真菌原生质体融合技术
原生质体融合技术简介
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中国科学院青岛生物能源与过程研究所
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology
原生质体研究的发展
1838 1873 1896 1931 1954 1958 1970 1972 1972 1974 1976 1976 1977 1978 1981 1988 2002 Muller Lugmbuthl Unna Wathin Bnders et al Marston Power et al Carlson Ferenczy et al Michayluk Ferenczy et al Fodor et al Hopwood Gleba et al Menczel Kirimalra et al Stemmer et al 动物病理组织中发现多核细胞 天花病脓胞周围发现多核细胞 水痘侵害过的皮肤中发现多核细胞 麻疹病人扁桃腺中发现多核细胞 组织培养中发现麻疹病毒能诱导细胞用和成多核体 用副流感病毒诱发细胞融合 探索用硝酸钠诱导植物原生质体融合 用NaNO3进行了烟草种间原生质体融合 以白地霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 发现PEG是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 发现 以曲霉 青霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 巨大芽孢杆菌内株间原生质体融合成功 链霉菌原生质融合并获融合重组子 用PEG+高pH-Ca2+研究原生质体融合 高 用高pH-Ca2++9℅DMSO与少量 与少量PEG获得较高的融合率 用高 与少量 获得较高的融合率 原生质体PEG融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 原生质体 一种新的体内分子育种方法——全基因组改组技术 全基因组改组技术 一种新的体内分子育种方法
食用菌原生质体融合育种技术简介
食用菌原生质体融合育种技术简介原生质体（protoplast）这个术语最早是由Hanstein 在1880年提出来的。
确切地说，食用菌原生质体是指细胞壁完全消除后余下的那部分包裹的裸露的细胞结构。
原生质体虽然失去了细胞壁存在时的原有细胞形态，变成了圆球体，但它仍然具有原生质膜和整体基因组，是一个具有生理功能的单位。
食用菌原生质体融合（protoplastfusion）是指通脱壁后的不同遗传类型的食用菌菌株原生质体，在融合剂的诱导下进行融合，最终达到部分或者整套基因组（核基因、线粒体基、胞质基因）的交换和重组，生产出新的食用菌品种和类型，也就是说，食用菌原生质体融合育种技术上是一种不通过有性生活史（sexualcycle）而达到遗传重组或有性杂交的育种手段。
近日，在佛山科技学院召开的“草菇原生质体融合育种研究”成果鉴定会上获悉，该院农学系利用现代生物工程原生质体融合育种技术，成功地选育出草菇新品种Ｖｐ—２、Ｖｐ—３。
专家们实地考察后认为，该研究成果数据可靠，技术新颖，品种表现良好，种性稳定，菌丝生长健壮，爬料速度快，抗杂能力强，子实体结实，基部紧凑，个体适中，兼备双亲优良性状，生物特性明显优于目前生产使用的当家品种。
鉴定专家一致认为，该研究成果居于国内领先水平。
据项目鉴定委员会主任、省微生物研究所研究员丘元盛介绍，该项目成果具有技术的前瞻性和研究的独创性：采用超声波处理结合溶壁酶酶解，很好地解决了草菇细胞壁裂解的难题，为原生质体融合育种提供了大量原生质体，完善了草菇原生质体制备和融合技术；创造性地利用不同草菇品种间存在拮抗作用进行融合子初筛，利用不同草菇种间分解脱脂牛奶、可溶性淀粉、聚半乳糖醛酸等物质的能力差异性，定量检测融合子与亲本间的酶分解能力，通过ＤＮＡ随机多态性差异检测进而确定融合子，技术操作新颖，为食用菌育种开辟新途径；开创性采用液氮研磨与溶壁酶酶解相结合提取草菇菌丝ＤＮＡ技术，获得高纯度遗传物质，圆满解决草菇等真菌ＤＮＡ提取过程中破壁困难和纯度不高等技术难题，实现现代分子生物学水平格测融合子的技术性飞跃。
原生质体融合技术简介
(1)渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中，不 仅起到保护原生质体免于膨胀作用，还有助于酶 和底物的结合。渗透压稳定剂多采用Kcl、NaCl等 无机物和甘露醇、山梨醉、蔗糖、丁二酸钠等有 机物。菌株不同，最佳稳定剂也有差异，在细菌 中多用蔗糖，丁二酸钠、NaCl等；在酵母菌中多 用山梨醉、甘露醇等；在霉菌中多用Kcl和NaCl等。 稳定剂的使用浓度一般均在o．3一o．8mol/L之间。
在链霉菌原生质体融合育种方面
邢孔照等以巴龙霉素产生菌和新留素产生菌 的高产变种营养缺陷型为亲株进行融合，产 生原养型重组体的频率为10-4。其中有58% 产生巴龙霉素，并从中获得了产量比原始菌 株(300ug/ml)提高5—6倍的融合子。
杨昭中等以四环素产生菌金色链霉菌和正定 霉素产生菌天蓝淡红链霉菌正定变种为亲株 进行融合，以自身抗生素抗性为标记选择种 间融合子，从而获得了一株正定霉素产量较 亲株提高了2.6倍的融合子。
另外，影响原生质体制备的因素有许多，主要是 菌体的性质 ，酶的性质以及反应环境
(1) 菌体的前处理 为了使酶的作用效果更好一些， 可对菌体作一些前处理，主要是在培养基中加入 一些物质，加入这些物质的目的，就是使菌体的 细胞壁对酶的敏感性增加。例如：青霉素能干扰 甘氨酸交联桥与四肽侧链上的D—丙氨酸之间的联 结，使细菌不能合成完整的具有空间网络结构的 细壁，结果使细胞壁结构疏松，便于溶菌酶处理。
原生质体融合技术简介
一 原生质体融合
定义：原生质体融合就是将两个亲株的细 胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在 高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的 球状原生质体。然后将两个亲株的原生质 体在高渗条件下混合，由聚乙二醇助融， 使它们相互凝集，通过细胞质融合接着发 生两次基因组之间的接触、交换、遗传重 组，在再生细胞中获得重组体。
诱导原生质体融合方法
诱导原生质体融合方法原生质体融合（Protoplast Fusion）是一种常用的遗传工程技术，用于将两个或多个植物细胞的原生质体融合成一个细胞。
这项技术可以用于基因转移、细胞杂交、基因组互补等研究和应用。
原生质体融合有许多不同的方法和策略。
下面我将介绍几种常用的原生质体融合方法：1. 化学诱导融合：这是最简单的原生质体融合方法之一。
首先，将需要融合的细胞分别处理，使其形成原生质体，然后将两种原生质体混合在一起，并使用一种化学物质（如聚乙二醇）来破坏原生质体的细胞壁。
细胞壁被破坏后，原生质体会相互融合成一个细胞。
这种方法的优点是简单易行，但融合效率较低。
2. 电穿孔融合：这是一种常用的物理诱导原生质体融合方法。
首先，将需要融合的细胞分别处理，使其形成原生质体。
然后，将原生质体置于含有金属离子的融合液中，如含有钙、镁等离子的PBS缓冲液。
使用一个电极将电流加到融合液中的细胞上，从而形成微小的电流孔。
电流孔能使细胞膜短暂地变得透明，原生质体便可以通过这些孔进入另一个细胞，并彼此融合。
3. 高速离心融合：这是一种利用机械力来诱导原生质体融合的方法。
首先，将需要融合的细胞分别处理，使其形成原生质体。
然后，将原生质体置于离心管中，并进行高速离心。
高速离心时，细胞的离心管内壁会形成主要的离心力，使细胞的原生质体被推到细胞的中心。
当离心完毕后，将生成的原生质体集中到一起，并通过重力或离心来诱导其融合。
4. 基因枪融合：这是一种利用基因枪将DNA导入细胞，并诱导细胞融合的方法。
首先，将需要融合的细胞分别处理，使其形成原生质体。
然后，将DNA负载在金属微粒上，并通过气压或爆炸将金属微粒射入细胞质中。
在这个过程中，细胞膜被破坏，使DNA可以进入细胞，并导致细胞融合。
以上是几种常用的原生质体融合方法。
根据实验需要和研究目的，可以选择适合的融合方法。
这些方法都有各自的优缺点，需要根据实际情况进行选择和优化。
原生质体融合方法的发展对于植物基因工程和农业育种具有重要意义，可以提高植物的遗传性状和生产性能，为植物育种和农业发展提供新思路和方法。
微生物原生质体融合育种技术及其应用
微生物原生质体融合育种技术及其应用摘要：工业微生物菌种选育在发酵工业中占有重要地位。
微生物原生质体融合(microbialprotoplast fusion)技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整等优点,是微生物育种最常用的方法之一。
结合相关研究进展,分析了原生质体融合技术的组成,包括制备、再生、融合的影响因素以及融合子的筛选方法,重点评述了原生质体融合技术应用在微生物育种中的最新进展,以及微生物原生质体融合技术的发展前景。
关键词：微生物原生质体融合遗传育种基因组重组引言：微生物菌种是发酵工业中的一个关键因素,它决定了发酵过程的成败及某一发酵产品是否具有工业化价值。
自然界中的原始菌株大多不具有很高的工业化价值,因此需要对菌株进行选育和改良,以提高产品的质量,降低成本。
原生质体融合技术是起源于20世纪60年代的一项重要的菌种改良技术,是将亲株细胞分别去除细胞壁后进行融合,经基因组间的交换重组,获得融合子的过程。
与其他育种技术相比,原生质体融合技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整且不需要完全了解作用机制等优点,因而被国内外微生物育种学者广泛应用。
1974年,匈牙利的Ferenczy成功将白地霉(Geotrichum candidum)营养缺陷型突变株的原生质体进行融合,使原生质体融合技术首次应用于微生物中。
接下来的几十年,该技术的基本实验方法逐步完善,现已作为一项十分有用的技术广泛应用于工业微生物菌种选育中。
本文就原生质体融合技术的过程及其应用于微生物育种方面的最新进展做了简要综述,并分析了目前存在的问题及未来的发展方向。
1 资料和方法：1.1 资料来源由第一作者在CNKI进行检索。
网址：/。
英文资料的检索时间范围为2007/2012；中文资料的检索时间范围为2007/2012。
英文检索词为“protoplast fusion、research、progressions”；中文检索词为“原生质体融合、应用、研究进展”。
原生质体融合育种
原生质体融合育种摘要原生质体融合育种克服了远缘杂交不亲和的障碍，可以提高重组频率，使得遗传物质的交换、传递更完整，成为微生物育种的一种重要方式。
其过程包括原生质体制备和再生、原生质体融合以及融合体检出等步骤。
在每个步骤中均要考虑到其应注意的因素，从而提高原生质体育种的效率，达到快速育种的目的。
因原生质体融合育种的优势，其在多功能菌种选育、工程菌选育和工业生产育种等方面应用广泛。
关键词原生质体制备融合育种原生质体再生融合体检出引言传统的杂交育种具有一定的局限性，需要受到亲和力的影响，并且要求亲本有性的分化，而原生质体育种则克服了这些缺点。
当细菌细胞壁被剥离，剩下由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。
原生质体融合是指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。
[1]原生质体融合不受种属限制，能够完整的传递遗传物质，使得重组几率提高进而提高育种速度。
[1-2]育种步骤可分为五大步骤：直接亲本及其遗传标记的选择、双亲本原生质体制备和再生、亲本原生质体诱导融合、融合重组体分离、遗传标记分析和测定。
1.亲本遗传标记的选择进行原生质体融合的双亲本一般要携带遗传标记，以顺利地筛选到融合子。
常用营养缺陷型、抗性、荧光染色、温度敏感性、孢子颜色、菌落形态等作为标记。
其中营养缺陷型是常用而有效的选择手段。
[3]2.原生质体制备制备原生质体是融合育种的前提，为了制备原生质体，需要将包围细胞的细胞壁去除掉。
去壁的方法很多，主要有机械法、酶法和非酶法，现在使用较多的是酶法。
[4]2.1酶法制备原生质体的条件（1）菌体年龄微生物的生理状态决定了原生质体的形成，而菌龄明显影响了原生质体的形成率，菌龄过长不利于释放原生质体，过短则菌丝体容易破裂。
丝状真菌一般选择年轻的尖端生长点的菌丝；细菌与霉菌一般采用对数生长期，而放线菌以对数期到静止期的转换期为好。
[5]（2）稳定剂原生质体由于失去了细胞壁因此对环境十分敏感，渗透压尤为重要。
原生质体融合育种
（二）原生质体融合的影响因素 １、融合剂 电场融合的优点： 适于动植物、微生物细胞；融合频率高 可在显微镜下观察
（二）原生质体融合的影响因素
１、融合剂
２、温度 20~30℃
３、亲株的亲和力和原生质体的活性
４、无机离子
PEG介导融合 钙离子、镁离子
电场融合
糖或糖醇
四、融合体再生 复原： 再生培养基 细胞壁重建 形成菌落 P239 图9.8
第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母细胞壁结构和遗传标记 菌龄对原生质体形成影响大 亲本灭火的方法：紫外线
热 药物
第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母原生质体制备 p259 预处理：EDTA；巯基乙醇
蜗牛酶
第六节 霉菌原生质体融合育种 二、培养基及相关溶液 p262 （1）查氏培养基的作用：菌丝生长 （3）酶液的制备：
（2）菌体培养方式：
1.平板玻璃纸法：
丝状菌
2.振荡沉没培养法
细菌和酵母菌
酶法分离原生质体的影响因素？
（3）菌体年龄
丝状真菌
菌丝体尖端细胞
放线菌
对数期到静止期
细菌
对数期
酵母菌
菌体同步化
酶法分离原生质体的影响因素？
（4）稳定剂
高渗溶液
无机盐：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl 微生物原生质体育种 三、原生质体转化育种 何种形式DNA转化率高？ 质粒
第一节 微生物原生质体育种
五、其他微生物原生质体育种 脂质体转移 原生质体转染等
第二节 微生物原生质体融合育种
微生物原生质体融合育种：
通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原 生质体发生融合，并产生重组子的过程。
人工诱导植物原生质体融合的方法
人工诱导植物原生质体融合的方法
人工诱导植物原生质体融合的方法有以下几种：
1. 超声波处理法：将含有植物原生质体的悬浮液经过超声波处理，在超声波的作用下，原生质体的融合效果会得到提高。
2. 电融合法：利用电场的作用促使原生质体融合。
将含有植物原生质体的悬浮液放置在电融合装置中，通过调节电场强度和持续时间来诱导原生质体的融合。
3. 化学诱导法：利用化学物质（如聚乙二醇）改变原生质体的细胞膜的渗透性，使原生质体能够互相融合。
4. 高温处理法：将原生质体悬浮液暴露在较高的温度下，通过高温的作用促使原生质体融合。
5. 培养基优化法：通过改变培养基中的成分和浓度，调节pH
值等条件来提高原生质体融合的效率。
需要注意的是，不同植物原生质体融合的条件可能会有所不同，以上方法仅供参考，具体的操作条件需要根据实际情况进行优化和调整。
植物原生质体融合的方法
植物原生质体融合的方法
植物原生质体融合技术是一种准确、灵活和快速的分子育种技术，它可以将一种植物中的遗传物质与另一种植物的遗传物质融合在一起，以获得更有效的育种方法。
下面介绍植物原生质体融合技术的基本概念和其应用：
一、植物原生质体融合技术的基本概念
1、原生质体的定义：原生质体（Protoplast）是指细胞原有的稳定的液体质结构，在植物细胞当中占据重要的分子物质，可以被用来搅拌，冷冻，施主或克隆植物细胞的核酸，蛋白质以及其他的分子物质。
2、破壁法的原理：破壁法是一种用于分离出植物原生质体的方法，它利用酶和/或静电力，这种酶使细胞壁细胞可以被剥离出来，从而形成原生质体。
3、原生质体融合技术：原生质体融合技术就是利用破壁法将不同植物的原生质体融合起来，以获得新的基因组的遗传材料，从而为植物的育种提供了新的思路。
二、植物原生质体融合技术的应用
1、引入新基因：原生质体融合技术可以有效地引入一些新的基因材料到植物细胞，从而改变植物的性状特征，从而获得抗逆性、抗病性、烘焙品质和其他重要特征，使植物更适应环境条件。
2、突变：通过将不同植物原生质体融合起来，可以引发基因突变，从
而获得新的外观形状或性状，更好地提高植物的繁殖力和适应性。
3、抗逆育种：原生质体融合技术可以有效地增强植物细胞体抗病性和抗逆性，从而大大提高植物的耐受性，使一些极端的环境能够更好地适应植物的生长和发育。
总而言之，植物原生质体融合技术旨在将宿主植物中基因携带的遗传改良物质融入受体细胞中，以获得更多优良育种材料，从而提高植物的适应性和抗逆性，从而提升作物的产量。
第二节原生质体融合育种
第二节原生质体融合育种一. 原生质体融合育种的特点原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇(PEG) 助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合，接着发生两套基因组之间的接触、交换，从而发生基因组的遗传重组，就可以在再生细胞中获得重组体。
原生质体融合技术具有7 个方面的优点：杂交频率较高：由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融合时又加入了融合促进剂PEG ，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交方法。
已知霉菌与放线菌的融合频率为10 -3 ～10-1，细菌与酵母的融合频率亦达到10 -3 ～10-6。
受接合型或致育性的限制较小：由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。
另外，由于原生质体融合是和“性”没有关系的细胞杂交，所以其受接合型或致育性的限制比较小。
重组体种类较多：由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发生相互接触，可以有机会发生多次交换，所以可以产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组体。
遗传物质的传递更为完整：由于原生质体融合是两个亲株的细胞质和细胞核进行类似合二为一的过程，因此遗传物质的交换更为完整。
原核微生物中可以得到将两个或更多个完整的基因组携带到一起的融合产物，放线菌中甚至能形成短暂或拟双倍体的融合产物，而在真菌中能形成短暂的或稳定的杂合二倍体甚至三倍体或四倍体等多倍体。
可获得性状优良的重组体：与其它的育种方法相结合，将从其它方法获得的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。
例如，唐沢昌彦等将氨基酸生产菌AJ3419(AEC r+ile-)与Bl-4(AHV r +lys-) 的原生质体融合，获得了苏氨酸高产菌AJ11812(AEC r+AHV r+ile-+lys-) ，该菌的苏氨酸产量较亲株提高了1 倍。
原生质体融合技术简介
作者 Xu
Jin
Khattab
酵母
对铬有较高抗性和除铬性 能较高的两种酵母进行融 合
处理低浓度含铬废水时， 卢显妍 去除率和还原率可达100%， 处理高浓度含铬废水 (200mg/L) 时 ， 还 原 率 达 50%
黑 曲 霉 (Aspergillus niger) 与 阿 特 拉 津 降 解 菌 青 霉(Penicillium sp)
(T.atroviride)
进行融合
豌 豆 根 瘤 菌 (Rhrhizbium
leguminosorum) 和 大 豆 根 瘤
菌
(Sinorhizobium
动物病理组织中发现多核细胞 天花病脓胞周围发现多核细胞 水痘侵害过的皮肤中发现多核细胞 麻疹病人扁桃腺中发现多核细胞 组织培养中发现麻疹病毒能诱导细胞用和成多核体 用副流感病毒诱发细胞融合 探索用硝酸钠诱导植物原生质体融合 用NaNO3进行了烟草种间原生质体融合 以白地霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 发现PEG是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 以曲霉 青霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 巨大芽孢杆菌内株间原生质体融合成功 链霉菌原生质融合并获融合重组子 用PEG+高pH-Ca2+研究原生质体融合 用高pH-Ca2++9℅DMSO与少量PEG获得较高的融合率 原生质体PEG融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 一种新的体内分子育种方法——全基因组改组技术
内容
• 原生质体融合技术及应用发展介绍 • 原生质体融合的具体操作方法
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中国科学院青岛生物能源与过程研究所
酵母原生质体融合
酵母原生质体融合生态学院生物11 20号李香酿酒酵母，又称面包酵母或出芽酵母。
酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，广泛的用于制作面包和馒头等食品及酿酒，是发酵中最常用的生物种类。
酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5–10μm。
其繁殖的方法为出芽生殖。
酵母菌种优劣直接影响发酵产品的价值，在自然界中菌种大多不具有较高的价值，因而对菌种的选育和改良显得尤为重要。
原生质体融合是一项应用广泛的菌种改良技术。
原生质体融合 (protoplast fusion)是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体，然后在高渗的条件下混合，并加入物理的或化学的或生物的助融条件，使双亲株的原生质体间发生相互凝集，通过细胞质融合，核融合，进而发生基因组间的交换重组，可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来。
从而获得带有双亲性状的、遗传性能稳定的融合子(fusant)的过程[1]。
目前常用的融合方法有化学融合、生物融合、电融合以及激光诱导融合等。
本实验用酿酒酵母2.339与酿酒酵母2.70作为融合双亲，进行融合，旨在计算两种菌原生质体的形成率、再生率及融合率。
望能将融合后的原生质体应用于酿酒生产中以获得较高的经济效益。
1材料1.1样品菌种：酿酒酵母(Saccharomgces cerevisiae)的两种营养缺陷型菌株(如met-、lys-)。
1.2 培养基和试剂(1)马铃薯培养基：马铃薯(去皮) 200g，葡萄糖20g，水1000 mL。
配制方法下：将马铃薯去皮，切成约2cm2的小块，放入1500mL的烧杯中煮沸30min，注意用玻棒搅拌以防糊底，然后用双层纱布过滤，取其滤液加糖，在补足水分1000 Ml,自然pH。
(2)YEPD培养基(用于酵母原生质体融合)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄20g蒸馏水1000 mL，pH6.0。
(3)YEPD高渗培养基(含0.6 mol/L NaCl的YEPD)：在YEPD培养基中0.6mol/L NaCl，3％琼脂。
原生质体融合育种
原生质体融合育种摘要原生质体融合育种克服了远缘杂交不亲和的障碍，可以提高重组频率，使得遗传物质的交换、传递更完整，成为微生物育种的一种重要方式。
其过程包括原生质体制备和再生、原生质体融合以及融合体检出等步骤。
在每个步骤中均要考虑到其应注意的因素，从而提高原生质体育种的效率，达到快速育种的目的。
因原生质体融合育种的优势，其在多功能菌种选育、工程菌选育和工业生产育种等方面应用广泛。
关键词原生质体制备融合育种原生质体再生融合体检出引言传统的杂交育种具有一定的局限性，需要受到亲和力的影响，并且要求亲本有性的分化，而原生质体育种则克服了这些缺点。
当细菌细胞壁被剥离，剩下由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。
原生质体融合是指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。
[1]原生质体融合不受种属限制，能够完整的传递遗传物质，使得重组几率提高进而提高育种速度。
[1-2]育种步骤可分为五大步骤：直接亲本及其遗传标记的选择、双亲本原生质体制备和再生、亲本原生质体诱导融合、融合重组体分离、遗传标记分析和测定。
1.亲本遗传标记的选择进行原生质体融合的双亲本一般要携带遗传标记，以顺利地筛选到融合子。
常用营养缺陷型、抗性、荧光染色、温度敏感性、孢子颜色、菌落形态等作为标记。
其中营养缺陷型是常用而有效的选择手段。
[3]2.原生质体制备制备原生质体是融合育种的前提，为了制备原生质体，需要将包围细胞的细胞壁去除掉。
去壁的方法很多，主要有机械法、酶法和非酶法，现在使用较多的是酶法。
[4]2.1酶法制备原生质体的条件（1）菌体年龄微生物的生理状态决定了原生质体的形成，而菌龄明显影响了原生质体的形成率，菌龄过长不利于释放原生质体，过短则菌丝体容易破裂。
丝状真菌一般选择年轻的尖端生长点的菌丝；细菌与霉菌一般采用对数生长期，而放线菌以对数期到静止期的转换期为好。
[5]（2）稳定剂原生质体由于失去了细胞壁因此对环境十分敏感，渗透压尤为重要。
原生质体融合技术及其在微生物育种中的应用
原生质体融合技术及其在微生物育种中的应用摘要:原生质体融合技术是微生物遗传育种上的一项重要技术，它具有遗传信息传递量大，不受亲缘关系的影响，可有目的地选择亲株以选育理想的融合株，便于操作等优点，在菌种选育中具有广阔的应用前景。
本文从原生质体的制备及其影响因素、原生质体融合的促融方法、原生质体融合子的筛选以及融合技术在微生物菌种选育中的应用等方面进行了综述以及微生物原生质体融合技术的发展前景与展望。
关键词: 原生质体融合; 菌种选育; 生物技术; 应用发展前景与展望原生质体融合育种(proloplas} Iusion)是20世纪60年代发展起来的基因重组技术。
通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。
1960年法国的B ars研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象，同时口本的Dkada发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞彼此融合，从而开始了细胞融合的探索。
1974年匈牙利的Fereczy采用离心力诱导的方法实现了白地霉(Creolrichum carol irlrmv)营养缺陷型突变株原生质体的融合;随后人们相继用NaC1KCl和Ca(N03)2等作为诱变剂进行融合，但融合率比较低;1978年国际工业微生物遗传学讨论会提出了原生质体的融合问题，使这一技术迅速扩展到了育种领域;1979年匈牙利的Pesti首先提出了运用融合育种技术提高青霉素的产量的报告，从而开创了原生质体融合技术在工业微生物育种实际工作中的应用。
从此，原生质体融合育种广泛应用于霉菌、酵母菌、放线菌和细菌，并从株内、株间发展到种内、种间，打破种属间亲缘关系，实现属间、门间，甚至跨界融合。
1原生质体融合技术简介原生质体融合就是用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍---抢田胞壁，释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，然后用物理或化学方法诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。
微生物原生质体融合技术
•1957年 年 1957年，Eddy和Williumson等首次用蜗牛酶酶 年 等首次用蜗牛酶酶 和 等首次用蜗牛酶 解制备了酵母菌的原生质体
•60年代 年代
60年代捷克的 年代捷克的Brno和西班牙的 和西班牙的Salmanca两个研究中心对原 年代捷克的 和西班牙的 两个研究中心对 质体技术做了大量基础性工作 前者主要应用原生质体研 工作， 生质体技术做了大量基础性工作，前者主要应用原生质体研 酵母细胞的生活史与细胞分裂，后者主要研究能够有 生活史与细胞分裂 究酵母细胞的生活史与细胞分裂，后者主要研究能够有 降解丝状真菌细胞壁的溶菌酶。 丝状真菌细胞壁的溶菌酶 效降解丝状真菌细胞壁的溶菌酶。
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2 原生质体的融合
微生物原生质体诱导融合方法主要有
电融合 基于微流控芯片 的细胞融合技术
PEG 结合高 ＋ Ca2＋诱 导法
激光诱导融合 高通量细胞融 合芯片
Logo PEG结合高 2＋诱导法 结合高Ca ＋ 结合高
聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，不同种类微生物对 是一种多聚化合物， 聚乙二醇 是一种多聚化合物 PEG分子质量的要求不尽相同。亲本原生质体制备好后， 分子质量的要求不尽相同。 分子质量的要求不尽相同 亲本原生质体制备好后， 即可进行融合。 即可进行融合。
融合（ 融合（PEG、离心沉淀、电脉冲等） 、离心沉淀、电脉冲等） 融合子的检出（直接检出法和间接检出） 融合子的检出（直接检出法和间接检出） 株的筛选
实用性菌 实用性菌
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二、原生质体融合技术的步骤与方法
融合重组体筛选
3
主要步骤
1
双亲本原生质 体制备和再生,
02 菌种选育
02 菌种选育本章内容：第一节菌种的来源2.1.1 生物物质产生菌的筛选2.1.1.1 M—生物产物的来源M是各种生物活性产物的丰富资源，要获得所需生物特性的新产物，关键是：①、选择M；②、筛选方案(检测系统)。
M细胞内含物及其培养基成分极其复杂，且所需的产物可能每毫升只有微克到毫克，在选择筛选方法时必须考虑选择性和灵敏度两个方面，即需灵敏度很高的专一性检测方法。
2.1.1.2 待筛选样品的性质寻找新产物的产生菌可用固体或液体培养基筛选。
但次级代谢物的大规模生产是用沉没培养法进行的，由于在固体培养基和液体培养基中产生的次级代谢物的方式不一样，因此有些研究人员以液体培养法为惟一的筛选手段。
2.1.1.3 筛选方案的设计基本上可利用以下三种不同的筛选方法：①、整体生物；②、完整细胞；③、亚细胞制剂。
2.1.2 M选择性分离的原理和方法大多数抗生素均由放线菌产生。
下面介绍放线菌为主的分离方法原理的发展。
选择性分离方法大致可分为五个步骤：①、含M材料的选择；②、材料预处理；③、所需菌种分离；④、菌种培养；⑤、菌种选择和纯化。
以上任何一个阶段都可引人选择压力。
2.1.2.1 含M材料的选择在选择菌种来源时，存在一些选择标准。
对于天然材料，如土壤的选择，来源越是广泛的样品，含有目的类型的M的可能性越大，获得新菌种的可能性越高；另一方面，可寻找已适应相当苛刻的环境压力的M类群。
这种方法已获得某些成功(见表2-1)。
从被污染的实验室培养基中分离出嗜盐菌(Actinopolyspora halophila)，从盐场分离出嗜盐链霉菌，说明在富盐环境中存在一类尚待开发的放线菌。
酸性土壤圈的放线菌类群与其紧接下层的中性圈的放线菌类群有很大不同。
因此，也有可能利用同一生态环境内的不同环境条件分离出更多种类的菌株。
自然环境的菌群可因人类的活动而改变。
于土壤中加入去莠津(atrazine)会导致放线菌菌群数量的增加。
如诺卡氏菌属能生长在Carboxanilide杀真菌剂中。
原生质体融合(实验报告)
酵母原生质体融合××××××××××酵母有发酵工业的灵魂之称，其发酵性能的好坏直接影响发酵产品的质量，同时也决定着发酵工艺流程和运转周期及运转费用[1]。
因此，选育优良的酵母菌种在发酵工业中具有重要的意义[2]。
对酿酒酵母的选育始终是酿酒工作者所要从事的重要工作之一。
好的酿酒酵母能够提高酒的质量和产量，赋予酒良好的风味；能够简化工艺流程，减少设备投资；能够缩短发酵周期，降低运转费。
原生质体融合育种( protoplast fusion)是20世纪60年代发展起来的基因重组技术。
通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。
1960年法国的Barsi研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象，同时日本的Dkada发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞彼此融合，从而开始了细胞融合的探索。
国内外对原生质体融合技术的研究都比较成熟, 一般认为酵母菌原生质体融合技术的关键点有原生质体的制备和再生、原生质体的融合以及融合子的筛选等。
传统的对酿酒酵母的选育方法主要有自然分离、连续培养和诱变育种[3]。
近年来重组技术，基因工程和原生质体融合技术迅速发展，得到了广泛应用。
两个或两个以上的细胞经过自然的或者人为的作用合并成为一个细胞叫融合细胞，这个过程就称为细胞融合过程。
用微生物作材料进行细胞融合，必须消除细胞壁和细胞膜。
通常采用酶解作用破除细胞壁，采用聚乙二醇促使细胞膜融合。
细胞融合之后，还经过细胞质融合，细胞核重组，细胞壁再生等一系列过程才能形成具有生活能力的新菌株。
融合后的细胞有两种可能：一是染色体DNA不发生重组，两种细胞的染色体共存于一个细胞内，形成异核体，这是不稳定的融合。
另一类是两亲本细胞核染色体DNA真正发生重组。
通过连续传代分离纯化可以区别这两类融合。
应该指出，即便是真正的重组融合子，在传代中也有可能发生分离，产生回复或新的遗传重组体。
原核生物的基因重组(2)
基因工程的操作过程
• 基因工程的操作过程主要由以下步骤组 成：①载体和目的基因的分离；②载体 和目的基因的切断；③载体和目的基因 的重组；④重组DNA的转化和扩增；⑤ 重组DNA的筛选和鉴定。
基因工程三大理论
• DNA结构和中心法则的发现 • 质粒的发现 • 限制性内切酶的发现
基因工程三大技术
“小菌落”（呼吸缺陷型菌落）：
酵母菌由于线粒体DNA严重缺损或大部分丢失，缺失 细胞色素a、b及细胞色素c氧化酶，即使在通气条件下， 细胞生长也很缓慢，在葡萄糖培养基上只能形成小菌落。
小菌落突变株的三种类型：
野生型mtDNA ：(ρ +) ； 中性小菌落(neutral petite) (ρ 0) ： mtDNA全部丧失 抑制性小菌落(suppressive petite) (ρ -)： mtDNA部分缺失突变 分离型小菌落(segregational petite)： 染色体基因突变
3. 有性生殖与准性生殖的比较
比较项目
参与接合的亲本细胞 独立生活的异核体阶 段 接合后双倍体的细胞 形态 双倍体变为单倍体的 途径 接合发生的几率
准性生殖
形态相同的体细胞 有 与单倍体基本相同 通过有丝分裂 偶然发生，几率低
有性生殖
形态或生理上有分化 的性细胞 无 与单倍体明显不同 通过减数分裂 正常出现，几率低
2.酵母菌的接合型遗传
单倍体可以是α或a两种接合型的其中之一，一个单倍 体酵母细胞是α型还是a型是由其本身的遗传特性所决定的 ，是一种稳定的遗传特征。 一种接合型的单倍体细胞有时会发生转变，即由α型 变成a型或再回到α型 。
3. 酿酒酵母的有性杂交育种程序：
两亲本菌株的选择 单倍体细胞的分离与验证 单倍体细胞遗传标记的制作 杂交 杂合子的检出 优良性状个体的筛选与性能测试
细菌原生质体融合步骤
细菌原生质体融合实验步骤一、实验目的了解原生质体融合技术的原理。
学习并掌握以细菌为材料的原生质体融合技术。
二、实验原理原核微生物基因重组主要可通过转化、转导、接合等途径，但有些微生物不适于采用这些途径，从而使育种工作受到一定的限制。
1978 年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上，有人提出微生物细胞原生质体融合这一新的基因重组手段。
由于它具有许多特殊优点，所以，目前已为国内外微生物育种工作所广泛研究和应用。
(一)、原生质体融合的优点(1)、克服种属间杂交的“不育性”，可以进行远缘杂交。
由于用酶解除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，皆可发生原生质体融合，产生重组子。
(2)、基因重组频率高，重组类型多。
原生质体融合时，由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率。
原生质体融合后，两个亲株的整套基因组(包括细胞核、细胞质)相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。
(3) 可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。
(4) 存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子。
(二)、原生质体融合步骤(1)、选择亲本选择两个具有育种价值并带有选择性遗传标记的菌株作为亲本。
(2)、制备原生质体经溶菌酶除去细胞壁，释放出原生质体，并置高渗液中维持其稳定。
(3)、促融合聚乙二醇加入到原生质体以促进融合。
聚乙二醇为一种表面活性剂，能强制性的促进原生质体融合。
在有Ca2+ 、Mg2+离子存在时，更能促进融合。
(4)、原生质体再生原生质体已失去细胞壁，虽有生物活性，但在普通培养基上不生长，必须涂布在再生培养基上，使之再生。
(5)、检出融合子利用选择培养基上的遗传标记，确定是否为融合子。
(6)、融合子筛选产生的融合子中可能有杂合双倍体和单倍重组体不同的类型，前者性能不稳定，要选出性能稳定的单倍重组体，反复筛选出生产性能良好的融合子。
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大型真菌原生质体融合技术研究进展
1 发展史
由于原生质体技术的形成，去除了细胞壁的障碍，使得种内、种间甚至属间杂交成为可能。
原生质体融合起源于60年代，而真菌原生质体融合的第一篇报道是以白地霉(Geotrichum candidum Link)营养缺陷型突变株为材料，采用离心方法进行原生质体融合，其融合率低于10-6。
之后，人们又利用一些化学试剂，如NaNO2，Ca(NO3)2，NaCl，KCl等进行融合，效果得到改进。
1976年安(Ann)等把用聚乙二醇(PEG)诱导植物原生质体融合的方法引入到真菌原生质体的融
合中来，使融合率达到10-2量级。
PEG诱导原生质体融合的成功，推动了真菌原生质体融合的发展。
1979年匈牙利的佩斯蒂(Pesti)首先报道了融合育种提高青霉素产量，从而开创了原生质体融合在实际工作中的应用。
日本、英国、加拿大、中国等对双孢蘑菇、香菇、木耳、平菇等食用菌原生质体的分离、再生、融合做了大量卓有成效的工作。
在过去的几十年中，人们已从54种食用菌中分离到原生质体；已进行了种内10种、种间19种，属间5种、目间3种的原生质体融合研究。
然而PEG等化学方法诱导原生质体融合对细胞损伤大，有残留毒性。
1979年森达(Senda)，1980年齐默尔曼(Zimmermann)等人报道了电场诱导细胞融合的新技术，电融合技术操作简单、无化学毒性，对细胞损伤小，融合率高。
以后几年里，人们把这种新的融合手段从动、植物扩展到微生物的原生质体融合研究中，导致了原生质体融合技术的新突破。
1988年张闻迪等又报道了激光诱导动物细胞融合。
1998年又有报道螯合剂对原生质体融合具有促进作用。
2 原生质体融合中亲本的选择标记
原生质体融合前首先必须对亲本进行遗传标记，从而有利于挑选融合子。
在融合中，可采用营养缺陷型、抗药性、灭活原生质体、荧光染色、形态差异和自然生态标记等方法。
2．1 营养缺陷型标记营养缺陷型标记是一种传统有效而直接的方法。
它是通过诱变筛选进行的，菌丝、分生孢子、担孢子及原生质体都可用作诱变材料。
选择的诱变材料与使用的诱变剂相适应容易获得较高的突变率，使用能直接改变DNA结构的化学诱变剂，一般选择孢子为诱变材料，若选用碱基类似物的诱变剂，宜选择已萌发的单核菌丝或经孵育的孢子进行诱变处理；而对于已萌发的孢子、菌丝和原生质体用紫外线进行诱变较好。
现已从糙皮侧耳，鲑黄侧耳、桃红平菇、毛木耳、光木耳和琥珀木耳等获得了不同的营养缺陷型。
营养缺陷型标记虽较费时费力，且会使亲本的优良性状丧失或降低，但它仍是育种研究工作中重要一部分，只要诱变和选择方法适当，是可选择出具有正突变的营养缺陷型的。
2．2 抗药性标记微生物抗药性是其菌种的特性，是由遗传物质决定的，不同的微生物对某一种药物的抗性存在差异。
1984年布拉德肖(Bradshaw)和佩贝迪(Peberdy)首先利用这种方法在Apergillus nidulans和A.regulosus融合中选择出了融合子。
这种不通过诱变而得到的抗药性标记是选择标记的一个较好途径。
且这种抗药性在遗传上也十分稳定。
若无自然抗药性标记，则可以通过各种诱变手段而获得抗药性。
用双亲抗药性差异选择融合子时，要掌握好药物的浓度，浓度过高会使融合频率降低，过低会使亲本生长，而影响融合子的检出。
2．3 灭活原生质在融合中灭活1个亲株的原生质体与另一亲株的原生质体融合，被灭活的亲株可不加任何遗传标记，只需对活菌株进行标记，这样大大减少融合前亲株进行遗传标记的工作量，潘迎捷等人已对香菇属中的不同种进行灭活获得成功。
其中化学灭活和热灭活效果都达100%。
2．4 荧光染色在酶解制备原生质体时向酶液中加入荧光色素，使双亲原生质体分别带上不同的荧光色素，带上荧光色素的原生质体仍能发生融合并具再生能力。
2．5 形态标记这是利用四极性异宗配合的食用菌进行的种内原生质体融合。
采用以单核体作亲本，以融合后异核体形成锁状联合作为筛选标记，这样可省去在融合前对亲株进行标记的大量工作，潘迎捷等应用此方法构建了数百
株不同组合的香菇种内原生质体融合子，而且其中有些融合子表现出较好的生产性状。
2．6 自然生态标记真菌的不同种、属之间及种内，由于起源的地理区域和生态环境不同，经长期的进化选择，每个种都形成了独特的对生态和生理环境的适应性且具有明显特点。
这些生态指标的差异为我们进行融合提供了很好的生态标记性状。
3 原生质体的制备及再生
3．1 原生质体的制备
3．1．1 影响原生质体制备的因素制备食用菌原生质体的材料可以是菌丝、子实体、孢子。
在制备过程中，原生质体的产率常受以下几方面的影响。
3．1．1．1 菌龄制备原生质体多采用菌丝作为材料，鲜嫩菌丝分离原生质体的产率高、活力强，易于再生，一般以3～5日或5～7日为宜。
菌龄太短生成的菌丝量少，影响原生质体形成率，菌龄过大形成的原生质体小且变形多，有时只产生碎片。
3．1．1．2 酶的种类选择适宜的酶也是原生质体制备过程中的关键，国内多选用广东微生物研究所研制的溶壁酶，有时再与其它酶合用效果更佳，菌的种类不同，所使用的酶及酶的配比也不同。
3．1．1．3 稳渗剂的种类多采用0.4～0.6mol/L NaCl、KCl、MgSO4等无机盐类或甘露醇、蔗糖、肌醇等有机糖类作为渗透压稳定剂。
3．1．1．4 酶解作用的适宜温度对于各种真菌来说，酶解作用的适宜温度一般高于菌丝的适宜生长温度，酶解时间一般因菌种类别而异，并与温度呈一定的反相关。
此外，酶解的pH多以自然为宜。
3．1．2 原生质体分离操作菌丝培养好后，称取一定量的菌丝加入一定量的酶液，振荡培养几小时后，原生质体游离出来，然后用尼龙布、玻璃纤维、
布氏漏斗、镜头纸等过滤，除去菌丝残渣，滤液离心使原生质体沉淀，离心后的原生质体用稳渗剂悬浮待用。
3．2 原生质体的再生原生质体的再生现多着眼于培养基的组成及培养方式的研究。
4 原生质体融合
目前原生质体融合最成功且至今广为使用的是以PEG作为融合剂，对于所有种类的真菌而言，PEG诱导融合剂条件基本一致：(1)原生质尽可能的幼嫩，这样可提高融合率；(2)原生质体要纯；(3)最适的高渗稳定剂；(4)用于融合的两菌株原生质体的浓度一般为107，两菌株总量为1∶1；(5)PEG分子量为4000～6000，浓度为25%～40%，pH7～9在Ca2+存在下融合率可进一步提高。
4．1 融合子的检出原生质体融合后，融合子的选择方法，是原生质体技术得以应用的关键。
选择方法有营养缺陷型互补选择，抗药性标记，灭活原生质体，荧光染色，还可借助形态标记，自然生态标记等来初判异源融合子。
4．2 融合子的质量评价融合子经上述几种方法检出后，还应该对其进一步鉴定。
4．2．1 同工酶酶蛋白是基因表达的第一产物，而不同菌种的同工酶谱一般不同。
因此，异源融合子的基因重组也应在同工酶上有所反映。
将融合子的同工酶与亲本相比较，可为鉴定融合子提供有力证据。
4．2．2 生长拮抗试验其原理是基于不同菌种的菌丝在生长中相遇时表现出拮抗反应，异源融合子因异源基因相混合而获得新的遗传特性，因此会表现出对亲株的拮抗作用。
肖在勤曾将侧五平菇抗性菌株和凤尾菇抗性菌株的融合菌株与两亲本菌株进行拮抗实验，结果3个菌株都与双亲有遗传特性差异。
4．2．3 出菇融合子再生出来后，应将全部融合子进行出菇实验，从子实体的形态、色泽等特征上进行筛选。
李育岳等人已从木耳原生质体融合的8个融合株中的2个遗传特性稳定，具有黑木耳商品性状，表现有明显的杂交优势
的新种进行了生物学特性及出菇实验，两新种均表现出明显的杂交优势。
宋士良等人也将原生质体融合株，经初筛选得到几株性状表现良好的菌株与亲本进行出菇比较实验，其中有一融合株不出菇，有两融合株优于亲本，有希望用于生产。