溶胶－ 凝胶修饰的电极表 面上的自组装。通过改变阻抗电流可以监控到与 ＩｇＧ 浓度相对应的传感电容值。研究人员还指出 ， 溶胶－ 凝胶膜是超薄的， 电极表面固定的抗体也 是高密度的， 此时固定在金粒子表面的抗体能保 持其生物活性。此项技术具有高灵敏性和特异 性， 抗原浓度在 ８．３０ μｇ／Ｌ～２．１３ ｍｇ／Ｌ 范围 内 ， 表 现出良好的直线关系， 检测下限为 ３．３ μｇ／Ｌ。 ２．２ 电化学检测 通过氧化消熔无机金属或金属 粒子水溶液， 然后电化学传感这个离子， 固定于 传感界面上的金属纳米粒子能够被间接的检测出 来。例如， 在 ＨＢｒ／Ｂｒ２ 蚀刻试剂溶液中， 金纳米粒 子 被 定 量 化 的 氧 化 为 ＡｕＢｒ４－ 离 子 。 ［９，１０］ 阳 极 溶 出 伏 安 法 （ＡＳＶ）是 一 种 非 常 敏 感 并 且 具 有 选 择 性 的 检 测 金属离子的方法， 目前已有许多科学团体使用。 Ｃｈｕ 等［１１］ 利 用 阳 极 溶 出 伏 安 法 监 测 了 银 在 胶 体 金 标签上的沉积， 从而间接地检测到抗原－ 抗体免疫 反应的存在。此实验中采用夹心式结构， 实现了 高特异性、高灵敏性地检测 ＩｇＧ。ＩｇＧ 浓度在 １．６６ μｇ／Ｌ～２７．２５ ｍｇ／Ｌ 范围时， 阳极溶出电 流 与 ＩｇＧ 浓 度 成 直 线 关 系 ， ＩｇＧ 的 检 测 下 限 达 １ μｇ／Ｌ， 此 结 果与 ＥＬＩＳＡ 实验结果以及荧光标记结果相一致。
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●Ｔｅ ｃｈｎｉｑｕｅ ｓ ａ ｎｄ Ｍｅ ｔｈｏｄｓ
文 献［１０］报 道 的 电 化 学 放 大 方 法 ， 可 以 敏 感 地检测纳米金粒子， 该方法是通过确定酸性溶 液 中 氧 化 处 理 后 释 放 出 的 Ａｕ （ Ⅲ） 离 子 的 浓 度 来 实现的。因而， 使用电化学检测方法确定传感 界面上金粒子的数量是非常简便的。有些研究 者在一个多元检测中使用了不同材料的纳米粒 子， 此方案中不同目标用不同半导体材料的胶 体标记， 并且那些材料可以被阳极溶出伏安法 选择性地鉴别。 ３． 重量测定