原生质体融合技术的研究进展_PPT幻灯片
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• 陈洪雷等（2011）以供试菌Pseudomonas putida和Psathyrella candolleana 为出发菌株进行原生质体融合实验，将筛选到 的重组菌用于处理五氯酚(PCP)合成废水以检测重组菌的氯 代酚降解性。结果显示，Xz6-1的PCP去除率为75．98％， 其PCP降解能力较亲本Preudomonas putida提高了21．7l％。
三、微生物原生质体融合的应用
• 选育抗生素高产菌株
• 张琪等（2009）以红霉素高产茵HE-08-6及低产优组分茵 HA-08-20为出发菌株，其原生质体经紫外诱变后在适宜条 件下进行融合，得到了既保留了亲本HE-08-6的高产性状， 又保留了亲本HA-08-20的组分优良特性，而且具有较好的 传代稳定性优良融合菌株。
主要内容
一
概述
二
原生质体融合的步骤和方法
ห้องสมุดไป่ตู้
三
微生物原生质体融合的应用
四
前景及展望
一、概述
• 原生质体：细胞内由原生质组成 的各种结构统称为原生质体，包 括细胞膜、细胞质(包括各种细胞 器、细胞骨架系统及胞基质)和细 胞核等部分,原生质体是由原生质 特化而来。
• 植物细胞即细胞壁内的原生质部 分；动物细胞就是原生质体。
2、原生质体制备
制 备 流 程
• 原生质体制备的影响因素
3、原生质体的再生
• 原生质体再生的影响因素
1. 培养基 2. 稳定剂 3. 酶解浓度和时间 4. 再生方式 5. 原生质体密度 6. 其他因素：菌龄、预培养、残存菌体等
4、原生质体融合
4、原生质体融合
4、原生质体融合
原 生 质 融 合 过 程
• 根据融合的目的选择适宜的直接亲本。现在一般认为亲本 应采用具有较大遗传差异的近亲菌株，重组后的新个体具 有更大的杂种优势。
• 作为原生质体融合的二亲本都应该有一定的遗传标记，便 于重组体的检出。常用的遗传标记有：带隐性性状的营养 缺陷、抗性标记、热致死、孢子颜色和菌落形态等作为标 记。
• 实际应用时究竟采用哪各遗传标记，可以根据试验目的确 定。
谢谢大家！
三、微生物原生质体融合的应用
• 选育优良的菌种
• 原生质体融合广泛应用到酿酒酵母的改良。
• 彭帮柱（2006）等以酿酒酵母1605和苹果酒酵母E2为 亲本，通过原生质体融合，得到融合子8#菌株，具有 产香能力和发酵能力均强于双亲的优点。
• 封晓霞等（2011）对生产S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的酿酒 酵母（S.cerevisiae）菌株R1进行复合诱变和原生质体 融合。实验采用酶解法获得出发菌株S.cerevisiae R1的 单倍体菌株hR10，对其进行UV和DES复合诱变，所得 菌株与出发菌株相比SAM产量提高了103 %。
4、原生质体融合
• 原生质体融合的影响因素
5、融合体的检出与分离
• 融合体中除重组体外，还有异核体或部分结合子、杂合二 倍体或杂合系，这些都会在平板上形成菌落，检出融合体 的方法有多种，在育种工作中可根据实验目的和微生物的 不同加以选择。
① 利用营养缺陷型标记选择融合体 ② 利用抗药性选择融合体 ③ 利用灭活原生质体检出融合体 ④ 利用荧光染色法选择融合体 ⑤ 双亲对碳源利用不同而检出融合体 ⑥ 利用形态差异检出
• 宋赵依等（2011）以非致病性尖镰孢F047和对西瓜枯萎菌 有抑制作用的植物内生放线菌SG2、生长较快并对尖孢镰 孢萎蔫专化型有抑制作用的重寄生链霉菌PR进行跨界原生 质体融合，经筛选获得的融合子生长速率和对多菌灵抗药 性均优于F047菌株。
三、原生质体融合的应用
• 在污水工程菌构建上的应用
• 许燕滨等（2005）采用原生质体融合技术，将两株具有含氯 有机化合物降解特性的菌假单胞菌T—l和诺卡氏菌RB-1融合 构建成一株高效降解含氯有机化合物工程菌，应用于造纸漂 白废水，融合菌去除CODCr和TCL的能力比混合菌分别提高 了72.05％和190％。
• 吴萍等（2012）以刺糖多孢菌CB11（Saccharopolyspora spinosa CB11）与红霉素高产菌株红色糖多孢菌E2为亲本进 行种间原生质体融合，得到了遗传稳定性良好的高产融合
子S．spinosa X9，其多杀菌素产量可达290 mL，比亲本S．
spinosa CB11(产量为153 g／mL)提高了89．5 %。
一、概述
• 原生质体融合(protoplast fusion)是20世纪70年代发展起来的 基因重组技术。
• 原生质体融合：也称细胞杂交、细 胞融合或体细胞杂交，是指细胞通 过介导和培养，在离体条件下用人 工方法将不同种的细胞通过无性方 式融合成一个核或多核的杂合细胞 的过程。
1、亲本及遗传标记的选择
三、微生物原生质体融合的应用
• 改良菌种遗传特性
• 苏云金杆菌以色列变种（Bacillus thuringiensis subsp．
israeleusls）产生的杀虫毒素主要杀死双翅目昆虫，而苏云
金杆菌库斯塔基变种（Bacillus thuringiensis subsp．
kurstaki HD—I）产生的毒素蛋白主要杀鳞翅目昆虫。将 这两个菌株的原生质体进行融合，筛选得到既杀鳞翅目昆 虫、又杀双翅目害虫的重组菌株。（2008）
四、前景及展望
• 原生质体融合技术为遗传操纵、分子生物学和基 础理论研究提供了一种重要工具，也为遗传育种 提供了一种有效手段，已广泛应用于微生物育种 工作的各个方面。
• 近年来，灭活原生质体融合、离子束细胞融合、 非对称细胞融合以及基因重排分子育种等新方法 相继提出并应用于微生物育种，这是原生质体融 合技术的新发展。相信随着技术的不断完善，原 生质体融合在微生物育种中占有的地位会越来越 重要。
三、微生物原生质体融合的应用
• 选育抗生素高产菌株
• 张琪等（2009）以红霉素高产茵HE-08-6及低产优组分茵 HA-08-20为出发菌株，其原生质体经紫外诱变后在适宜条 件下进行融合，得到了既保留了亲本HE-08-6的高产性状， 又保留了亲本HA-08-20的组分优良特性，而且具有较好的 传代稳定性优良融合菌株。
主要内容
一
概述
二
原生质体融合的步骤和方法
ห้องสมุดไป่ตู้
三
微生物原生质体融合的应用
四
前景及展望
一、概述
• 原生质体：细胞内由原生质组成 的各种结构统称为原生质体，包 括细胞膜、细胞质(包括各种细胞 器、细胞骨架系统及胞基质)和细 胞核等部分,原生质体是由原生质 特化而来。
• 植物细胞即细胞壁内的原生质部 分；动物细胞就是原生质体。
2、原生质体制备
制 备 流 程
• 原生质体制备的影响因素
3、原生质体的再生
• 原生质体再生的影响因素
1. 培养基 2. 稳定剂 3. 酶解浓度和时间 4. 再生方式 5. 原生质体密度 6. 其他因素：菌龄、预培养、残存菌体等
4、原生质体融合
4、原生质体融合
4、原生质体融合
原 生 质 融 合 过 程
• 根据融合的目的选择适宜的直接亲本。现在一般认为亲本 应采用具有较大遗传差异的近亲菌株，重组后的新个体具 有更大的杂种优势。
• 作为原生质体融合的二亲本都应该有一定的遗传标记，便 于重组体的检出。常用的遗传标记有：带隐性性状的营养 缺陷、抗性标记、热致死、孢子颜色和菌落形态等作为标 记。
• 实际应用时究竟采用哪各遗传标记，可以根据试验目的确 定。
谢谢大家！
三、微生物原生质体融合的应用
• 选育优良的菌种
• 原生质体融合广泛应用到酿酒酵母的改良。
• 彭帮柱（2006）等以酿酒酵母1605和苹果酒酵母E2为 亲本，通过原生质体融合，得到融合子8#菌株，具有 产香能力和发酵能力均强于双亲的优点。
• 封晓霞等（2011）对生产S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的酿酒 酵母（S.cerevisiae）菌株R1进行复合诱变和原生质体 融合。实验采用酶解法获得出发菌株S.cerevisiae R1的 单倍体菌株hR10，对其进行UV和DES复合诱变，所得 菌株与出发菌株相比SAM产量提高了103 %。
4、原生质体融合
• 原生质体融合的影响因素
5、融合体的检出与分离
• 融合体中除重组体外，还有异核体或部分结合子、杂合二 倍体或杂合系，这些都会在平板上形成菌落，检出融合体 的方法有多种，在育种工作中可根据实验目的和微生物的 不同加以选择。
① 利用营养缺陷型标记选择融合体 ② 利用抗药性选择融合体 ③ 利用灭活原生质体检出融合体 ④ 利用荧光染色法选择融合体 ⑤ 双亲对碳源利用不同而检出融合体 ⑥ 利用形态差异检出
• 宋赵依等（2011）以非致病性尖镰孢F047和对西瓜枯萎菌 有抑制作用的植物内生放线菌SG2、生长较快并对尖孢镰 孢萎蔫专化型有抑制作用的重寄生链霉菌PR进行跨界原生 质体融合，经筛选获得的融合子生长速率和对多菌灵抗药 性均优于F047菌株。
三、原生质体融合的应用
• 在污水工程菌构建上的应用
• 许燕滨等（2005）采用原生质体融合技术，将两株具有含氯 有机化合物降解特性的菌假单胞菌T—l和诺卡氏菌RB-1融合 构建成一株高效降解含氯有机化合物工程菌，应用于造纸漂 白废水，融合菌去除CODCr和TCL的能力比混合菌分别提高 了72.05％和190％。
• 吴萍等（2012）以刺糖多孢菌CB11（Saccharopolyspora spinosa CB11）与红霉素高产菌株红色糖多孢菌E2为亲本进 行种间原生质体融合，得到了遗传稳定性良好的高产融合
子S．spinosa X9，其多杀菌素产量可达290 mL，比亲本S．
spinosa CB11(产量为153 g／mL)提高了89．5 %。
一、概述
• 原生质体融合(protoplast fusion)是20世纪70年代发展起来的 基因重组技术。
• 原生质体融合：也称细胞杂交、细 胞融合或体细胞杂交，是指细胞通 过介导和培养，在离体条件下用人 工方法将不同种的细胞通过无性方 式融合成一个核或多核的杂合细胞 的过程。
1、亲本及遗传标记的选择
三、微生物原生质体融合的应用
• 改良菌种遗传特性
• 苏云金杆菌以色列变种（Bacillus thuringiensis subsp．
israeleusls）产生的杀虫毒素主要杀死双翅目昆虫，而苏云
金杆菌库斯塔基变种（Bacillus thuringiensis subsp．
kurstaki HD—I）产生的毒素蛋白主要杀鳞翅目昆虫。将 这两个菌株的原生质体进行融合，筛选得到既杀鳞翅目昆 虫、又杀双翅目害虫的重组菌株。（2008）
四、前景及展望
• 原生质体融合技术为遗传操纵、分子生物学和基 础理论研究提供了一种重要工具，也为遗传育种 提供了一种有效手段，已广泛应用于微生物育种 工作的各个方面。
• 近年来，灭活原生质体融合、离子束细胞融合、 非对称细胞融合以及基因重排分子育种等新方法 相继提出并应用于微生物育种，这是原生质体融 合技术的新发展。相信随着技术的不断完善，原 生质体融合在微生物育种中占有的地位会越来越 重要。