工业酵母菌的遗传修饰研究进展及其应用前景

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采用非自身克隆或自身克隆技术进行工 业酵母菌的遗传修饰
根据目的基因的来源和构建的酵母工程菌是
否含有外源的其他 DNA 片段, 可以将工业酵母菌 的遗传修饰分为非自身克隆和自身克隆两种技术。 4 1 非自身克隆技术 通过非自身克隆技术对工业酵母菌的遗传修 饰通常涉及到外源 DNA 片段的引入 , 主要有以下 3 种形式。
[ 8] r [ 7]
克隆到工业酵母细胞中并进行高表达都是依赖于 酵母菌质粒完成的。酵母菌质粒一般是由大肠杆 菌穿梭质粒衍生的。因此用这种技术进行遗传修 饰获得的工业酵母菌通常带有大肠杆菌 DNA 序列 和细菌抗药性标记基因。从遗传修饰获得的工业 酵母菌细胞中敲除外源的大肠杆菌 DNA 序列和细 菌抗药性标记基因是商业化应用遗传修饰工业酵 母菌必需要解决的问题。 4 1 3 非自身 DNA 的整合破坏 即将质粒插入 到目标区域破坏目的基因。单一重组的整合率要 比双重组的一步基因破坏的整合率高。许多工业 酵母菌的基因破坏是通过药物抗性标记整合破坏 技术来实施的, 因而从获得的工业酵母工程菌细胞 中敲除抗药性标记基因是商业化应用这些工程菌 必需要解决的问题。 4 2 自身克隆技术 通过自身克隆技术构建的酵母工程菌中, 不但 目的基因来源于酵母菌本身, 而且不引入任何其他 的外源 DNA 片段。主要包括以下 3 种技术。 [6] 4 2 1 基因破坏自身克隆 一步基因破坏是用 一个标记基因替换一个不需要的酵母基因。通过 标记基因两端附加的同源 DNA 序列和染色体 DNA 之间的同源重 组, 用标记 基因替换了不 需要的基 因。在工业酵母菌中进行的一步基因破坏都采用 了营养缺陷标记。采用营养缺陷标记进行工业酵 母菌的一步基因破坏的优点是获得的遗传修饰的 工业酵母菌是自身克隆菌株; 基因破坏仅是失去了 一个基因的产物而没有其它的产物生成 , 若用于商 业化生产 , 也更容易被消费者接受。
收稿日期 : 2003 05 08 修回日期 : 2003 08 14
* 通讯作者 , 电子信箱 : zhangbr@ sun. im. ac. cn
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中
国 生
物
工
程
杂
志
第 23 卷
ura3 trp 1 trp 1) 。 日本 清酒 酵母 Kyokai 7 菌 株在 35 生长时必需添加 panthotenic acid, 表明它是一 株温度敏感突变 株。 Shimoi 等 分离 到与之互补 的基因 ECM 31, 将 ECM 31 克隆到 Kyokai 7 菌株中 时, 获得的转化子能在 35 、 不添加 panthotenic acid 的条件下生长。上述 3 种营养缺陷标记仅使用于 相对应的突变株的转化系统。 2 2 2 药物抗性标记 与营养缺 陷标记不同, 药 物抗性标记的优势在于不要求作为转化用的酵母 菌有任何突变, 因此, 有不少药物可作为工业酵母 遗传修饰的抗药性标记。用于工业酵母菌遗传修 饰转化系统的许多抗性标记药物是抗代谢物。例 如当使用浅蓝菌素作为选择药物时 PGKp YAP 1 的 转化 率 较 高, 而 使用 放 线菌 酮 作 为 选 择 药物 时 PGKp YAP 1 的转化率就较低。这可能是由于筛选 药物对酵母细胞的毒性作用而影响转化率。使用 药物抗性标记时常会出现背景菌落。如果筛选使 用的药物浓度低, 非转化子背景菌落增加, 转化率 也增加。反之, 提高药物浓度 , 会减少背景菌落 , 但 转化率也相应降低。要解决这个问题, 选择同时具 有多种药 物抗性的 标记是 非常有 用的 , 如 PGKp YAP 1 对浅蓝菌素和放线菌酮均有 抗性, 但对其它 药物敏感 ; 几乎所有能够在浅蓝菌素平皿上生长的 背景菌落都对放线菌酮敏感。因此很容易将对浅 蓝菌素和放线菌酮具有双重抗性的真正的转化子 与只仅有浅蓝菌素抗性的背景菌落区分开。 药物抗性标记可以是突变的酵母基因, 也可以 是载体上高表达的外源基因。当使用药物抗性筛 选转化子时, 会自发的产生药物抗性突变株。当在 遗传修饰中使用这些药物标记时, 由于转化率低, 背景药物抗性突变株就是一个问题。当药物筛选 标记是突变的酵母基因时 , 它可能与染色体上的同 源基因发生重组, 而不能有效的替换目标基因, 使 转化频率降低, 并出现药物抗性背景菌落。由于异 源基因高表达标记在酵母基因组中缺少同源序列, 因此发生错误整合的频率要比突变标记低。当使 用高表达的野生型酵母基因作为筛选标记时, 由于 标记基因发生同源重组后不能产生药物抗性, 因此 错误整合的频率也比较低。
[ 2]
利用重组整合载体将
乙酰乳酸脱
羧酶基因 与大肠杆 菌 lacZ 基因一起 整合 到酵母 rDNA 区域。利用在 rDNA 区域高频率的自发重组 特性及 lacZ 基因编码的 lacZ 编码的 3 3 半乳 糖苷酶, 通过观察 半乳糖苷酶致使细胞呈蓝颜色来筛
[ 3]
选不需要的 DNA 序列已被敲出的转化子。 GALp GIN 11 反向选择技术 GALp GIN 11 反选择标记包括可诱导高表达启 动子 GALp 和生长抑制序列 GIN 11。当生长抑制处 于阻遏状态时, 细胞能正常生长 , 但当生长抑制基 因受到诱导高表达时 , 含有标记基因的细胞无法生 长, 而丢失标记基因的细胞则能够生长。该反选择 标记的主要优点在于不再要求受体菌具有隐性突 变。利用 GALp GIN 11 反选择技术可以得到自身克 隆工业酵母工程菌。
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2 1
用于工业酵母菌遗传修饰的转化系统
载 体 在工业酵母菌的遗传修饰中使用的载体有酵
母菌整合载体 ( YIp) 、 酵母菌着丝粒载体 ( YCp) 和酵 母菌附加体质粒载体 YEp。 YCp 和 YEp 载体可以 在工业 酵母 细胞 中 复制 , 转 化 率比 YIp 载体 高。 YIp 载体转化时必须要整合到染色体上, 因此转化 率低 , 但转化子的遗传稳定性高。一些选择标记的 转化率只在 YCp 或 YEp 载体上 检验过, 进一步用 YIp 载体进行这些选择标记的转化实验, 对于工业 酵母菌的遗传修饰是很有用的。 2 2 选择标记 2 2 1 营养缺陷标记 由于工业酵母菌是二倍体
+
而来的。但经过单倍体分离、 诱变处理后, 使得实 验室酵母菌具有了以下特征: ( 1) 通常是单倍体 , 具 有 a 或 交配型; ( 2) 具同源基因型 ; ( 3) 二倍体化 时具有生孢能力; ( 4) 具有营养缺陷标记 , 如 leu 2、 lys 2、 ura 3、 his 3、 met 15、 trp 1 等。实验室酵母菌的上 述特征是进行酵母菌遗传学、 分子生物学及基因克 隆和表达研究所必需的。而工业酵母菌的特征是:
转化和一步插入法将需要的酵母基因整合到染色 体上。酵母基因与带有抗药性标记基因的复制型 质粒一起共转化, 当需要的目的基因插入到染色体 上后, 在选择培养基上筛选已丢失质粒的转化子。 采用共转化进行目的基因插入的频率很低。一步 插入是将一个需要的基因与一个酵母标记基因一 起直接插入。Gasent Ramirez 等 将来源于酿酒酵 母菌的编码 半乳糖苷酶的 MEL 1 基因插入到工 业酿酒酵母菌的 ILV2 基因的一个等位基因 SMR 1 ( 即 sulfometuron methyl 抗性基 因 ) 的 相邻位 点上。 由于许多工业酵母菌株缺失 MEL 1 活性 , 因此将酿 酒酵母 MEL 1 基因克隆进不携带该基因的工业酵 母菌中 , 获得的工业酵母工程菌就能发酵蜜二糖, 这对发酵底物的充分利用有用。Omura 等( 1995) 将 来源于酿酒酵母菌的 GAPp MET 25 基 因插入到工 业酿酒酵母的带有 CUP1 标记的 rDNA 区域中, 成 功地获得硫化氢含量明显减少的工业酿酒酵母工 程菌。由于在酵母基因插入过程中没有异源 DNA 参与 , 因此获得的遗传修饰的工业酵母菌属于自身 克隆的工程菌。 4 2 3 通过酵母基因替换进行自身克隆
酵母菌与人类的关系源远流长 , 早在八千年 前, 人们就会利用酵母菌来制作面包、 酿造葡萄酒、 啤酒和清酒等。到 20 世纪末 , 酵母菌已作为一种 模式生物在生物化学、 遗传学和分子生物学研究等 方面担任了重要的角色。自从 1978 年建立酵母菌 遗传转化技术以来, 酵母菌已成为生产异源蛋白及 其生物学分析方面最有用的真核微生物。酵母菌 的生物学研究取得了巨大的进展, 1996 年完成了酵 母菌全基因组序列的测定。已建立了相关的数据 库, 如啤酒酵母基因组数据库 ( SGD) , 酵母蛋白质 组数据库( YPD) 等 , 这些数据库容纳了有关酵母菌 的 6000 多个基因及其蛋白质功能、 结构和相互间 的关系等大量信息。目前已有不少可用于食品和 酿造工业的遗传修饰的酵母工程菌问世 , 本文简要 地概述了工业酵母菌的遗传修饰研究进展, 并对其 应用前景作了分析。
[ 1]
选转化子 , 使用选择标记是十分必要的。但将这些 含有大肠杆菌抗生素抗性标记和酵母菌抗药性标 记的工业酵母重组菌用于食品和酿造工业, 其安全 性问题必需考虑。因此, 敲除工业酵母重组菌细胞 内不需要的基因是商业化使用这些工业酵母重组 菌必须要解决的问题。敲除基因的筛选被称为反 选择。目前用于敲除工业酵母重组菌细胞内不需 要的基因的反向选择技术有以下三种。 3 1 ura3 5 FOA 反向选择技术 属于这一种 反选择 技术还包 括 LYS 2, CAN 1, CY H 2, GAP 1, MET 15 和 TRP 等标记 基因, 使用这 些反选择标记时要求受体菌的相应基因是隐性突 变。目前只有 URA 3 标记基因已用于工业酵母菌 的遗传修饰体系, 其他几种反选择标记仅用于实验 室酵母菌 , 还未在工业酵 母菌遗传修饰 体系中应 用。 3 2 颜色指示和 rDNA 重组反向选择技术 Fujii 等
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工业酵母遗传工程菌细胞内不需要的基 因的敲除
在进行工业酵母菌的遗传修饰时, 为了有效筛
第 10 期
郭雪娜 等 : 工业酵母菌的遗传修饰研究进展及其应用前景
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பைடு நூலகம்