微生物细胞工程的应用

全球市场规模30亿美元，国内1亿美元， 理论上，我国干扰素市场应有100亿～ 200亿元人民币；干扰素的销售量仅为国 内理论需求量的1% 0.2ml/40ug/680元，6ml/40ug/660 长效干扰素产品——PEG化干扰素：血清 半衰期比普通干扰素制剂长三四倍，对乙 肝的临床疗效更好，上市仅两三年，其销 售额即超过了5亿美元。



固氮菌：重要固氮微生物，大多属于根瘤菌 属（Rhizobium和Bradyrzobium ），革兰 氏阴性菌，在土壤中与豆科植物共生 植物与固氮菌的相互关系：共生互利。植物 向共生细菌提供植物通过光合作用所固定的 碳，保证固氮菌的生长，细菌则向植物提供 氮。 固氮菌不仅给植物提供了大量可利用的氮源， 而且对整个地球的氮循环都发挥了不可替代 的重要作用

设计新的生物多聚体 用生物多聚体替代人工合成的多聚体 修饰已有生物多聚体以提高其物理结构特性 提高产量降低成本


黄原胶
一种高分子外多糖，革兰氏阴性嗜氧菌代谢副产物 物理化学性质非常像塑料，在极端的物理化学环境 下非常稳定，常用作稳定剂、乳化剂、加浓剂、悬 浮剂等 野生型菌有效利用葡萄糖、蔗糖、淀粉，但不能利 用乳糖。乳清是生产奶酪的废弃副产品，其中乳糖 含量达3.5-4%，含水量94-95% 通过DNA重组技术，在细菌中制造一个新的代谢途 径，利用乳清高水平地生产黄原胶。开发新的生产 途径，创造巨大经济效益的同时，最大限度地减少 污染，创造良好的社会效益。


当前的主要目标：通过现代生物技术， 研制出比自然界存在的根瘤菌能更好地 提高农作物产量的菌株，亦即提高其固 氮效率，增强形成根瘤的能力，抑制土 壤中与其竞争的菌株 其他固氮微生物：弗氏放线菌、蓝细菌， 弗氏放线菌与多种木本植物共生固氮。 蓝细菌与真菌、苔藓、厥类植物及高等 植物共生固氮，如蓝细菌与红萍共生， 成为良好的水稻肥料

表达文库的筛选：纯化目的蛋白质，制备抗体， 通过抗原-抗体的特异性结合反应，筛选表达文 库



优化基因表达的条件：获得目的基因后， 最重要的是优化基因的表达 选择最佳表达系统的标准是高纯度、高活 性、高重复性、低成本 选择原核表达系统：基因表达与调控机理 相对明了简单，进行大量生产的成本比较 低、产量高。



真菌杀虫剂
在昆虫的病原微生物中，种类最多的是 真菌，约占昆虫病原微生物的60％，数 量达到750种，主要为虫霉类和半知菌 类真菌 目前许多真菌杀虫剂都已进入大规模商 业化生产阶段



防治植物病菌的微生物
防治植物病害的微生物通过拮抗作用、 寄生作用、竞争作用及共生保护作用来 抑制植物病原微生物的生长，保护植物 少受病害的侵染 种类有细菌、放线菌、真菌、病毒及农 用抗生素(主要来源于放线菌的链霉菌属)



Biblioteka Baidu
生物除草剂
杂草是农业生产中的一个大问题，全世 界每年因杂草造成的经济损失高达200 多亿美元 杂草病原物——生物除草剂：使用杂草 的病原微生物如真菌、病毒除去杂草， 具有良好的专一性和安全性
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1.7.3 现代微生物肥料

影响植物正常发育和高产的因素


基因的组成 营养物资供应 有益微生物与有害微生物的影响。有益微生物可 以释放刺激植物生长因子，抑制有害微生物生长


生长激素 growth hormone
人生长激素可用于治疗侏儒症和促进伤 口愈合，动物生长激素加速家禽生长， 增加奶的产量 目前人和动物生长激素基因已在大肠杆 菌中得到成功表达，在医学和畜牧业领 域取得了很好的应用效果 年产值达6.25亿美元




胰岛素 insulin
最早的基因工程蛋白药物 将编码胰岛素的A链、B链基因分别克隆到质 粒载体pIAI与pIBI上，pIAI翻译产物为β－ 半乳糖苷酶与胰岛素A链的融合蛋白，pIBI 翻译产物是β－半乳糖苷酶与胰岛素B链的融 合蛋白。用溴化氰处理A、B链除去β－半乳 糖苷酶，然后用磺酸处理，得到完整的胰岛 素 目前已有多种重组胰岛素上市。


微生物降解有毒废弃物
目前全世界投入生产的化学物质有500多万 种，而且这个数字还在以每年数千种的速度 递增 传统处理方法：焚烧与化学处理，成本高， 而且会产生新的污染物质 微生物降解：安全有效、成本较低 假单胞菌：分解有毒物质的土壤微生物，分 解有毒物质，为自身的生长提供碳源




芳香族化合物的降解
生产生物小分子


维生素C（抗坏血酸）、靛蓝、氨基酸、抗 生素 以前只能通过化学处理和发酵相结合来生产 通过生物技术改变微生物的代谢途径，使微 生物产生新的酶活性，生产出新的代谢产物， 简化生产步骤，开发新的产品
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生产生物多聚体


生物多聚体即大分子，某些生物多聚体具有 独特的物理和化学性质，广泛地应用于食品 加工、制造和制药等工业 利用生物技术，可从以下4个方面进行研究 与开发
1.7 微生物细胞工程的应用


1.7.1 通过原核微生物生产商品 1.7.2 现代生物农药 1.7.3 现代微生物肥料 1.7.4 生物净化与生物废料再生 1.7.5 微生物细胞固定技术
1.7.1 通过原核微生物生产商品

将原核微生物改造成生产有用代谢产物的反应 器，生产许多重要的生物产品 细胞工程技术+基因工程技术，克隆生物产品 的编码基因，在宿主细胞中进行表达。


铁载体
铁载体：微生物合成的是一种低分子量化合 物，分泌到土壤中 作用



吸收土壤中的铁，大大降低植物根系附近的铁 含量，导致病原菌和其他有害微生物发生铁饥 饿，抑制它们生长 植物可以直接利用与铁载体结合的铁，促进植 物的生长发育

利用生物技术，改造铁载体基因，加强微生 物接种剂，促进植物生长
芳香族化合物：很多杀虫剂、除草剂及其他 化工产品的主要成分，难以降解，长期以来 一直是环境治理的一大难题 从土壤中筛选的微生物可以有效降解芳香族 化合物 降解过程如下：芳香族化合物→儿茶酚/原 儿茶酚→乙酰辅酶A与琥珀酸、丙酮酸与乙 醛





海洋浮油的清理 战争、海难等缘故，每年上万吨石油泄漏到 海洋中，给生态系统带来严重的甚至是毁灭 性的破坏 原油中所含的主要元素是碳和氢，缺少氮源 使得大部分微生物在原油中难以生存和繁殖 研究者设计生产出多种含氮源的营养物，投 放到原油污染的海面，加速微生物的繁殖及 原油的降解
干扰素 肿瘤坏死因子 interferon，IFN tumor necrosis factor，TNF
集落刺激因子
趋化因子 生长因子
colony- stimulating factor， CSF chemokines
growth factor，GF


干扰素（interferon，IFN）
1957年，英国Alick Isaacs和瑞士Jean Lindenmann， 在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时发现，病毒感 染的细胞能产生一种因子，后者作用于其他细胞，干扰病 毒的复制 哺乳动物细胞在诱导物的诱导下产生的一种特异糖蛋白， 抗病毒、免疫调节、抗增殖和诱导分化作用 抑制病毒在细胞内的增殖，加强巨噬细胞的吞噬作用和对 癌细胞的杀伤作用，临床上用于肿瘤和许多病毒病的治疗 利用大肠杆菌系统和酵母系统成功地高效表达了干扰素




生物合成黑色素
一大类吸收光的生物多聚体的总称，有效吸 收紫外线 制造太阳伞，用作塑料的阳光保护层与化妆 品的添加剂 动物、植物、真菌与细菌都能合成黑色素。 传统的提取与化学合成的方法成本高、产量 低、价格昂贵 用生物技术可以改变这一难题，同时在一定 程度上调节黑色素的性质




生产 粘性生物多聚体 ：一种强度极高而又 防水的足丝粘性蛋白，在医学特别是牙医领 域应用广泛。用生物技术改造微生物可以扩 大生产并降低成本


生产蛋白质药物
生产限制性内切酶 生产生物小分子
生产生物多聚体
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生产蛋白质药物

多肽：细胞因子 单克隆抗体
重组疫苗
分子诊断试剂

细胞因子(cytokine，CK)：由细胞（免疫
细胞、非免疫细胞）合成、分泌的具有生物 活性的低分子量蛋白质或多肽的统称。 interleukins，ILs 白细胞介素


白细胞介素（interleukin，IL）
抗肿瘤和免疫调节：促进T 细胞的生长、增 殖和分化，促进B细胞的生长和增殖，增强 杀伤性淋巴细胞的功能 临床上用于癌症的治疗 重组白细胞介素2和白细胞介素3已上市


集落刺激因子 colony stimulating



factor，CSF 促进体内白细胞的增殖，增强粒细胞的功 能，调控造血功能 临床用于治疗肿瘤病人放化疗后白细胞下 降等症状 目前已有产品上市，年产值达5.44亿美元
生产生物 可降解塑料 ：塑料在发挥重大作 用的同时，也由于它的不可降解对环境造成 巨大危害，因此，利用微生物生产生物可降 解塑料已成为世界塑料工业发展的潮流。
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1.7.2 现代生物农药

生物体产生的具有防治病、虫害和除杂草等功能的一 大类物质总称 种类：

微生物杀虫剂 农用抗生素制剂 微生物除草剂


植物激素
有些微生物合成植物激素，如生长激素， 细胞分裂素等 分离、研究这些微生物并加以改造，将会 大大提高农作物产量，具有重大的实际意 义
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1.7.4生物净化与生物废料再生



日趋严峻的挑战：如何处理、分解不断产生的大 量垃圾；如何除去过去几十年里积存在大气、土 壤、水体中的有毒物质 生物净化：利用生物除去环境中的生物垃圾和有 毒物质的过程 生物废料再生：生物垃圾是制造许多有重要经济 价值的产品的原材料。人口膨胀、食品和能源不 足的情况下，资源的充分再利用意义重大
降低成本，提高药效、产量




技术策略
目的基因的获得：基因组DNA文库，cDNA 文库，PCR扩增，化学合成法


DNA/RNA提取，酶解，转化 目的DNA的筛选：制作探针，从基因组DNA文 库或cDNA文库中筛选出目的DNA

探针制备：根据同源序列/纯化目的蛋白，测定其氨 基酸序列，推导DNA编码序列，
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生产限制性内切酶



在分子生物学的使用非常广泛，对于分子生 物学的突破性发展起了决定性的作用 现在商品化的限制性内切酶有400多种，通 过改造微生物，能大量生产各种各样的限制 性内切酶 微生物的改造从以下4个方面考虑：生产所需 最适温度、最适pH、最适培养基组分、对氧 的需求
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应用：生物农药对病虫害和杂草进行生物防治，安全 有效，有助于减少化学污染，保持生态平衡 从20世纪70年代开始，生物防治逐步受到各国政府 的高度重视，生物农药得到广泛应用


微生物杀虫剂
昆虫是地球上数量和种类最多的生物之一，有些 昆虫种类给人类生活造成了多种危害，如大规模 侵害农作物、传播人畜疾病等 传统化学杀虫剂：有效杀灭害虫，对人、动物和 整个生态系统都有很强的副作用。 早期生物杀虫剂：特异性高、可生物降解、昆虫 产生抗性较慢，但缺点是杀虫效果差、成本高 现代微生物杀虫剂：通过生物技术，克服以上缺 点，提高杀虫效果。病毒杀虫剂、细菌杀虫剂、 真菌杀虫剂与放线菌杀菌素




病毒杀虫剂
已发现的昆虫病毒有1200种，核型多角体 病毒（杀棉铃虫）、颗粒体病毒与质型多角 体病毒 重组杆状病毒：利用DNA重组技术改造杆状 病毒，获得具有杀虫效果好、宿主范围广、 适于工业化生产的重组杆状病毒




细菌杀虫剂
目前已知的昆虫病原细菌约有90种，其中 最重要的是苏云金杆菌，它能感染鳞翅目、 膜翅目、双翅目、直翅目等多种昆虫，可 以杀灭白菜粉蝶、蚊虫、甲虫、毒蛾、毛 虫等 利用DNA重组技术、定点诱变技术对苏云 金杆菌毒素蛋白进行改造，可以提高杀虫 效果，降低生产成本

从大气中固氮，为植物提供氮源；
增加铁、磷等矿质元素的吸收；

合成促进植物细胞繁殖的植物激素


固氮微生物
要维持全球的粮食产量，每年氮肥需求量 1.0×108吨以上

一半是化学肥料 另一半绝大部分是由固氮微生物提供


化学肥料：极大提高作物产量，但持续施 用化肥会导致环境污染，耗尽土壤中养分 微生物氮肥的研究与生产：经济、环境， 结合现代生物技术，重视其发展