PCR引物设计方法和原理 PPT课件
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
PCR引物设计方法和原理
一、引物设计的目的
获得目标片段 DNA测序 基因克隆 来自百度文库外转录 突变 探针设计 分子标记
二、引物设计的类型
常规PCR引物 PCR同源引物和简并引物 探针
引物设计的步骤
下载DNA模板或蛋白质序列 进行同源比较，找到保守同源序列 设计引物
四、PCR引物设计的原则
∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能 (internal stability, 用∆G 值反映) :选用3’端∆G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的引物
引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值 :超过 4.5kcal/mol易导致产生引物二聚体带，并且降 低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行
引物的修饰 :一般是在5’端增加酶切位点
Breslauer,邻近法的相邻核苷酸的动 力学数值(自由能)来预测双链稳定 性
五、简并引物的设计
五、同源引物设计
六、网络免费在线引物设计软件
六、引物设计常用商业软件包
七、Primer Premier和Oligo引物软件
使用方法
常有引物设计软件的引物的自动搜索和评价分析
四、PCR引物设计的原则
引物长度（primer length）: 18-27 bp GC钳(GC clamp}: 引物3’端出现3 个以上的连
续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机 率增加 3’末端碱基（3’End Sequence）: ＧＣＴ Tm 值(melting temperature) ：52~60℃ GC 含量（composition） ：40-60%
软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是
引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做 到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功 能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的 结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以 “Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次， 其他软件如“Vector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和 “Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十 分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础 上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件的最佳搭 配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier” 进行自动搜索，“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计 出成功率很高的引物。
一、引物设计的目的
获得目标片段 DNA测序 基因克隆 来自百度文库外转录 突变 探针设计 分子标记
二、引物设计的类型
常规PCR引物 PCR同源引物和简并引物 探针
引物设计的步骤
下载DNA模板或蛋白质序列 进行同源比较，找到保守同源序列 设计引物
四、PCR引物设计的原则
∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能 (internal stability, 用∆G 值反映) :选用3’端∆G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的引物
引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值 :超过 4.5kcal/mol易导致产生引物二聚体带，并且降 低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行
引物的修饰 :一般是在5’端增加酶切位点
Breslauer,邻近法的相邻核苷酸的动 力学数值(自由能)来预测双链稳定 性
五、简并引物的设计
五、同源引物设计
六、网络免费在线引物设计软件
六、引物设计常用商业软件包
七、Primer Premier和Oligo引物软件
使用方法
常有引物设计软件的引物的自动搜索和评价分析
四、PCR引物设计的原则
引物长度（primer length）: 18-27 bp GC钳(GC clamp}: 引物3’端出现3 个以上的连
续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机 率增加 3’末端碱基（3’End Sequence）: ＧＣＴ Tm 值(melting temperature) ：52~60℃ GC 含量（composition） ：40-60%
软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是
引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做 到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功 能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的 结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以 “Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次， 其他软件如“Vector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和 “Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十 分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础 上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件的最佳搭 配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier” 进行自动搜索，“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计 出成功率很高的引物。