真菌原生质体融合技术

大型真菌原生质体融合技术研究进展

1 发展史

由于原生质体技术的形成，去除了细胞壁的障碍，使得种内、种间甚至属间杂交成为可能。原生质体融合起源于60年代，而真菌原生质体融合的第一篇报道是以白地霉(Geotrichum candidum Link)营养缺陷型突变株为材料，采用离心方法进行原生质体融合，其融合率低于10-6。之后，人们又利用一些化学试剂，如NaNO2，Ca(NO3)2，NaCl，KCl等进行融合，效果得到改进。1976年安(Ann)等把用聚乙二醇(PEG)诱导植物原生质体融合的方法引入到真菌原生质体的融

合中来，使融合率达到10-2量级。PEG诱导原生质体融合的成功，推动了真菌原生质体融合的发展。1979年匈牙利的佩斯蒂(Pesti)首先报道了融合育种提高青霉素产量，从而开创了原生质体融合在实际工作中的应用。

日本、英国、加拿大、中国等对双孢蘑菇、香菇、木耳、平菇等食用菌原生质体的分离、再生、融合做了大量卓有成效的工作。在过去的几十年中，人们已从54种食用菌中分离到原生质体；已进行了种内10种、种间19种，属间5种、目间3种的原生质体融合研究。然而PEG等化学方法诱导原生质体融合对细胞损伤大，有残留毒性。1979年森达(Senda)，1980年齐默尔曼(Zimmermann)等人报道了电场诱导细胞融合的新技术，电融合技术操作简单、无化学毒性，对细胞损伤小，融合率高。以后几年里，人们把这种新的融合手段从动、植物扩展到微生物的原生质体融合研究中，导致了原生质体融合技术的新突破。1988年张闻迪等又报道了激光诱导动物细胞融合。1998年又有报道螯合剂对原生质体融合具有促进作用。

2 原生质体融合中亲本的选择标记

原生质体融合前首先必须对亲本进行遗传标记，从而有利于挑选融合子。在融合中，可采用营养缺陷型、抗药性、灭活原生质体、荧光染色、形态差异和自然生态标记等方法。

2．1 营养缺陷型标记营养缺陷型标记是一种传统有效而直接的方法。它是通过诱变筛选进行的，菌丝、分生孢子、担孢子及原生质体都可用作诱变材料。选择的诱变材料与使用的诱变剂相适应容易获得较高的突变率，使用能直接改变DNA结构的化学诱变剂，一般选择孢子为诱变材料，若选用碱基类似物的诱变剂，宜选择已萌发的单核菌丝或经孵育的孢子进行诱变处理；而对于已萌发的孢子、菌丝和原生质体用紫外线进行诱变较好。现已从糙皮侧耳，鲑黄侧耳、桃红平菇、毛木耳、光木耳和琥珀木耳等获得了不同的营养缺陷型。营养缺陷型标记虽较费时费力，且会使亲本的优良性状丧失或降低，但它仍是育种研究工作中重要一部分，只要诱变和选择方法适当，是可选择出具有正突变的营养缺陷型的。

2．2 抗药性标记微生物抗药性是其菌种的特性，是由遗传物质决定的，不同的微生物对某一种药物的抗性存在差异。1984年布拉德肖(Bradshaw)和佩贝迪(Peberdy)首先利用这种方法在Apergillus nidulans和A.regulosus融合中选择出了融合子。这种不通过诱变而得到的抗药性标记是选择标记的一个较好途径。且这种抗药性在遗传上也十分稳定。若无自然抗药性标记，则可以通过各种诱变手段而获得抗药性。用双亲抗药性差异选择融合子时，要掌握好药物的浓度，浓度过高会使融合频率降低，过低会使亲本生长，而影响融合子的检出。

2．3 灭活原生质在融合中灭活1个亲株的原生质体与另一亲株的原生质体融合，被灭活的亲株可不加任何遗传标记，只需对活菌株进行标记，这样大大减少融合前亲株进行遗传标记的工作量，潘迎捷等人已对香菇属中的不同种进行灭活获得成功。其中化学灭活和热灭活效果都达100%。

2．4 荧光染色在酶解制备原生质体时向酶液中加入荧光色素，使双亲原生质体分别带上不同的荧光色素，带上荧光色素的原生质体仍能发生融合并具再生能力。

2．5 形态标记这是利用四极性异宗配合的食用菌进行的种内原生质体融合。采用以单核体作亲本，以融合后异核体形成锁状联合作为筛选标记，这样可省去在融合前对亲株进行标记的大量工作，潘迎捷等应用此方法构建了数百

株不同组合的香菇种内原生质体融合子，而且其中有些融合子表现出较好的生产性状。

2．6 自然生态标记真菌的不同种、属之间及种内，由于起源的地理区域和生态环境不同，经长期的进化选择，每个种都形成了独特的对生态和生理环境的适应性且具有明显特点。这些生态指标的差异为我们进行融合提供了很好的生态标记性状。

3 原生质体的制备及再生

3．1 原生质体的制备

3．1．1 影响原生质体制备的因素制备食用菌原生质体的材料可以是菌丝、子实体、孢子。在制备过程中，原生质体的产率常受以下几方面的影响。

3．1．1．1 菌龄制备原生质体多采用菌丝作为材料，鲜嫩菌丝分离原生质体的产率高、活力强，易于再生，一般以3～5日或5～7日为宜。菌龄太短生成的菌丝量少，影响原生质体形成率，菌龄过大形成的原生质体小且变形多，有时只产生碎片。

3．1．1．2 酶的种类选择适宜的酶也是原生质体制备过程中的关键，国内多选用广东微生物研究所研制的溶壁酶，有时再与其它酶合用效果更佳，菌的种类不同，所使用的酶及酶的配比也不同。

3．1．1．3 稳渗剂的种类多采用0.4～0.6mol/L NaCl、KCl、MgSO4等无机盐类或甘露醇、蔗糖、肌醇等有机糖类作为渗透压稳定剂。

3．1．1．4 酶解作用的适宜温度对于各种真菌来说，酶解作用的适宜温度一般高于菌丝的适宜生长温度，酶解时间一般因菌种类别而异，并与温度呈一定的反相关。此外，酶解的pH多以自然为宜。

3．1．2 原生质体分离操作菌丝培养好后，称取一定量的菌丝加入一定量的酶液，振荡培养几小时后，原生质体游离出来，然后用尼龙布、玻璃纤维、

布氏漏斗、镜头纸等过滤，除去菌丝残渣，滤液离心使原生质体沉淀，离心后的原生质体用稳渗剂悬浮待用。

3．2 原生质体的再生原生质体的再生现多着眼于培养基的组成及培养方式的研究。

4 原生质体融合

目前原生质体融合最成功且至今广为使用的是以PEG作为融合剂，对于所有种类的真菌而言，PEG诱导融合剂条件基本一致：(1)原生质尽可能的幼嫩，这样可提高融合率；(2)原生质体要纯；(3)最适的高渗稳定剂；(4)用于融合的两菌株原生质体的浓度一般为107，两菌株总量为1∶1；(5)PEG分子量为4000～6000，浓度为25%～40%，pH7～9在Ca2+存在下融合率可进一步提高。

4．1 融合子的检出原生质体融合后，融合子的选择方法，是原生质体技术得以应用的关键。选择方法有营养缺陷型互补选择，抗药性标记，灭活原生质体，荧光染色，还可借助形态标记，自然生态标记等来初判异源融合子。

4．2 融合子的质量评价融合子经上述几种方法检出后，还应该对其进一步鉴定。

4．2．1 同工酶酶蛋白是基因表达的第一产物，而不同菌种的同工酶谱一般不同。因此，异源融合子的基因重组也应在同工酶上有所反映。将融合子的同工酶与亲本相比较，可为鉴定融合子提供有力证据。

4．2．2 生长拮抗试验其原理是基于不同菌种的菌丝在生长中相遇时表现出拮抗反应，异源融合子因异源基因相混合而获得新的遗传特性，因此会表现出对亲株的拮抗作用。肖在勤曾将侧五平菇抗性菌株和凤尾菇抗性菌株的融合菌株与两亲本菌株进行拮抗实验，结果3个菌株都与双亲有遗传特性差异。

4．2．3 出菇融合子再生出来后，应将全部融合子进行出菇实验，从子实体的形态、色泽等特征上进行筛选。李育岳等人已从木耳原生质体融合的8个融合株中的2个遗传特性稳定，具有黑木耳商品性状，表现有明显的杂交优势