矮牵牛花香基因BSMT3的cDNA克隆与表达特征分析

应用与环境生物学报2007,13(2):176~179Chi n J App lEnvi ron B i o l=ISSN1006-687X2007-04-25矮牵牛花香基因BS MT3的c DNA克隆与表达特征分析喻麟淳泽1张海英杨涛王立洪刘世贵龙章富*(四川大学生命科学学院/生物资源与生态环境教育部重点实验室成都610064)(1中国科学院成都生物研究所成都610041)摘要以矮牵牛花瓣总RNA为模板,RT-PCR方法克隆得到其BS M T cDNA,全长1100bp,编码357aa,与已有报道phBS M T1(G enB ank N o.AA0501)和phBS MT2(AAO45013)的同源性分别达到97.76%和98.6%,该序列在G en-Bank登录号为DQ494491,命名为phBS MT3.构建的BS M T3cDNA的原核表达质粒p GBS M T转化BL21(DE3)E.co li,获得的重组菌株经0.01m o l/L IPTG诱导后得到正确表达的G S T-BS M T融合蛋白带,以纯化的重组表达蛋白免疫家兔获得其兔抗免疫血清.免疫组化研究结果证实,矮牵牛花香基因BS M T在花瓣、花管中的表达量较其它组织的表达量高.图5参24关键词矮牵牛;BS M T;c DNA;克隆;表达CLC Q78:Q946.8c DNA C loni ng and Expression Characteristi cs ofFloral Scent Gene BS M T3of Pet uni a hybri daYU Lin,C HUN Ze1,Z HANG H a i y i n g,YANG Tao,WANG L i h ong,L I U Shigu i&LONG Zhang fu* (K e y Labora tory of B io-R esource and E co-environm e n t,M i n istry of Edu c a tion,Colle g e o f L i fe S cie n ces,S ic huan Universit y,C hengdu610064,Ch i na)(1Chengdu Instit u te of B iology,Ch i ne se A c ad e my of Sc i ences,Ch engdu610041,Ch i na)Abstract A ne w cDNA(G enBank DQ494491)was cloned from P etunia hybr i da by RT-PCR usi ng the tota lRNA o f its peta ls as te m plate.T he sequence w as1100bp i n leng t h and encoded a m ature peptide w ith357a m i no acids.T his c DNA nam ed as phBS M T3s hared97.76%and98.6%homo log i es to phBS M T1(AAO4501)and phBS M T2(AAO45013)reported for P.hy-brida.T he recomb i nant expressi on stra i n,p G BS M T/BL21,w as constructed by s ub-cloni ng the cDNA unde r the pro m oter of vector p GEX4T-1and the identifi ed reco m b i nant plas m id p G BS M T was transfor m ed i n t o BL21(DE3)E.coli.T his stra i n w as expressed by the induction of0.01m ol/L IPTG,and the f usi on expression product GST-BS M T w as purified and used as t he an-ti gen to i m mun ize rabbits i n order t o prepare target po l yc l onal anti body.T he results of i m muno-h i stochem ical analyses show ed that the BS MT3gene w as expressed large l y i n the pe tals and tubes of P.hy bri da when compared w ith other tissues,such as l eaves,ste m s and ca l yces.F i g5,R e f24K eyword s P etun i a hybr i da;BS M T3;cDNA;c l on i ng;expressi onCLC Q78:Q946.8天然或人工合成的花香成分已广泛用于食品、化妆品、饲料,但花香成分与酶的催化作用联系起来的研究目前较少[1].花香挥发物首次与酶一并分析研究的植物是山子草属植物仙女扇(C lark i a bre w eri)[2,3].安息香酸甲酯和水杨酸甲酯是花香的常见成分[4],如矮牵牛花(Petunia hybr i da)释放安息香酸甲酯[1],烟草释放水杨酸甲酯和安息香酸甲酯[5].据本文作者从G enBank搜索,与花香形成有关的甲基转移酶已登记的植物种类达40余种,涉及的酶类主要有苯甲醇乙酰基转移酶(acety-l Co A:benzy lalcoho l ace t y ltransfe rase,BEAT)[6,7]、水杨酸羧甲基转移酶(S-adenosy-l L-m ethioni ne:sali cy lic aci d m ethy ltrans-ferase,S AMT)[7~9]、安息香酸羧甲基转移酶(benzo ic ac i d ca r-boxy l me t hy ltransferase,B AM T)[10,11]、苯甲醇苯乙酰基转移酶(benzy l alcoho l benzoy l transferase,BEBT)[12]、安息香酸水杨收稿日期:2006-10-10接受日期:2006-12-31*通讯作者C orres pond i ng author(E-m ai:l L zf0028@163.co m)酸羧甲基转移酶(S-adenosy-l L-m eth i oni ne:benzo i c acid/sa licy-l ic ac i d carboxy l m ethy ltransferase,BS M T)[13]、芳樟醇合酶(S-li naloo l syn t hase,L IS)[14].矮牵牛常作为研究花青素、类黄酮的生物合成、花的发育和花香物质的模式植物,其花香主要成分)))安息香酸甲酯的生物合成由BS M T以S-adenosy-L-m e-thion i ne(S AM)实现转甲基使羧基变为羧甲基[5,15].N egre等(2003)报道了矮牵牛BS M T1和BS MT2两个cDNA序列,其研究还发现BS M T的基因表达受植物激素乙烯的抑制[13].本文则报道新的矮牵牛花BS M T cDNA序列、原核表达、抗体制备及其表达定位的研究结果.1材料与方法1.1试验材料及主要试剂矮牵牛(P et unia hybrida,2n=14)栽培于四川大学室内. O ne S tep RNA PCR K it、p M D18-T连接试剂盒、DEPC、各种限制性内切酶均购自T aK aR a公司;总RNA提取试剂盒购自上海华舜生物公司;DNA片段回收试剂盒购自M B I公司;原核表达载体p GEX4T-1购自Phar m ac i a公司,大肠杆菌DH5A、BL21 (DE3)由本室保存.异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自P romega公司;丙烯酰胺、N,N c亚甲双丙烯酰胺购自Borhr i ng er M annhe i m公司;N,N,N c,N c-四甲基乙二胺(TE M ED)、工具酶、T4DNA连接酶等购自T a K a R a公司.Bu l k G ST purifica ti on m odules购自Am ersha m Phar m acia B i otech公司.辣根过氧化物酶联羊抗兔Ig G血清购自华美生物工程公司.1.2方法1.2.1矮牵牛花香基因BS M T的RT-PCR矮牵牛花瓣总RNA的抽提参照总RNA提取试剂盒的使用说明书进行.参照报道[13]的序列进行引物设计.上游引物P1(5c-CGATCT-GAATTCATGGAAGTTGTTG-3c)和下游引物P2(5c-cgcg tcgaccg ttcttaatcctcctcag-3c),按T a K a R a公司的O ne Step RNA PCR K it使用说明书.在200L L DEPC处理的薄壁PCR EP管中加入10@O ne Step RNA PCR Buffer5L L,25mmo l/L M gC l210L L,10mm o l/L d NTP5L L,RN ase Inh i bito r(40u-n its/L L)1L L,AM V RT ase X L1L L,AM V-O pti m ized T aq1 L L,BS M T上游引物P1和下游引物P2各1L L(15mm o l/L),矮牵牛花总RNA2L L,RN ase F ree d H2O23L L.扩增条件如下:50e30m i n,94e2m i n,然后94e1m i n、60e30s、72 e1m i n15s共35个循环,然后72e延伸10m in.切下RT-PCR产物特异带,按M B I DNA Ex tracti on K it方法回收c DNA,并与p M D18-T载体连接、转化DH5A E.coli,重组质粒的筛选参照Sathe等(1991)的方法[16]进行.显阳性的重组子(pB-S M T)送上海基康生物工程公司测序.测序结果采用DNAm an、B l ast等进行分析.1.2.2原核表达质粒的构建与表达E co RⅠ+SalⅠ双酶切pBS M T质粒和p G EX4T-1,分别胶回收目标片断,在T4DNA 连接酶、16e下连接过夜,转化DH5A E.coli,经菌落PCR和质粒酶切鉴定后,得到原核表达阳性菌株p G BS M T.将筛选出的p GBS MT质粒转化到BL21(DE3),将含重组质粒菌落pGB-S M T/BL21(DE3)接种于2mL LA(含100g/L氨苄青霉素的LB)培养过夜.取100L L转接到5mL新鲜LA培养液,37e 200r/m in培养4h后,取2mL培养液到无菌试管并添加终浓度为1mm ol/L的I PTG进行诱导表达,余液3mL作为未诱导对照;37e200r/m i n继续培养3h后,12000r/m i n30s离心收集菌体.原核表达蛋白样品于10%SD S-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝R250染色.1.2.3G ST-BS M T融合蛋白回收按原核诱导表达方法制备样品,经包涵体纯化、变性与复性,复性蛋白液采用Phar m a-cia公司Bu l k G S T P urifica ti on M odule回收融合蛋白,SD S-PAGE电泳检测回收蛋白纯度.1.2.4兔高免血清制备按2mg/kg家兔剂量皮下多点注射免疫日本大耳白兔,15d后减半剂量加强免疫两次,耳静脉取血EL ISA法测定兔高免血清效价,效价合格后在免疫家兔颈动脉取血分离血清,-20e保存.1.2.5不同组织的免疫组织化学采用制备的家兔BS MT 多抗作为一抗,对矮牵牛的组织切片进行免疫组化分析,方法参照P i m enta等(1998)[17].2结果与分析2.1矮牵牛花香基因BS MT的克隆与序列分析以矮牵牛花瓣的总RNA为模板,克隆得到其花香基因BS M T c DNA,其编码框(ORF)全长1074,编码357氨基酸残基(图1).与已知的植物花香基因c DNA序列相比较,结果(图2)发现与矮牵牛BS M T登记序列(AAO45012、AAO45013)[13]分别有8aa和5aa的氨基酸残基的差异,同源性分别为97.76%和98.60%;该c DNA序列在G enBank的登录号为DQ494491.图1BS M T3基因cDNA序列和推导的蛋白质序列Fi g.1c DNA nu cleoti de sequen ce and deduced a m i no aci d sequen ce of BS M T32.2矮牵牛BS MT原核表达从图3结果可以看出,矮牵牛花香基因BS M T c DNA正确插入了原核表达载体pGEX4T-1,重组表达质粒质粒命名为p GB-S MT;转化BL21(DE3)得到的表达菌株命名为p GBS MT/BL21,1772期喻麟等:矮牵牛花香基因BS M T3的c DNA克隆与表达特征分析经IPTG 诱导后的SDS -PAGE 电泳结果(图4)表明得到了正确表达,表达的融合蛋白分子量与预期大小66.6@103基本一致(Lane 4,L ane 6),含空载体p G E X 4T -1转化菌p GEX 4T-1/BL 21诱导表达蛋白(Lane 2)的分子量与预期的26@103一致.2.3 矮牵牛BS MT 在不同组织的免疫定位从图5可以看出,矮牵牛花香基因BS M T 在根、茎、叶、花萼中均无表达产物,而在花瓣和花管中有BS M T 表达,表达产物主要集中在细胞质.图2 矮牵牛BSMT3与已有报道的蛋白序列比较Fi g .2 C o mp aris on of the ne w BSM T c DNA w it h ot h ers reported f or P.hybri da i n a m i no aci dsAAO45012:P.hybri da BSM T1;AAO45013:P.hybri da BS M T2图3 矮牵牛BS M T 原核表达重组质粒的酶切鉴定F i g .3 Enzy m atic i den tification of t he reco mb i n ant plas m idfor prok aryo expression of P.hybri da BS MT3图4 重组质粒原核表达产物SDS -PAGE (10%Gel)Fi g .4 SDS -PAGE of prokaryoti c produ cts of t h e exp res s i on of pgBSM T (10%Gel)图5 BSM T 基因在矮牵牛不同组织的表达定位F i g .5 Iden tificati on for BSM T gene express i on i n d i ff eren t tiss ues of P.hybrida178 应用与环境生物学报 Chi n J App lEnvi ron B i o l 13卷3讨论植物花香具有重要的生物学意义,但目前对植物花香的研究还不够深入,且集中在花香气成分的分析与提取以及人工合成,而对花香的生物合成研究相对较少[18].参与植物花香形成的酶类基因结构解析研究的报道近年来逐渐增多,仅2005年G enBank登记花香形成相关基因的植物种类就达30余种.随着植物花香生物合成机理的研究发展,植物花香的生物合成将成为新的研究热点.高丽萍等(2001)报道茉莉花香气成分除萜烯醇和芳香醇等醇系香气外,主要决定茉莉花特征香气的还有乙酸苄酯、苯甲酸甲酯、邻氨基苯甲酸甲酯等酯类化合物,但酯类香气化合物的合成途径及其酶学却少有研究.他们研究发现,在茉莉花开放过程中,苯丙氨酸解氨酶在花初开时(20:00)活性有所提高;非特异性酯酶同工酶谱带显示酯酶与香气释放有关[19].M ah m oud和Croteau等(2001)应用薄荷呋喃合成酶(m entho f uran synthase,M FS)的反义基因进行转基因,获得的转基因植物的薄荷醇含量增加[20].L e w i nsohn等(2001)将C l arkia bre weri的S-芳樟醇合酶基因(S-li na l oo l synthase,LIS)在番茄果实中实现了特异超表达,转基因番茄果实中S-芳樟醇比对照高123~833倍,其它类萜含量没有观察到明显变化[21].V erbe rne等(2000)在质体中超表达编码细菌ICS和IPL酶基因,转基因烟草植株与野生型植株相比,水杨酸含量高出1000倍,相关防御基因持续组成性表达,抵抗病毒和真菌的能力明显提高,但植株其它性状均正常[22].目前,植物次生代谢基因工程最大的困难是我们对植物次生代谢途径及其调控了解不多,仅鉴定和克隆了少数几个基因[23].未来研究的一项任务是探明植物次生代谢途径,包括次生代谢途径的中间产物和终产物的来龙去脉、参与各步反应的酶及其基因的表达与调控、次生代谢产物合成的细胞分区、定位和转运以及各代谢途径之间的相互联系等,有效地确定代谢基因工程的靶标[24].R eferences1Verdonk J C,H ari ng M A,van Tunen AJ,S c huuri nk RC.ODORANT1 regu l ates fragrance b i osynthes i s i n petun ia flo w ers.P l an t Cell,2005,17(5):1612~16242Ragu s o RA,Pichers ky E.Floral vol atiles fro m C larki a bre w e ri and C.conc i nna(Onagraceae)recent evol u tion of fl oral scent and moth polli na-ti on.P lant SystE vol,1995,194(1~2):55~673P i chersky E,Ragu s o RA,Le w ins ohn E,C roteau R.F l oral scent produc-ti on i n Clarkia(Onagraceae)Ⅰ:l ocali zation and devel opm entalm odula-ti on of m onoterpene e m i ss i on and li nal ool s ynthase acti vit y.P l an t P hysiol,1994,106(4):1533~15404Dobson H.F l oral Vol atiles i n Insect B i ol ogy:Insect-Plant I n teracti on s.B oca 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