第八章 有机酸

丙酮酸羧化酶：CO2 的固定速度直接影响柠檬酸 的合成，黑曲霉中丙酮酸羧化酶与其它真核生物的 丙酮酸羧化酶相比，不受乙酰CoA的影响，而受酮戊二酸的抑制，所以它很少受到调节。
柠檬酸合成酶：该酶过去被看作是一个受调节的 酶，现在认为该酶的作用主要取决于底物乙酰CoA和 草酰乙酸的浓度，不存在重要的调节作用。
1982年的统计，全世界的乳酸产量为28千 吨左右，其中：
50％用于食品工业，作为酸化剂和防腐剂
20％用于生产L-硬酯酰乳酸酯 其余用于医药、制革、纺织等
二、乳酸的生物合成途径
（一）同型乳酸发酵
即经EMP途径产生的丙酮酸，以NADH2为供氢体还 原形成乳酸，此过程1分子葡萄糖生成2分子乳酸，理 论转化率为100％。
苹果酸：用于医药和食品工业。
丁烯二酸：丁烯二酸的金属盐类可用于某些工
业用剂，如除垢剂、润滑剂等。
衣康酸：合成树脂或在工业上用作除垢剂等。 顺-乌头酸：用于有机合成、酸化防腐剂及树 脂合成，是柠檬酸发酵的副产品。 五倍子酸：用于医药和印染、鞣革、照相等工
业。
有不少的有机酸可以用化学合成法生产，而 且成本只有发酵法的1/2～1/3，但担心化学合成 的物质有潜在的危害，食用的有机酸趋向于用发 酵法生产。
理论转化率=
（12×6 ＋8×1＋ 16×7）×5 （12×6 ＋12×1＋ 16×6）×6
= 88.9
由EMP途径合成柠檬酸的代谢途径
淀粉
葡萄糖
6-磷酸果糖
1,6-二磷酸果糖
葡萄糖
HMP
3-磷酸甘油醛
ED
葡萄糖
3-磷酸甘油醛
磷酸烯醇式丙酮酸
丙酮酸 CO2 乙酰CoA 草酰乙酸 柠檬酸
CO2
乙酰CoA 草酰乙酸 乙酸
4-磷酸赤藓糖
3-磷酸甘油醛 7-磷酸景天庚糖
乙酰磷酸
乙醇 乙酸
5-磷酸木酮糖
5-磷酸核糖
5-磷酸核酮糖
5-磷酸木酮糖
2 3-磷酸甘油醛
2 乙酰磷酸
2 乳酸
2 乙酸
2C6H12O6+5ADP+5Pi
2CH3CHOHCOOH+3CH3COOH+5ATP
2CH3CHOHCOOH
理论转化率＝
2C6H12O6
1917年Currie使用黑曲霉浅盘发酵生产柠檬酸。
1938年Perquin和1942年Karrow进行了柠檬酸的深层 发酵研究。
到上世纪50年代柠檬酸的生产绝大部分
以发酵法取代了提取法。
2004年全球柠檬酸产量约120万吨，欧盟
和美国为最大消费市场。
柠檬酸的消费领域： 饮料行业占40～45％ 食品添加剂等占15～20％ 洗涤剂占20～30％
第一节 柠檬酸发酵
一、概述
二、柠檬酸的生产菌种 三、柠檬酸的深层发酵工艺
四、柠檬酸发酵的条件
五、柠檬酸的合成途径和调节
六、柠檬酸的提取
一、概述
柠檬酸1784年由Scheels氏发现。 1893年前，主要用柑橘、菠萝、柠檬等果实提取 柠檬酸。 1893年以后，Wehmer发现青霉可以生成柠檬酸。
由EMP途径合成柠檬酸
C6H12O6＋1.5O2＋11ADP＋11Pi C6H8O7＋2H2O＋11ATP
12×6 ＋8 ×1＋ 16×7 12×6 ＋12×1＋ 16×6
理论转化率=
=106.7
由HMP途径合成柠檬酸
6C6H12O6＋13.5O2＋91ADP＋91Pi 5C6H8O7＋16H2O＋6CO2＋ 91ATP
成熟的发酵液
四、柠檬酸发酵的条件
(一)营养条件
1、碳源：各种含淀粉的原料、淀粉水解物、葡萄糖 蜜、蔗糖和甜菜糖蜜等都可作为碳源，我国以薯干 粉为原料。一些新菌株采用纯淀粉，浓度可提高至 18～22％。 2、氮源：最适为0.3～0.4％，薯干等原料含有氮， 可不必添加。
3、微量元素：1940年以来对微量元素进行了广泛的 研究，Cu2、Mn2、Fe3、Zn2、Mo2等为高产所必需， 需要量仅在mgkg级，过量可能造成毒害。 微量元素中Fe3，Mn2，Cu2 三种元素对柠檬酸 发酵的影响最为显著，Fe3和Mn2浓度高时抑制柠檬 酸的合成，而Cu2对它们有拮抗作用，但高浓度Cu2 对柠檬酸的合成也有毒害作用。
EMP与HMP的比率
葡萄糖发酵合成柠檬酸时，HMP途径的柠檬酸理 论转化率要小于EMP，因此提高EMP途径的比例有利 于柠檬酸的合成。 黑曲霉生长时，这两个途径的比率是2∶1，而 生成柠檬酸时为4∶1，即以EMP占优势。 据认为锰的缺乏可以降低HMP途径和三羧酸循环 中各种酶的活性。
六、柠檬酸提取
第八章 有机酸发酵
第一节 第二节 柠檬酸发酵 乳酸发酵
微生物产生的有机酸种类很多，迄今已 知约70种，但工业生产的品种还较少。 细菌产生的有机酸有：乙酸、丙酮酸、 丙酸、乳酸、琥珀酸、2-酮基-L-古龙酸、 -酮戊二酸、二氨基庚二酸、聚--羟基丁 酸等。
真菌是有机酸的主要产生菌，有些品种已大规 模发酵生产，主要有： 柠檬酸：柠檬酸在化工、医药、食品等方面有广 泛用途，而且是一种很好的缓冲剂，尤其是在清凉饮 料、果汁、果酱、果冻、糖果等食品中，不可缺少的 酸味剂。 葡萄糖酸：葡萄糖酸的钙、钠、铵、铁等盐类广 泛地用于医药、食品、纺织、皮革等工业上。
溶氧对黑曲霉耗氧和产柠檬酸速率的影响
溶氧分压（Pa） 15900 耗氧速率（mol/min） 106 产酸速率（mol/min） 32
13200
9350 8000
102
90 －
28
23 21
5000
3900 3200
85
－ 74
14
9 3
1800
800 500
63
57 43
0
0 0
五、柠檬酸的合成途径和调节
柠檬酸的提取常采用钙盐法，工艺过程 如下：
发酵液预处理、过滤
清液
洗涤菌丝
碳酸钙
中和
洗涤水
菌丝
见下页
碳酸钙
中和 柠檬酸钙 酸解、脱色（浓硫酸、活性炭） 硫酸钙、活性炭 柠檬酸液 离子交换 洗涤
洗涤水
废液
真空浓缩
母液 结晶
硫酸钙、活性炭
干燥、成品乳酸的生产菌种 四、乳酸的发酵条件 五、乳酸的发酵方法
医药占5％
其它占10％
欧洲是柠檬酸的第二大生产地，产量约30万吨。 美国柠檬酸年产量约25万吨。
我国是柠檬酸的第一大生产国，估计年产约50万 吨。
但在1970年时，我国的柠檬酸年产仅有130吨。
二、柠檬酸的生产菌种
柠檬酸位于三羧酸循环的起始点，几乎所有微 生物都能合成柠檬酸，但能大量积累柠檬酸，并将 其分泌到培养基中的微生物不多。
异柠檬酸裂解酶：该酶在黑曲霉中存在，并有乙 醛酸循环，但在糖质原料发酵时异柠檬酸裂解活性 丧失。 以上几种酶的活性，关系到已积累的柠檬酸是 否被分解，还有更重要的是如何保持EMP和三羧酸循 环不中断，柠檬酸不断被合成。
磷酸果糖激酶：是EMP途径的关键酶，它受柠檬 酸和ATP的抑制，但它可被AMP、无机磷酸盐和NH4+ 所激活，NH4＋可有效地解除磷酸果糖激酶受柠檬酸 和ATP的抑制。
异柠檬酸脱氢酶：该酶活性低，有利于柠檬酸的 积累。 柠檬酸抑制异柠檬酸脱氢酶的活性，一旦柠檬 酸积累到一定水平，它就能抑制它自身的进一步分 解。 -酮戊二酸脱氢酶：现已发现在柠檬酸积累时， 真菌中缺乏-酮戊二酸脱氢酶或者是活性非常低。 同时还发现，-酮戊二酸脱氢酶的合成是明显 地处于葡萄糖与NH4＋的负控制下。
琥珀酸
异柠檬酸
异柠檬酸裂解酶
乙醛酸＋琥珀酸
柠檬酸积累的理想条件：
1、提高磷酸果糖激酶的活性 2、提高丙酮酸羧化酶的活性 3、提高柠檬酸合成酶的活性 4、抑制顺乌头酸酶的活性 5、抑制异柠檬酸脱氢酶的活性 6、抑制-酮戊二酸脱氢酶的活性 7、抑制异柠檬酸裂解酶的活性
柠檬酸合成酶系的调节：
顺乌头酸酶的活性：从理论上推测，顺乌头酸酶 失活，三羧酸循环阻断是累积柠檬酸的必要条件。 许多实验指出顺乌头酸酶活力变化与柠檬酸累 积有密切关系。例如，产酸菌株的顺乌头酸酶活力 比非产酸菌株低，产酸期比生长期低，生长在产酸 培养基上菌株的顺乌头酸酶活比生长在非产酸培养 基上的低。 添加顺乌头酸酶抑制剂可促进柠檬酸积累。 铁为顺乌头酸酶的激活剂，用亚铁氰化钾除铁， 可以握高柠檬酸产率。
六、乳酸的提取
一、概述
乳酸的正式学名是：-羟基丙酸。
乳酸广泛应用于食品，医药、皮革工业， 如饮料、糖果、肉制品、面包等；乳酸钙、乳 酸铁、乳酸钠用于医药；乳酸制的聚酯塑料用 于外科缝合线及人工假肢等。
乳酸是微生物发酵生产有机酸的第一 个产品，开始于1880年，尽管目前有化学合 成法生产乳酸，但仍然有50％的乳酸以发酵 法生产。
(二)环境条件 1、pH：pH≥5.0易形成葡萄糖酸，pH≥3.0易形成 草酸，合成柠檬酸pH要降到3以下。 2、温度：在不同发酵阶段，一般采用不同的温度 控制，在种子培养和发酵初期，以加速菌体增殖为 目的，控制较高温度(36～38℃)对黑曲霉的生长有 利。发酵产酸期以菌体的产酸代谢为主，控制34～ 36℃为佳。 3、氧：黑曲霉需要较低的氧，但是对氧的缺乏是 敏感的。
C6H12O6+2AMP+2Pi+2NAD 2CH3COCOOH+2ATP+2NADH2
CH3COCOOH+NADH2
乳酸脱氢酶
CH3CHOHCOOH+NAD
理论转化率＝
2CH3CHOHCOOH
C6H12O6
＝100％
（二）异型乳酸发酵
有两条途径，一是6-磷酸葡萄糖酸途径，产 生1分子乳酸、1分子乙醇和1分子CO2，理论转化 率为50％。二是Bifidus(双歧)途径，2分子葡萄糖 产生2分子乳酸和3分子乙酸，乳酸的理论转化率 亦为50％。