微生物原生质体融合技术研究进展_王春平

动物医学进展,2008,29(5):64267Progress in Veterinary Medicine微生物原生质体融合技术研究进展3王春平1,2,韦　强1,鲍国连13,刘　燕1,邵泽香1,2,季权安1(1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,浙江杭州310021;2.山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018) 摘　要:原生质体融合技术在遗传学、动植物远缘杂交育种、生物学、免疫学、兽医学以及医药、食品、农业等方面都有广泛的应用价值,文章就原生质体制备、再生及其融合过程中的影响因素做了综述,另外还对原生质体融合方法和融合子的筛选方法进行了比较,为选择适宜有效的诱导融合方法和筛选方法提供依据。

关键词:原生质体融合;影响因素;融合方法;筛选方法中图分类号:Q813.2文献标识码:A文章编号:100725038(2008)0520064204 原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交,是指细胞通过介导和培养,在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程[1]。

原生质体融合技术起源于20世纪60年代。

1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。

1974年匈牙利的Ferenczy L 等[2]采用离心力诱导的方法,报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合,从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术,并从微生物种内融合扩展到界间的融合。

路玲玲等[3]采用融合技术成功构建耐高温高产酒精酵母,至此,原生质体融合技术成为工业菌株改良的重要手段之一。

原生质体融合技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大[4]。

1　原生质体融合技术微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备,原生质体融合,原生质体再生[5]。

1.1　原生质体制备与再生过程中的影响因素制备原生质体的最大障碍就是细胞壁,现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法,使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶,具体根据所用微生物的种类而定。

影响原生质体制备的因素很多,不同的微生物有其较为适当的形成条件。

在菌龄选择上,多采用对数生长中后期的细菌,这主要是由于对数生长期细菌的细胞壁中肽聚糖含量最低,细胞壁对酶的作用最敏感。

王燕[6]对双亲灭活米曲霉进行原生质体制备的过程中,用纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶混合浓度比为5∶3∶1的酶液混合使用能提高去壁效果。

使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用一种酶的效果好,在一定范围内,酶作用的时间和酶作用的浓度都与原生质体的形成率成正相关,而与再生率成反相关。

另外,ED TA作为螯合剂,可以避免金属离子对酶的抑制作用而提高酶脱壁效果,从而提高原生质体的形成率。

据报道,对大肠埃希菌来说,用ED TA洗涤后,可以除去对酶解不利的金属离子[7]。

另一方面,在原生质体制备前,用适量的青霉素对菌体进行预处理,可以抑制肽聚糖合成过程中的转肽作用,有利于原生质体的形成。

根据酶反应动力学原理,酶解温度直接影响酶促反应的速度,如放线菌的最适酶解温度为28℃～37℃,真菌的最适酶解温度为30℃～35℃[8]。

在高渗Tris 溶液中添加15mL/L聚乙烯吡咯烷酮(PV P)等原生质体扩张剂,有利于溶液中细菌的分散,有助于制备原生质体,添加0.02mol/L镁离子,有利于原生质体的稳定。

关于原生质体的再生,吴孔兴等[9]报道在原生质体高渗再生培养基中加入0.3mol/L的蔗糖和0.2mol/L的丁二酸钠是合适的,王玉华等[10]报道在高渗再生培养基中加入0.5mol/L的蔗糖是适宜的,这可能要根据不同的微生物种类而定。

1.2　原生质体融合过程中的影响因素1974年,匈牙利的Ferenczy报道了离心力诱导法对白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合。

随后人们相继用NaCl、KCl和Ca(NO3)2等作为诱变剂进行融合,但融合频率都很低。

聚乙二醇在适量3收稿日期:2008202203基金项目:浙江省重点科技攻关项目(2005C12021,2005E60014)作者简介:王春平(1982-),男,山东淄博人,硕士研究生,主要从事动物传染病研究。

3通讯作者Ca2+存在下能有效地诱导植物原生质体融合,Ca2+主要是通过维持膜结构的完整性来实现原生质体的稳定性与活性。

原生质体膜外在蛋白上二价阳离子的存在使膜脂流动性减慢、稳定性增强,这种维持稳定性的效果大小与膜表面分子数量的多少呈正比例关系,PEG种类对原生质体融合的影响不大。

此外,其融合率还受其他诸因素的影响。

影响原生质体融合的因素很多,特别是环境中的阳离子存在,融合时的p H也对原生质体融合有较明显的影响。

一般来讲Ca2+、Mg2+有助于融合。

如有0.01mol/L Ca2+存在时,可得到较高的融合率,但在缺乏钙离子时,若p H较低,融合频率也较高。

这是因为钙离子和带负电荷的PEG与细胞膜表面分子相互作用,使原生质体带电,彼此易于附着发生凝集所致[11]。

2　原生质体融合的方法2.1　PEG结合高Ca2+诱导法聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物,不同种类微生物对PEG分子质量的要求不尽相同。

放线菌适用分子质量常为1ku～1.5ku,也有使用0.4ku～6ku,真菌一般采用4ku～6ku,细菌用1.5ku～6ku。

亲本原生质体制备好后,即可进行融合。

关于促融机制,一般认为PEG本身是一种特殊的脱水剂,它以分子桥形式在相邻原生质体膜间起中介作用,进而改变质膜的流动性能,降低原生质膜表面势能,使膜中的相嵌蛋白质颗粒凝聚,形成一层易于融合的无蛋白质颗粒的磷脂双分子层区。

在Ca2+存在下,引起细胞膜表面的电子分布的改变,从而使接触处的质膜形成局部融合,出现凹陷,构成原生质桥,成为细胞间通道并逐渐扩大,直到两个原生质体全部融合。

2.2　电融合原生质体电融合起始于20世纪80年代的细胞改良新技术。

陈合等[12]报道了电融合的方法,将白芝和赤芝两种大型真菌原生质体成功进行了融合,这一技术将电学与生物化学恰当结合,产生了缓和而高频率的原生质体融合效果。

其原理是在短时间强电场的作用下,细胞膜发生可逆性电击穿,瞬时失去其高电阻和低通透性,然后在数分钟内恢复原状,当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区时,即可诱导它们的膜相互融合,从而导致细胞融合。

近年来,该技术在微生物中的应用日渐增多。

2.3　激光诱导融合1987年始,激光诱导融合技术迅速发展起来,并很快被应用在动物细胞及植物原生质体的融合中。

激光融合是让细胞或原生质体先紧密贴在一起,再用高峰值功率密度激光对接触处进行照射,使质膜被击穿或产生微米级的微孔。

由于质膜上产生微孔是可逆过程,质膜在恢复过程中细胞连接小孔的表面曲率很高,处于高张力状态,细胞逐渐由哑铃形变为圆球状时,说明细胞已融合了。

该技术最突出的优点在于它的高度选择性,利用激光微束技术可诱导许多细胞中所需的两个相邻细胞融合。

但由于其所需设备昂贵复杂,操作技术难度大,很难推广应用。

此后,虽有研究者试图以类似原理及较简便的步骤,在微生物原生质体融合中应用激光微束技术[13],但融合效率较低,且丧失了高度选择性的优点。

激光诱导融合技术仍处在发展初期,还有待进一步完善。

2.4　基于微流控芯片的细胞融合技术随着微机电系统(M EMS)技术和微加工技术的发展,微电极阵列的设计加工制作也日趋成熟,加之微通道网络可以整合到生物芯片之上,这将使得微流控系统成为细胞融合的理想平台,利用微流控系统可以按照预定的要求大量融合异种细胞。

Strum2 berg A等[14]已经在微流控系统中实现了单个成对细胞的融合。

证明了利用微流控技术使细胞之间可以实现可控融合,利用基于芯片技术的微流控系统不仅可以实现对细胞甚至单个细胞的操控,也可以同时输送、合并、分离和分选大量细胞,细胞融合在芯片上可以通过并行或快速排队的方式实现。

此外,由于在微通道内的腔体容积很小,所以会大幅减少细胞融合中所需的细胞数量,同时细胞融合率和杂合细胞的成活率会大大提高。

2.5　高通量细胞融合芯片高通量细胞融合芯片利用微电极阵列在细胞融合芯片的微米范围内(10μm～40μm)产生的高强度高梯度辐射电场,使得细胞融合芯片中的细胞在此特殊辐射电场的作用下产生介电质电泳力,精确处理和刺激预定的细胞目标,从而使目标细胞按照预先设计的方向以预定的速度移动,从而可以按照设计要求准确地大批量地得到目标细胞配型,集成微电极阵列的微流控系统,可以方便灵活地实现对细胞的操作、隔离和转移。

该方法的优点是可以与化学诱导融合、电诱导融合等方法相互结合,比如在细胞融合缓冲液中加入少量的PEG可大大提高细胞的融合率[15]。

此外,二价阳离子(如Ca2+)以及蛋白酶对细胞的预处理,融合率也可大幅提高。

然而,截至目前各国与此相关的细胞融合实验工作只有几篇论文报道。

56王春平等:微生物原生质体融合技术研究进展3　原生质体融合所得融合子的筛选方法3.1　利用营养缺陷型标记筛选融合子这种方法的原则是将亲本菌株诱变处理后,产生对某些营养物质合成途径受阻的突变株,在分离培养基上只有融合子生长而不能让突变的双亲本原生质体形成菌落。

融合的双亲带有不同营养缺陷型标记,原生质体融合处理后的混合物直接分离到基本培养基上就可检出融合子。

其原理是因为缺陷型的双亲由于丧失了合成某种营养物质的能力,它们在基本培养基上不能生长、繁殖,同一亲本原生质体融合也不能在基本培养基上形成菌落,只有不同亲本原生质体融合后,缺陷的营养物质得到互补才能恢复为野生型在基本培养基上萌发生长形成菌落。

高玉荣等[16]报道,通过发酵性能好的长城葡萄酒酵母单倍体L13(L ys-,赖氨酸缺陷型)的原生质体与灭活的降酸能力强的粟酒裂殖酵母1685(Ino-,肌醇缺陷型)的原生质体进行融合,其试验方法就是依据这种原理来进行筛选的。

3.2　利用抗药性标记筛选融合子Bradshaw等1984年首先用这种方法检出了融合子。

微生物的抗药性是菌种的重要特性,是由遗传物质决定的,不同种的微生物对某一种药物的抗性存在差异,利用这种差异即可对融合子进行选择。

分别选择耐药菌株各1株,其应符合1株对A药敏感、B药抗性;另1株对B药敏感、A药抗性的条件。

试验菌株选择好后进一步强化诱导,稳定其抗药性。

在含有A、B两种药物的高渗再生平板上就可以把所需要的融合子检出。

李晓霞等[17]利用两种兔源肠致病性菌原生质体融合的耐药性遗传标记选择,刘玲等[18]对康宁木霉和白腐真菌原生质体融合都是利用抗药性来筛选融合子的。

3.3　利用荧光染色法筛选融合子荧光染色法是在酶解制备原生质体时事先向酶解液中加入荧光色素(如DA PI,F T TC)标记,使双亲原生质体分别带上不同的荧光色素。