第04章药物定量分析与分析方法验证-2013年

高效液相色谱法（HPLC）
固定相、流动相及检测器的选择 常用系统
固定相（色谱柱）：十八烷基硅烷键合硅
胶C18
流动相：甲醇-水、乙腈-水
检测器：紫外吸收检测器
检测器：
紫外检测器（UVD 最常用）
荧光检测器
示差折光检测器
电化学检测器
二极管阵列检测器（DAD）
蒸发光散射检测器（ELSD）
质谱检测器（MS）
计算
√
滴定度：1mL某物质的量浓度的滴定
液相当于被测药物的重量，中国药典 用mg表示。量纲mg/ml。
滴定度的计算：
T→滴定度(mg/ml) c→滴定液浓度(mol/L) M→被测物质分子量
例
VitC I 2 去氢抗坏血酸 I
以I2（0.05mol/L）计，反应摩尔比 1∶1
对照品比较法
由于绝对荧光强度难以测定，需要在每次测 定前用一定浓度的对照品溶液校正仪器灵敏 度，然后读取对照品溶液、供试品溶液及各 自溶剂的空白读数。
C待测＝C对照×
由于浓度线性范围较窄，
应在0.5～2.0之间。
三、色谱分析法
高效液相色谱法（HPLC）
气相色谱法（GC）
色谱过程
流动相
被分离组分 固定相
鉴别反应、杂质检查、含量测定方法均应考察。
鉴别反应：用不含被测成分的供试品，应 呈负反应。 含量测定和杂质检查： 试样中加入杂质或辅料，考察是否干扰。 加速破坏试验（强光照射、高温、高湿、 酸碱水解、氧化），研究可能的降解产物 和降解途径，检查色谱分离情况。

（四）检测限LOD
样品中待测组分能被检测出的最低量。 是限度试验参数，无需定量测定。常用%、 ppm、ppb表示。 非仪器分析法-目视法 能观察到实验现象的最低浓度为检测限
气相色谱法（GC）
色谱系统 色谱柱：填充柱和毛细管柱 检测器： 氢火焰离子化检测器（FID） 电子捕获检测器（ECD）
系统适用性试验：同HPLC法 含量测定：
以内标法为主，操作及计算方法同HPLC法
第二节 药品质量标准分析方法验证
一、目的
证明所用的分析方法适合相应的检验要求。
二、用途
（一）起草新药质量标准时 （二）改变生产工艺时 改变制剂处方 修订原分析方法时
和准确度要求。
（六）线性
是指在一定范围内，样品浓度与检测结果的 线性关系。
线性回归 相关系数
y ＝ a + bx r 越接近1越好
（七）范围
指在达到一定精密度、准确度和线性的 条件下，该方法适用的高低浓度或量的区间。
标准曲线的高低浓度范围即为线性范围
适宜检测范围
原料或制剂 测试浓度的 80%~120%
三、需验证的分析项目 鉴别 检查：杂质定量或限度检查 含量测定：原料药或制剂中有效成 分及制剂中其他成分（如降解产物、 防腐剂等）。
四、验证指标 √
准确度 专属性 定量限 精密度 检测限 线性
范围
耐用性
（一）准确度
测定结果与真实值或参考值接近程度
用百分回收率表示。
测定回收率R（recovery）的具体方法可采
As / Cs 校正因子（f） AR / C R
对照
内标 对照+内标
校正因子 f =(A内/ C内)/(A对/C对)
样品 内标 样品+内标
Ax Cx f ' ' As / Cs
例

黄体酮的含量测定

内标溶液的制备：取己烯雌酚25.0mg，置于25mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。 测定：取黄体酮对照品25.6mg，置于25mL量瓶中， 加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液 与内标溶液各5mL，置于25mL量瓶中，加甲醇稀 释至刻度，摇匀。取5μL注入液相色谱仪，记录色 谱图，测得黄体酮峰面积为537808，己烯雌酚峰面 积503246； 另取样品24.6mg，按同法测定。记录色谱图，测得 黄体酮峰面积为519397，己烯雌酚峰面积497048， 求黄体酮的百分含量。（101.8%）
仪器分析法
按信噪比10:1时的相应浓度或进样量为定量限
非仪器分析法
用已知浓度的样品确定定量限，将测定
结果计算准确度和精密度
LOQ: S/N=10
LOD: S/N=3
N
检测限与定量限的区别在于
1.检测限是以信噪比(2：1)来确定，而定量限
是以信噪比(10：1)来确定。
2.定量限规定的最低浓度应符合一定的精密度
一、容量分析法（滴定）
容量分析：将已知浓度的滴定液由滴定 管滴加到待测药物的溶液中，直到所滴 加滴定液与被测药物按化学计量反应完 全为止，然后根据滴定液的浓度和消耗 的体积，计算出被测药物的含量。
特点：灵敏度低，准确，专属性差，通 常用于原料药的含量测定。
滴定方式 直接滴定法 生成物滴定法
剩余量滴定法
同一均匀样品，经多次取样测定，所得结 果之间的接近程度。
标准偏差
S D
i 1
xi x
n 1
n
2
相对标准偏差
SD RSD 100% x
*重复性
*中间精密度 *重现性
同人、仪器、时间 同室，但不同人、仪器、时间 不同地方协同检验
（三）专属性（选择性）
在有其他成分（杂质、降解产物、辅料 等）可能存在时，该分析方法对待测 T C M 0.05 176.13 8.806(mg/m l) b 1

百分含量
1.直接滴定法
含量%=
V T 100 % W
校正系数（F）
F
T
'
C实际 C规定
C实际 T C规定
V T ' 100% 含量%= W
例
精密称取苯巴比妥钠0.2071g，依法用硝酸 银滴定液(0.1001mol/L)滴定。消耗8.02mL， 每1mL硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于25.75 mg的苯巴比妥钠。计算含量。
仅“检测限”视情况而定
含量与溶出度测定 仅不需
项目 内容
鉴别
杂质测定 限量 定量
含量测定
准确度 精密度 专属性 检测限 定量限 线性 范围 耐用性
－ － + + － － － +
－ － + + － －
－ +
+ + +
－ + + + +
+ + + － － + + +
举例 化学鉴别法-三氯化铁反应
专属性：空白试剂，应显阴性反应 检测限：减少供试品取样量 耐用性：改变试液的浓度、用量、酸碱度、 加热温度、反应时间等。
尽可能一致（要求对照品量为供试品量 100±10%）。
（2）标准曲线法（多点对照）
绘制对照液浓度－吸光度标准曲线（3-5点）
拟合回归方程，求出供试液浓度。
标准曲线
3. 计算分光光度法
多波长校正计算分光光度法
双波长分光光度法 三波长分光光度法 导数光谱法 解联立方程法
荧光分析法
（激发光谱） （发射光谱）
系统适用性试验★
用规定的对照品对仪器进行试验和调整
√ 理论板数（n） √ 分离度（R） √ 重复性（RSD） √ 拖尾因子（T）
含量测定方法 外标一点法 外标法
标准曲线法 内标法
1. 外标一点法
被测成分浓度与其峰面积成正比关系 要求供试液与对照液浓度相近
C供 A供
对照
Ｃ对
=
A对
样品
C供=
C对×A供
测得量 本底量 回收率（ %） 100% 加入量
2. 杂质定量测定的准确度

向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。 如果不能得到杂质或降解产物，可用本法测 定结果与另一成熟的方法进行比较。
数据要求： 规定的范围内，至少用9次测定结果评
价，如制备三个不同浓度样品各测三次。
（二）精密度
A对
2.标准曲线法
绘制浓度－峰面积 (峰高)标准曲线；
拟合回归方程并计算 相关系数r； A = aC + b
测定供试品峰面积 (峰高)，带入方程，求 出浓度。
3.内标法
▲选择适宜的物质作为内标物，以待测组分和内 标物的峰高比或峰面积比求算试样含量的方法 称为内标法。 ▲校正因子（f ） 其含义为：内标物峰面积与其 浓度之比（As/Cs）是对照品峰面积与其浓度之 比（AR/CR）的多少倍。
激发波长 发射波长
特点：灵敏度较紫外高、选择性好 (10-10～10-12 g/mL)； 应在低浓度下进行；
干扰因素较多，须进行空白校正；
能产生荧光的物质较少，可采用荧光 衍生化处理。
思考：物质结构产生荧光的条件？
含量测定原理
当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等 条件一定时，在较稀浓度范围内药物的荧光 强度与溶液中该物质的浓度成正比。 荧光强度∝浓度
仪器分析法
色谱法：按信噪比（S/N）3:1或2:1时的相 应浓度或进样量为检测限。 分光光度法：用空白样品进行分析，求得方 法背景响应值的标准偏差S空。
LOD C样 A样 3S空
（五）定量限 LOQ
样品中被测组分能被定量测定的最低量
（应达到一定的准确度和精密度）。
常用%、ppm、ppb表示
测定λ处吸收度，以该物质在规定条件
下的吸收系数计算。
1% A E1cm c l
√
C（g/ml）
A
% E1 1cm L 100
含量％＝
×100％
例
盐酸氯丙嗪含量测定:精密称取0.2368g，臵500ml量 瓶中，加盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密 量取续滤液1ml，臵100ml量瓶中，加同一溶剂稀释 至刻度，摇匀，在254nm波长处测得吸收度为0.435， 1% 按 E为 915计算，求其百分含量。 1cm