顶头孢霉的原生质体转化
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。
二、基本原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。
共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。
三、材料及方法1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。
2.植物幼苗。
（一）细菌培养液直接浸染法操作︰（1）无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。
取自无菌试管苗。
取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。
（2）受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、睫切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下︰预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。
（3）农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6～0.8。
取OD600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600 为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/的AS；（4）侵染︰于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。
从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。
取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。
顶头孢霉菌原生质体制备技术研究
160生物技术世界 BIOTECHWORLD1 顶头孢霉菌及其原生质体简介顶头孢霉菌是典型的丝状真菌,在育种方面适合采用原生质体融合技术。
本文采用蜗牛酶处理相关菌丝体来制备原生质体,探讨蜗牛酶的浓度以及菌龄对分离原生质体数量的影响。
2 材料与方法2.1 材料2.1.1 菌株顶头孢霉菌:来自华北制药河北华民药业(发酵液筛选出菌株)2.1.2 培养基及稳定剂菌丝生长液体培养基:葡萄糖5g,蔗糖35g,玉米浆31g,(NH4)2SO4 8g,豆油5mL;灭菌前pH6.8-7.2,121℃灭菌20min。
渗透压稳定剂:0.7mol/l NaCl 2.1.3 试剂蜗牛酶:上海励瑞生物科技有限公司2.2 试验方法2.2.1 顶头孢霉菌菌丝体的培养将顶头孢霉菌菌株接种在新配制的菌丝生长液体培养基中,28℃,220r.min-1恒温摇床分别培养42h、48h、54h、60h、66h。
2.2.2 顶头孢霉菌原生质体制备将培养好的顶头孢霉菌在12000r/min下离心5min,收集菌丝,将沉淀用0.7mol/L Nacl洗涤两次;将洗涤完后5个培养时间的顶头孢霉菌分别分装于5个小离心管中,每管60mg新鲜菌丝体,向这些离心管中分别加入0.6mL浓度为1mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、7mg/mL、9mg/mL的蜗牛酶,33℃振荡培养3.5h;用G2漏斗滤去未酶解的菌丝;滤过液4000r/min离心10min,收集原生质体;所得沉淀用0.7mol/L的Nacl洗涤离心三次,用等量的0.7mol/L的Nacl悬浮原生质体,保持渗透压的稳定;同时在微镜下观察原生质体的形态并计数。
3 结果3.1 不同浓度蜗牛酶对制备原生质体的影响不同浓度蜗牛酶酶解条件下得到的原生质体如图1。
由表1和图1可见,随着蜗牛酶浓度的升高,酶解出的原生质体数一直升高,当浓度为3mg/mL时,数量最大,提高酶的浓度,原生质体量增加不显著。
因此,5mg/mL的蜗牛酶的效果最好。
真菌学及进化生物学复习
但丝状真菌与其它生物不同的是在一个共同的或(通过隔膜孔)连续的细胞质中含有多 个细胞核，这样在个别细胞核中发生的基因突变，可以被其它核中的野生型基因所掩盖，从 而使突变成为隐性的。当丝状真菌产生单核孢子或产生源于单个细胞核的菌丝分枝时，突变 基因则被周期性或间歇性地暴露于选择压力之下。这样，丝状真菌在具有单倍体生物所拥有 的进化优势的同时，也获得了双倍体生物的部分优势。这可能就是真菌在双倍体生物占优势 的真核世界中，一直保持单倍体的原因。 丝状子囊菌类（散囊菌、盘菌、核菌、腔囊菌）：存在产囊丝和子囊果 酵母目：单细胞状态存在，存在产囊丝和子囊果 酵母目的无性繁殖方式：单极芽殖、二级芽殖、多边芽殖、 古子囊菌（杂合类群）：外囊菌属、裂殖酵母属、肺炎囊菌属等
真菌是真核生物中唯一Байду номын сангаас类主要以单倍体状态存在的生物。与双倍体生物不同，单倍体 生物将其全部基因都暴露于选择压力之下。一个基因的突变，如果引起适应力的丧失或降低， 突变将会很快被消除，而如果引起适应力的增强(如对抗生素的抗性)，则突变将被保留并快 速扩增。 这会使真菌较快地适应环境的短期变化。
但缺点是单倍体生物不能积累没有即时价值的突变，即不能储存变异。双倍体生物在这 方面则具有明显的优势，其突变基因相对于野生型来说往往是隐性的，不会立即表达，因此 会被积累下来，并在有性生殖时产生不同的组合，从而可产生更多携带不同突变基因的后代， 其中某些可能获得具有优势的突变基因组合。真核世界中的生物大多数为双倍体，说明双倍 体具有进化上的优势。
【微生物学期末考试题库】经典题目简答题2
2020届微生物学期末考试经典题目题库整理1指出下列培养基各成分的作用，并指出是用来培养哪种类型的微生答案：该培养基中，甘露醇是碳源和能源物质，KH2PO、Mg2SO4 • 7H2O、NaCl、CaSO4 • 2H2O主要提供无机盐离子，CaCO3主要用于调节微生物培养过程中培养基pH值的降低，这一培养基用来培养化能异养微生物。
2、举例说明霉菌与工农业生产、医药实践、环境保护等方面的密切关系。
答案：霉菌对工农业生产、医疗实践、环境保护等有着密切的关系，例如，工业上的大量发酵产物都是通过霉菌来实现的，柠檬酸、葡萄糖酸等有机酸；淀粉酶、蛋白酶等酶制剂；青霉素、头孢霉素、灰黄霉素等抗生素；核黄素等维生素。
利用梨头霉等对甾体化合物的生物转化以生产甾体激素类似药物；以及利用霉菌在生物防治、污水处理和生物测定等方面的应用等。
在食品制造方面，霉菌可以进行酱油的酿造和干酪的制造等。
在基础理论研究方面，霉菌是良好的实验材料，如Neurospora crassa(粗糙脉孢霉)和Aspergillus nidulans(构巢曲霉)是微生物遗传研究中的常用实验材料。
大量真菌可引起工农业霉变，如食品、纺织品、皮革、木材、纸张等。
也是植物最主要的病原菌，却马铃薯晚疫病、稻瘟病和小麦锈病等。
少量的霉菌也可引起动物和人体传染病，如皮肤藓症等。
3、什么是烈性噬菌体？简述其裂解性生活史。
答案：凡是在短时间内能连续完成吸附→侵入→增殖→成熟(装配)→裂解(释放)这五个阶段而实现其繁殖的噬菌体，称之为烈性噬菌体。
裂解性生活史①吸附当噬菌体与其相应的特异宿主在水环境中发生偶尔碰撞后，如果尾丝尖端与宿主细胞表面特异性受体接触就可以触发须把卷紧的尾丝散开，随即就附着在受体上，从而把刺突、基板固着于细胞表面。
①侵入吸附后尾丝收缩，基板从尾丝中获得一个构象刺激，使尾鞘中的144个蛋白质亚基发生复杂的移位，并紧缩成原长的一半，由此把尾丝推出并插入细胞壁和膜中。
4-1.链霉菌的分子生物学
基因克隆 Gene Clone
“克隆”一词最早来源于来源于拉丁语，指的是无性繁殖。 在当今生命科学的各个领域， “克隆”一词被广泛地使 用。它不仅在词义上有名词和动词之分，而且在不同的学 科之间和不同的的研究层次上也有不同的含义。
在多细胞的高等个体水平上，例如植物与动物，人
们用克隆表示由具有相同基因型的同一物种 的两个 或多个个体组成的群体。例如，从同一受精卵分 裂而来的单卵双生子（monozygotic twins)便是属于 同一克隆。
重组质粒 转化 原生质体
筛选 30，000 多菌落，从中找到一株具 有抗菌活性的转化子 PE15-1。
PE15-1
发酵 产物分析（HPLC）
提取质粒
.
（二）. 克隆抗生素生物合成基因簇的策略
1. 克隆到标准宿主 （如变青 链霉菌） 然后检测单个基 因产物 2．产生菌阻断变株的互补 杀假丝菌素（对-氨基苯甲酸合 成酶） 放线菌素（苯氧连氮合成酶） 放线紫红素 克拉维酸 链霉素 3． 抗生素生产菌株突变克隆 4．先克隆抗性基因，然后再 探测与其连锁的其它基因 次甲霉素 土霉素 红霉素 嘌呤霉素 素产生菌中 7． 利用一种已克隆的基因片 段，探测其它菌基因库 中的同源基因 头霉素（Cephamycin） 次甲霉素 榴霉素 泰洛星（Tylosin） 抗生链霉菌 IMRU 3720 天蓝色链霉菌 A3（2） 棒状链霉菌 A TCC27064 灰色链霉菌 A TCC10137 天蓝色链霉菌 A3（2） 龟裂链霉菌 红色链霉菌 NRRL2338 白黑链霉菌 A TCC12461 弗氏链霉菌 （S.fradiae） S.Cattleya NRRL8057 天蓝色链霉菌 A3（2） 紫红链霉菌 （S.violaceoruber TU22） 灰色链霉菌 IMRU 5370
食用菌原生质体技术的研究进展_鹿桂花
tosine M ethylation within a P opulation of Newly Resynthesized Brassica napus Allopolyploids[J ].P lant Physiol ,2006,140(1):336-348.[24]M adlung A ,M asuelli R ,W ats on B ,et al.Rem odeling of DNA methyla 2tion and phenotypic and transcriptional changes in synthetic Arabidopsis allotet 2raploids [J ].P lant Physiol ,2002,129(2):733-746.[25]Salm on A ,Ainouche M L ,W endel J F.G enetic and epigenetic conse 2quences of recent hybridization and polyploidy in Spartina (P oaceae )[J ].Mol .E col .,2005,14(4):1163-1175.食用菌原生质体技术的研究进展鹿桂花,陈恒雷,吕杰,曾宪贤,张军3(新疆大学离子束生物工程中心,新疆乌鲁木齐830008)摘要:综述了食用菌原生质体再生、诱变、融合技术以及原生质体技术与其他生物技术相结合的研究进展,提出了在现有研究中存在的问题,并展望了原生质体技术的发展趋势。
关键词:食用菌;原生质体;诱变;融合中图分类号:Q813.2 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2008)01-0087-03R evie w on the Technology of Protoplast from Edible FungusLU G ui -hua ,CHE N Heng -lei ,LV Jie ,ZE NG X ian -xian ,ZH ANGJun3(I on Beam Bio -engineering Center ,X injiang University ,Urumqi 830008,China )Abstract :Protoplast technique ,method of mutation ,protoplast fusion technique and the combining of protoplast technique and other biology tech 2niques were reviewed in this paper ,the deficiencies and the tendency of the research on protoplast technique was als o generalized as well.K ey w ords :edible fungus ;protoplast ;mutation ;protoplast fusion收稿日期:2007-09-02;修回日期:2007-11-12基金项目:国家发改委高技术产业化示范工程项目资助([2004]2077)作者简介:鹿桂花(1982-),女,硕士生,从事离子束生物工程与食用菌发酵及多糖研究;3通讯作者(C orresponding author ):张军(1962-),男,博士,教授,E -mail :zhj @ 。
微生物学：真核微生物
真核微生物主要包括真菌（酵母菌、霉菌 和蕈菌）、显微藻类和原生动物。
真菌概要
真菌属真菌门，为真核微生物，与原核微生物 有本质的区别，无论在细胞结构及组成成分上 均有不同。 真菌的菌体除少数为单细胞外，多数由不分隔 或分隔的菌丝体组成。在细胞结构上它们多数 具有细胞壁、细胞膜、细胞质、具有核膜与核 仁分化的细胞核、细胞器和内含物。
菌丝分化成形状不同的雄器和藏卵器，小型配
卵孢子的形成过程
藏卵器 雄器
接合孢子（如根霉、毛霉）
由菌丝分化成两个形状相同、但性别不同 的配子囊结合而形成的有性孢子叫接合孢子。
子囊孢子（脉孢菌、红曲）：
在子囊内形成的有
性孢子即为子囊孢 子。子囊是一种囊 状结构，绝大多数 子囊菌的子囊呈长 形、棒形或圆筒形， 每个子囊内通常含 1-8个子囊孢子，颜 色也是多种多样的。
无性繁殖是指不经过两性细胞结合而直接
由菌丝分化形成孢子的过程，所产生的孢
子叫无性孢子。
常见的有孢囊孢子、分生孢子、厚垣孢子
和节孢子，此外还有游动孢子、芽孢子、
掷孢子。
孢子囊孢子（如根霉、毛霉等）
在孢子囊内形成的孢子叫孢子囊孢子。
孢子囊是由菌丝顶端细胞膨大而成，膨大部分
的下方形成隔膜与菌丝隔开，膨大细胞的原生 质分化成许多小块，每小块可发育成一个孢子。 原来膨大的细胞壁就成了孢子囊壁。下方的菌 丝叫孢子囊梗，孢子囊与孢子梗之间的隔膜是 凸起的，使孢子囊梗深入到孢子囊内部。我们 把伸入孢子囊内部的这一膨大部分叫囊轴。孢 子囊孢子成熟后，孢子囊破裂，孢子散出。
实验五 放线菌与真菌形态结构观察
实验报告课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验实验项目名称：放线菌与真菌形态结构观察学生姓名：专业：环境工程学号：同组学生姓名：指导老师：实验地点：实验日期：2018 年10月16日一、实验目的和要求1.学习并掌握放线菌(链霉菌)，真菌(酵母、霉菌)形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。
2.熟练掌握显微镜的使用。
二、实验内容和原理1.放线菌放线菌，是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物。
因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。
大多数有发达的分枝菌丝。
菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约0.5～1微米。
可分为：营养菌丝，又称基内菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝，叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝。
2.真菌[1]酵母菌：为单细胞真核生物。
呈圆形、卵形、椭圆形或柠檬型。
各体直径比细菌大几倍到几十倍。
菌落大而厚，湿润光华，颜色多为乳白色、灰白色、似细菌落。
繁殖方式包含无性繁殖(芽殖或裂殖)与有性繁殖(形成子囊与子囊孢子)。
[2]酵母菌的出芽生殖：在细胞的一端初生小突起，如芽状，逐渐增大。
细胞核一分为二，其中一个进入小突起，经细胞壁缢缩。
芽体与母细胞脱离，形成新个体。
若芽体不脱离母体而有继续生出新芽，而芽细胞聚集形成芽簇，芽簇细胞伸长呈丝状或藕节状，称做假菌丝。
[3]美兰染色法：美兰是一种无毒性染料，氧化型呈蓝色，还原型呈无色。
活细胞具有较强还原能力，使美兰由蓝色变成无色。
染色后，酵母活细胞无色，死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞呈蓝色或淡蓝色。
[4]酵母菌肝糖粒碘液染色：肝糖粒是酵母细胞的内含物，属于碳源及能源性贮藏物。
用碘液染色，菌体呈淡黄色，肝糖粒呈红褐色。
[5]霉菌：由菌丝体构成，分为基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝长到一定阶段分化产生繁殖菌丝。
由繁殖菌丝产生孢子。
菌丝和孢子的宽度比细菌和放线菌大几倍到几十倍。
制片时滴加乳酚油，防止干燥，可保持菌丝体原形。
霉菌生长发育和代谢途径的分子机制
霉菌生长发育和代谢途径的分子机制霉菌是一类具有多样化代谢途径的真核生物，它们可以在许多环境中生长繁殖并产生大量的有用化合物。
霉菌的代谢途径非常复杂，包括碳代谢、脂肪代谢、氨基酸代谢、有机酸代谢、二次代谢等多个途径。
这些代谢途径对于霉菌的生长发育和产生次生代谢产物都发挥着重要作用。
本文将讨论霉菌代谢途径的分子机制，并深入探讨霉菌生长发育的分子机制。
1. 霉菌生长发育的分子机制霉菌的生长发育主要涉及到四个方面，包括细胞极性、细胞分裂、营养吸收以及激素信号传导。
细胞极性是指细胞形态的建立与维持，霉菌细胞的极性化主要是通过Cdc42 GTPase等蛋白质的参与实现的。
Cdc42 GTPase可以与效应蛋白For3等结合，调控细胞极性形成。
细胞分裂是指霉菌细胞的复制与分裂，细胞分裂依赖于多种酶的调节，如Myc1和Sid2等蛋白质参与。
营养吸收则是细胞生长所必需的过程，霉菌通过分泌水解酶等，使营养物质转化为可以被吸收的形式。
激素信号传导则是到细胞内外环境变化的感应与反应过程，通过荧光共振能量转移（FRET）等技术可以发现许多激素信号传导的通路，如cAMP/PKA，Ca2+/CaM等通路参与了霉菌的生长发育。
2. 碳代谢的分子机制碳代谢是生物体代谢中最为基础的途径，霉菌通过吸收，转化和利用碳源来完成生长发育和代谢活动。
霉菌碳代谢的分子机制可以分为三个方面：糖解途径，三羧酸循环和戊糖磷酸途径。
糖解途径是将简单糖分子分解为能够产生ATP的代谢产物，霉菌通过糖酵解将葡萄糖分解为丙酮酸，乳酸和乙醇等代谢产物。
三羧酸循环包括多种酶的参与，霉菌可以通过环化反应和脱羧反应使代谢产物进入三羧酸循环。
戊糖磷酸途径是一个非氧化的途径，与三羧酸循环相关，该途径将糖类分解为核苷酸和三磷酸鸟苷等代谢产物，同时也可以提供有机酸和碳源。
3. 有机酸代谢的分子机制有机酸代谢反应种类繁多，包括丙酮酸代谢、丁酸代谢、琥珀酸代谢与柠檬酸循环等。
丙酮酸代谢是通过烯醇醇酸变换、脱氧酸变换等反应将丙酮酸产物转化为琥珀酸，其中磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPCK）是决定反应速率的关键酶。
食用菌基础霉菌
食用菌基础霉菌丝状真菌—霉菌编者按：食用菌栽培中常见的污染是霉菌，为了方便网友了解霉菌相关基础知识，我们特转载华南师范大学的此篇文章。
霉菌(mould,mold)属于丝状真菌(filamentous fungi)。
凡在营养基质上形成绒毛状、棉絮状或蜘蛛网形丝状菌体的真菌，统称为霉菌。
霉菌包括分类学上许多不同纲或类的真菌，它们分别属于藻状菌纲、子囊菌纲、担子菌纲和半知菌类。
霉菌在自然界分布极为广泛。
它们存在于土壤、空气、水体和生物体内外等处，与人类关系极为密切。
①工业应用：柠檬酸、葡萄糖酸等多种有机酸，淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶等多种酶制剂，青霉素和头孢霉素等抗生素，核黄素等维生素，麦角碱等生物碱，真菌多糖和植物生长刺激素(赤霉素)等产品的生产；利用某些霉菌对甾族化合物的生物转化生产甾体激素类药物；②食品酿造：酿酒、制酱及酱油等；③基础理论研究：如对粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的研究为生化遗传学建立提供了大量资料；④危害：霉菌能引起粮食、水果、蔬菜等农副产品及各种工业原料、产品、电器和光学设备的发霉或变质，也能引起植物和动物疾病。
如马铃薯晚疫病、小麦锈病、稻瘟病和皮肤癣症等。
一、霉菌的形态与构造1.菌丝霉菌的营养体由菌丝构成。
菌丝可无限伸长和产生分枝，分枝的菌丝相互交错在一起，形成了菌丝体。
霉菌的菌丝有两类：一类菌丝中无横隔，整个菌丝体就是一个单细胞，含有多个细胞核。
藻状菌纲中的毛霉、根霉、犁头霉等的菌丝属于此种形式(图1A)。
另一类菌丝有横隔，每一段就是一个细胞，整个菌丝体是由多个细胞构成，横隔中央留有极细的小孔，使细胞质和养料互相沟通。
子囊菌纲、担子菌纲和半知菌类的菌丝皆有横隔(图1B)。
霉菌菌丝直径一般为3～10μm，与酵母细胞类似，但比细菌或放线菌的细胞约粗10倍。
图1 霉菌的营养菌丝A.一条菌隔菌丝的一部分；B.有隔菌丝的一部分。
图2 粗糙脉胞菌的菌丝分化及其细胞壁的成分霉菌丝状细胞的构造与酵母菌细胞十分相似。
里氏木霉原生质体的制备及转化
⾥⽒⽊霉原⽣质体的制备及转化⾥⽒⽊霉原⽣质体的制备及转化摘要本实验通过将含潮霉素B抗性标记的质粒pAN7-1转化⾄⾥⽒⽊酶原⽣质体中，在含100ug/ml潮霉素B的PDA平板上筛选转化⼦。
并予以验证，结果表明，在1kb处有潮霉素抗性基因组，其中浓度为107个/ml的转化⼦效果最好。
关键词⾥⽒⽊酶原⽣质制备转化前⾔纤维素是⾃然界提供给⼈类的最宝贵的财富，植物每年通过光合作⽤产⽣数千亿吨的纤维素，但⽬前只有⼀⼩部分⽤于纺织、造纸、建筑和饲料等⽅⾯。
⽊霉属是迄今被认为纤维素酶成分最全⾯，分解天然纤维素活⼒最⾼的⼀类菌。
在育种⽅⾯利⽤⾼能电⼦、紫外线、亚硝基胍处理和原⽣质体融合等⽅法，使酶的活⼒得到很⼤的提⾼。
本试验对⾥⽒⽊霉原⽣质体的制备及转化进⾏了研究,为进⼀步的育种⼯作奠定基础。
1 材料与⽅法1.1 材料1.1.1 菌株及质粒来源⾥⽒⽊霉QM9414和质粒pAN7-1由深圳⼤学⽣命科学学院S402实验室刘刚⽼师提供。
1.1.2试剂及培养基的配制1.1.2.1 Mandels 营养盐浓缩液配制(NH4)2SO4 14 g，尿素 3 g，KH2PO420 g，CaCl2?2H2O 4 g，MgSO4?7H2O 3 g，ddH2O 定容⾄1L1.1.2.2 Mandels 微量元素浓缩液配制FeSO4?7H2O 5 g，ZnSO4?7H2O 1.7 g，CoCl2?6H2O 23.7 g，MnSO4?H2O 1.6 g，ddH2O 定容⾄1L1.1.2.3 1 M柠檬酸缓冲液配制柠檬酸210 g，NaOH（纯度96 %）78 g，ddH2O 750 ml，冷却后定容⾄1L1.1.2.4 60％的PEG400050 mM CaCl2，10 mM Tris·Cl（pH 7.5），60 g PEG4000加⽔定容到100 ml1M CaCl25ml，1M Tris·Cl（pH 7.5）1ml，PEG4000 60g，ddH2O定容⾄100 ml1.1.2.5 STC⼭梨醇218.6g（所需浓度为1.2 M），1M Tris·Cl（pH 7.5）10ml（所需浓度为10 mM），1M CaCl2 50ml（所需浓度为50 mM），ddH2O 定容⾄1L1.1.2.6 PDA培养基去⽪⼟⾖200g，葡萄糖20g，琼脂(Agar) 15g，ddH2O定容⾄1L其中20 %⼟⾖浸出液制作⽅法如下：将⼟⾖去⽪切碎，每20 g⼟⾖加⽔100 ml，置电炉上煮20分钟，⽤纱布过滤，定容。
顶头孢霉菌原生质体制备及再生条件的改进
顶头孢霉菌原生质体制备及再生条件的改进
郑荣;朱春宝;赵文杰;朱宝泉
【期刊名称】《中国医药工业杂志》
【年(卷),期】1998(29)4
【摘要】对头孢菌素Ｃ的工业生产菌顶头孢霉菌的原生质体制备、储存和再生的具体条件（如破壁酶、菌丝处理、菌龄、再生培养基、原生质体储存液等）进行了研究，优化各种条件后制备的原生质体的再生率最高可达６０％以上，这些改进了的条件也可供其它丝状真菌的原生质体制备和再生借鉴。
【总页数】4页(P156-159)
【关键词】顶头孢霉菌;原生质体;再生;头孢菌素C;制备
【作者】郑荣;朱春宝;赵文杰;朱宝泉
【作者单位】上海医药工业研究院
【正文语种】中文
【中图分类】TQ927
【相关文献】
1.金顶侧耳原生质体制备与再生条件的研究 [J], 张亚娇;陈淮洁;卢木造;朱坚;
2.顶头孢霉原生质体制备、再生及带vgb基因的质粒DNA转化条件的研究 [J], 戴秀君;马文婵;李术娜;王全;李红亚;朱宝成
3.链霉菌702原生质体的制备和再生条件研究 [J], 熊姗薇;孙宇辉;涂国全
4.不同条件对产黄青霉菌原生质体制备率与再生率的影响 [J], 王公坤
5.黑暗链霉菌原生质体制备、再生及其DNA转化条件的研究 [J], 吴胜;夏焕章;程杉
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农杆菌转化法高效构建顶头孢霉sorA和sorB双缺失菌株提高头孢菌素C产量
农杆菌转化法高效构建顶头孢霉sorA和sorB双缺失菌株提高头孢菌素C产量陈国枝;储炬【摘要】目的获得顶头孢霉sorA和sorB双缺失菌株,以阻断sorbicillinoids的合成,并研究其与头孢菌素C(CPC)产量的关系.方法通过根癌农杆菌转化法,依据同源双交换的原理,同时敲除合成sorbicillinoids骨架结构的两个聚酮合酶基因sorA 和sorB,并通过摇瓶发酵实验检测缺失菌和野生菌的产量.结果筛选并验证了6株A.chrysogenum-Apks菌株,遗传稳定,转化效率约为20％.通过发酵实验测定发现,缺失菌株产CPC能力比野生菌提高了70％.结论农杆菌转化法是一个高效的顶头孢霉遗传操作系统,并且顶头孢霉中sorbicillinoids的缺失可以提高CPC产量.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2019(044)007【总页数】6页(P805-810)【关键词】农杆菌转化法;顶头孢霉;聚酮合酶;同源重组;头孢菌素C【作者】陈国枝;储炬【作者单位】华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237【正文语种】中文【中图分类】R978.1顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)是β-内酰胺类抗生素的主要工业生产菌，其发酵产物头孢菌素C(CPC)经过化学法或者酶法处理可获得7-氨基头孢烷酸(7-ACA)[1]，后者是合成各种头孢类抗生素药物的母核物质。
2014年，Dominik等[2]公布了顶头孢霉野生型菌株ATCC11550的全基因组序列，使得从分子层面研究顶头孢霉基因功能更加便利。
原生质体转化法是顶头孢霉中最为成熟的遗传操作方法。
然而，由于顶头孢霉细胞结构复杂、分生孢子量比较少[3]等特性，其原生质体制备较为繁琐、困难。
同时，原生质体转化效率低下，使得顶头孢霉分子研究进程缓慢。
农杆菌转化法依赖于根癌农杆菌的侵染性，会将自身体内的Ti质粒的一部分基因转移并整合到宿主菌内。
2.6 气生菌丝体的特化形式-汪琨
起 式
是一个球形或瓶形结构，
在其内壁表面或底部密生极
刚 毛
状
短的无色分生孢子梗，梗上
产分生孢子。
柑橘拟茎点霉（Phomopsis citri）
• 属半知菌亚门真菌； • 分生孢子器呈球形至不
规则形，具孔口； • 分生孢子具二型：
I型为卵型，单胞无色； Ⅱ型孢子丝状或钩状，
单胞无色。
分生孢子座
图2-13 青霉的分生孢子头
青霉的分生孢子头 Penicillum
Penicillum
Penicillium purpurogenum产紫青霉的分生 孢子头
（1）结构简单的子实体
无性
青霉属（Penicillium） 分生孢子头
曲霉属（Aspergillus）
（分生孢子穗，conidial head）
子囊果按其外形可分3类
①闭囊壳（cleistothecium） ②子囊壳（perithecium） ③子囊盘（apothecium）
闭囊壳 （cleistothecium）
白粉菌属闭囊壳
•完全封闭式，呈球圆形，是
不整囊菌纲（Plectomycetes）
附属丝
所具有的特征。
例如，红曲霉的闭囊壳呈球
同，使分生孢子头呈现不同形状，如球状、 帚状、放射状、短柱状或棍棒状等。
图2-13 曲霉的分生孢子头
足细胞（podocyte）
• 曲霉中一种特化了 的壁厚、膨大的菌 丝细胞。
• 其上着生分生孢子 梗，分生孢子梗通 过其与营养菌丝相 连。
曲霉的分生孢子头 Aspergillus
Aspergillus flavus 黄曲霉
曲霉属（Aspergillus）
（分生孢子穗，conidial head）
顶头孢霉优良菌株的选育和vgb在顶头孢霉中的转化与表达的开题报告
顶头孢霉优良菌株的选育和vgb在顶头孢霉中的转化与表达的开题报告题目：顶头孢霉优良菌株的选育和vgb在顶头孢霉中的转化与表达摘要：顶头孢霉是一种重要的真菌资源，具有广泛的应用价值。
本文将介绍如何通过筛选和诱变等方法，选育出具有高产、高效、耐受性强等优良特性的顶头孢霉菌株。
同时，本文还将探究vgb基因在顶头孢霉中的转化与表达情况，为进一步研究其在顶头孢霉中的功能提供重要参考。
关键词：顶头孢霉、优良菌株、选育、vgb基因、转化、表达一、研究背景和意义顶头孢霉是一种重要的真菌资源，广泛应用于制药、食品加工、饲料生产等领域。
然而，目前应用于工业生产的顶头孢霉菌株往往存在着生产效率低、抗环境逆境能力差等问题，因此如何选育出高产、高效、耐受性强等优良特性的顶头孢霉菌株，成为了当前亟待解决的问题之一。
vgb基因是在铜离子+、低温条件下激活的转录因子，可以促进菌体的生长和代谢，同时还具有抗氧化、耐盐等功能。
因此，将vgb基因转化至顶头孢霉中，有望改善其生长表现和抗逆境能力，进而提高其工业生产应用效益。
二、研究内容1. 优良菌株的筛选和诱变选取具有较高胞外酶酶活、耐低温、耐盐、耐酸等特性的顶头孢霉菌株，通过筛选、诱变等方法，选育出具有高产、高效、耐受性强等优良特性的顶头孢霉菌株。
2. vgb基因的克隆和定位通过PCR扩增和克隆等技术，获得vgb基因的DNA序列，并进行比对和分析。
此外，还将寻找vgb基因在顶头孢霉中的定位信息，以便进一步研究其在这一物种中的功能。
3. vgb基因的转化和表达采用Pichia pastoris等载体，将vgb基因进行转化，进而在顶头孢霉中表达。
通过Western blotting等技术，检测vgb基因在目标细胞中的表达水平和效果，以进一步研究其在顶头孢霉中的功能。
三、研究预期成果本研究通过优良菌株的选育和vgb基因的转化和表达，有望获得高产、高效、耐受性强等优良特性的顶头孢霉菌株，并能证实vgb基因在顶头孢霉中的转化和表达可行性，并初步研究其在顶头孢霉中的功能，为顶头孢霉优化改良提供重要参考。
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顶头孢霉的原生质体转化
1.从5-6个LPE平板（28度培养6天）收集顶头孢霉孢子，将5×107个真菌孢子接种于
100 mL的MMC液体培养基中，在28℃200 rpm培养18-20 h；
2.滤网收集菌体，并分别用0.9% NaCl和TP 溶液冲洗菌体；
3.将菌体悬浮于10 mL含有0.01M的DTT的TPC溶液中。
30℃、100 rpm温浴50-60 min；
4.滤网收集菌体(可用TP溶液冲洗片刻)，加入10 mL含有8 mg/mLlysing enzyme 的TP
溶液，30℃、100 rpm温浴1.5-2 h；
5.先后用滤网和四层擦镜纸过滤酶解液，收集原生质体悬液。
常温2100 rpm离心4 min，
收集原生质体。
6.将原生质体重悬于10-20 mL的KCM溶液中，离心洗涤原生质体，共洗涤3次。
7.将原生质体重悬于KCM溶液中，使其浓度为1×108个/mL，再加入1/10体积的PCM，
放置冰上待用；
8.在2-ml 离心管中加入50 µl 的原生质体和1-5µl DNA，混匀冰浴20 min；
9.加入500 µl PCM，轻轻混匀，室温（25-30℃）放置20 min；
10.加入600 µl KCM，混匀；
11.分别取300 µl上述混合液，均匀滴加在含适当抗性的TSAS平板上，并倒入10 mL的
约50℃（不烫手）的TSAS软琼脂（0.8% agar）抗性培养基。
12.28 ℃培养4-7 d，转化子出现后转接抗性TSA板，作进一步鉴定。
注：
TP溶液：0.5 M的KCl，0.1 M的M g SO4·7H 2 O，50 mM的磷酸钠缓冲液, pH为5.8; (注：可先分别配制溶液A：1 M KCl，0.2 M的M g SO4·7H 2 O 和溶液B：100 mM的磷酸钠缓冲液，pH 5.8；用前两溶液等体积混合)
KCM溶液：0.6 M的KCl，50 mM的CaCl2，10 mM的MES（pH 5.8）；
PCM溶液：20%的PEG6000，50 mM的CaCl2，10 mM的MES（pH 5.8）.
TSAS medium (per liter)：
Tryptone，17 g
Soytone - enzymatic digest of soybean meal， 3 g
glucose, 2.5 g
NaCl, 5 g
K2HPO4, 2.5 g
Sucrose, 103 g
Agar, 15 g
MMC medium (per liter):
30.8 g sucrose; 2.38 g glucose; 0.5 g corn steep solids; 8.39 g L-asparagine（天冬酰胺酸）;
0.23 g ammonium acetate; 14.97 g KH2 PO4; 27.39 g K2 HPO4·3H 2 O;
0.71 g Na2 SO4; 0.173 g MgSO4 ·7H 2 O; 0.074 g CaCl2;
1 ml salt solution (per liter, 13 g Fe(NH4 )
2 (SO 4 )2 ·6H2 O; 3g MnSO4 ·4H 2 O;
3 g ZnSO
4 ·7H 2 O;
0.8 g CuSO4 .5H 2 O)。