原生质体融合技术的研究进展_PPT幻灯片
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原生质体融合技术简介
另外，影响原生质体制备的因素有许多，主要是 菌体的性质 ，酶的性质以及反应环境
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9
(1) 菌体的前处理 为了使酶的作用效果更好一些， 可对菌体作一些前处理，主要是在培养基中加入 一些物质，加入这些物质的目的，就是使菌体的 细胞壁对酶的敏感性增加。例如：青霉素能干扰 甘氨酸交联桥与四肽侧链上的D—丙氨酸之间的联 结，使细菌不能合成完整的具有空间网络结构的 细壁，结果使细胞壁结构疏松，便于溶菌酶处理。
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2
一 原生质体融合
原理：两个具有不同基因型的细胞，采用适 宜的水解酶剥离细胞壁后，在融合剂作用下， 两原生质体接触，融合成为异核体，经过繁 殖复制进一步核融合，形成杂合二倍体，再 经过染色体交换产生重组体，达到基因重组 的目的，最后对重组体进行生产性能，生理 生化和遗传特性分析。
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18
6 实用性菌株的筛选
微生物原生质融合是一种新的基因重组技 术，它具有定向育种的含义。但是，融合 后所产生的融合子类型仍然是各种各样的。 性能不同，产量不同的情况仍然存在，因 此必要的人工筛选仍然很重要 ，主要是遗 传稳定性等的实验。
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19
四 原生质体融合育种的应用
由于PEG既是融合剂又是渗透压稳定剂，浓度低于 20％会 使原生质体破裂而失去稳定性，浓度过高又会引起原生质 体收缩而降低融合频率，因此，融合时PEG的最终浓度常 采用30%一40％。由干PEG一加入，原生质体间的粘着即？ 强烈地发生，融合就能较长时间有效地进行，所以PEG的 处理时间不得太长。此外，PEG在高浓度下有毒，因此也 要求融合时间不宜过长。。
有人指出，先用紫外线照时原生质体，再进行融合可以大
大增加融合频率
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(1) 菌体的前处理 为了使酶的作用效果更好一些， 可对菌体作一些前处理，主要是在培养基中加入 一些物质，加入这些物质的目的，就是使菌体的 细胞壁对酶的敏感性增加。例如：青霉素能干扰 甘氨酸交联桥与四肽侧链上的D—丙氨酸之间的联 结，使细菌不能合成完整的具有空间网络结构的 细壁，结果使细胞壁结构疏松，便于溶菌酶处理。
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一 原生质体融合
原理：两个具有不同基因型的细胞，采用适 宜的水解酶剥离细胞壁后，在融合剂作用下， 两原生质体接触，融合成为异核体，经过繁 殖复制进一步核融合，形成杂合二倍体，再 经过染色体交换产生重组体，达到基因重组 的目的，最后对重组体进行生产性能，生理 生化和遗传特性分析。
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6 实用性菌株的筛选
微生物原生质融合是一种新的基因重组技 术，它具有定向育种的含义。但是，融合 后所产生的融合子类型仍然是各种各样的。 性能不同，产量不同的情况仍然存在，因 此必要的人工筛选仍然很重要 ，主要是遗 传稳定性等的实验。
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四 原生质体融合育种的应用
由于PEG既是融合剂又是渗透压稳定剂，浓度低于 20％会 使原生质体破裂而失去稳定性，浓度过高又会引起原生质 体收缩而降低融合频率，因此，融合时PEG的最终浓度常 采用30%一40％。由干PEG一加入，原生质体间的粘着即？ 强烈地发生，融合就能较长时间有效地进行，所以PEG的 处理时间不得太长。此外，PEG在高浓度下有毒，因此也 要求融合时间不宜过长。。
有人指出，先用紫外线照时原生质体，再进行融合可以大
大增加融合频率
原生质体融合技术简介ppt课件
5
三 原生质体融合的过程
甲 解酶 融
乙
合
亲株 原生
再质体
生
融合体
再生
筛选 优化
6
•
遗传标记亲株筛选
•
原生质体制备
• 原生质体再生及再生频率计算
•
原生质体的融合
•
异核体检出
•
重组体检出和鉴定
• 重组体的形态，生理生化和遗传分析
7
1 标记菌株的筛选
• 用于原生质体融合的亲本需要携带遗传标记，以 便于重组体的检出。常用营养缺陷型和抗性作为 标记，也可以采用热致死，孢子颜色，菌落形态 作为标记。实际时究竟采用哪种遗传标记，要根 据实验目的来确定。如果原生质体融合的目的是 为了进行遗传分析，那么应该采用带有隐性基因 的营养缺陷性或抗性菌株；如果从育种角度进行 原生质体融合，由于大多数营养缺陷性菌株都会 影响代谢产物的产量，所以在选择营养缺陷性标 记时，应尽量避免采用对正常代谢有影响的缺陷 性菌株
11
• (1)渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中，不 仅起到保护原生质体免于膨胀作用，还有助于酶 和底物的结合。渗透压稳定剂多采用Kcl、NaCl等 无机物和甘露醇、山梨醉、蔗糖、丁二酸钠等有 机物。菌株不同，最佳稳定剂也有差异，在细菌 中多用蔗糖，丁二酸钠、NaCl等；在酵母菌中多 用山梨醉、甘露醇等；在霉菌中多用Kcl和NaCl等。 稳定剂的使用浓度一般均在o．3一o．8mol/L之间。
• 1 杂交频率较高 • 由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融
合时加入融合促进剂PEG，所以微生物原生质体间的杂 交频率都明显高于常规杂交方法。 • 2 受接合型或致育性的限制较小 • 由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用， 因此有利不同种属间微生物的杂交。另外，出于原生质 体融合是和致育性没有关系的细胞杂交，所以其受接合 型或致育性的限制就比较小。 • 3 重组体种类较多 • 由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发 生相互接触．有机会发生多次交换，可以产生各种各样 的基因组合而得到多种类型的重组体
三 原生质体融合的过程
甲 解酶 融
乙
合
亲株 原生
再质体
生
融合体
再生
筛选 优化
6
•
遗传标记亲株筛选
•
原生质体制备
• 原生质体再生及再生频率计算
•
原生质体的融合
•
异核体检出
•
重组体检出和鉴定
• 重组体的形态，生理生化和遗传分析
7
1 标记菌株的筛选
• 用于原生质体融合的亲本需要携带遗传标记，以 便于重组体的检出。常用营养缺陷型和抗性作为 标记，也可以采用热致死，孢子颜色，菌落形态 作为标记。实际时究竟采用哪种遗传标记，要根 据实验目的来确定。如果原生质体融合的目的是 为了进行遗传分析，那么应该采用带有隐性基因 的营养缺陷性或抗性菌株；如果从育种角度进行 原生质体融合，由于大多数营养缺陷性菌株都会 影响代谢产物的产量，所以在选择营养缺陷性标 记时，应尽量避免采用对正常代谢有影响的缺陷 性菌株
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• (1)渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中，不 仅起到保护原生质体免于膨胀作用，还有助于酶 和底物的结合。渗透压稳定剂多采用Kcl、NaCl等 无机物和甘露醇、山梨醉、蔗糖、丁二酸钠等有 机物。菌株不同，最佳稳定剂也有差异，在细菌 中多用蔗糖，丁二酸钠、NaCl等；在酵母菌中多 用山梨醉、甘露醇等；在霉菌中多用Kcl和NaCl等。 稳定剂的使用浓度一般均在o．3一o．8mol/L之间。
• 1 杂交频率较高 • 由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融
合时加入融合促进剂PEG，所以微生物原生质体间的杂 交频率都明显高于常规杂交方法。 • 2 受接合型或致育性的限制较小 • 由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用， 因此有利不同种属间微生物的杂交。另外，出于原生质 体融合是和致育性没有关系的细胞杂交，所以其受接合 型或致育性的限制就比较小。 • 3 重组体种类较多 • 由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发 生相互接触．有机会发生多次交换，可以产生各种各样 的基因组合而得到多种类型的重组体
《原生质体融合育种》课件
原生质体融合育种
目
CONTENCT
录
• 引言 • 原生质体制备与融合 • 原生质体融合育种技术应用 • 原生质体融合育种的优势与挑战 • 案例分析
01
引言
定义与特点
定义
原生质体融合育种是一种通过将不同植物的原生质体进行融合， 以创造具有优良性状的新品种的育种方法。
特点
能够打破物种间的遗传限制，实现种间遗传物质的重组和转移， 加速新品种的培育。
酶活性的提高
通过原生质体融合技术， 将酶活性提高的基因导入 微生物中，提高微生物产 酶的效率和活性。
04
原生质体融合育种的优势与挑战
优势
高遗传改造潜力
高效基因导入
原生质体融合能够打破物种间的生殖隔离 ，实现基因在不同物种间的转移，从而创 造出具有优良性状的新品种。
通过原生质体融合，可以将多个优良性状 集中到一个新品种中，实现高效基因导入 。
抗病性改良
将抗病基因导入动物细胞中， 提高动物的抗病能力，减少疾 病的发生。
在微生物育种中的应用
01
02
03
高产菌株的选育
通过原生质体融合技术， 将高产菌株进行杂交育种 ，获得具有优良性状的高 产菌株。
抗菌抗药性改良
将抗菌或抗药基因导入微 生物中，提高微生物的抗 菌或抗药性，用于医药、 农业等领域。
遗传稳定性差
由于原生质体融合打破了物种的遗传 稳定性，因此新品种的遗传稳定性较 差，容易发生变异。
法规限制
原生质体融合涉及到伦理和法规问题 ，需要进行严格的伦理审查和法规限 制。
未来发展方向
提高技术水平
未来需要不断提高原生质体融合 的技术水平，提高融合效率和遗 传稳定性。
拓展应用领域
目
CONTENCT
录
• 引言 • 原生质体制备与融合 • 原生质体融合育种技术应用 • 原生质体融合育种的优势与挑战 • 案例分析
01
引言
定义与特点
定义
原生质体融合育种是一种通过将不同植物的原生质体进行融合， 以创造具有优良性状的新品种的育种方法。
特点
能够打破物种间的遗传限制，实现种间遗传物质的重组和转移， 加速新品种的培育。
酶活性的提高
通过原生质体融合技术， 将酶活性提高的基因导入 微生物中，提高微生物产 酶的效率和活性。
04
原生质体融合育种的优势与挑战
优势
高遗传改造潜力
高效基因导入
原生质体融合能够打破物种间的生殖隔离 ，实现基因在不同物种间的转移，从而创 造出具有优良性状的新品种。
通过原生质体融合，可以将多个优良性状 集中到一个新品种中，实现高效基因导入 。
抗病性改良
将抗病基因导入动物细胞中， 提高动物的抗病能力，减少疾 病的发生。
在微生物育种中的应用
01
02
03
高产菌株的选育
通过原生质体融合技术， 将高产菌株进行杂交育种 ，获得具有优良性状的高 产菌株。
抗菌抗药性改良
将抗菌或抗药基因导入微 生物中，提高微生物的抗 菌或抗药性，用于医药、 农业等领域。
遗传稳定性差
由于原生质体融合打破了物种的遗传 稳定性，因此新品种的遗传稳定性较 差，容易发生变异。
法规限制
原生质体融合涉及到伦理和法规问题 ，需要进行严格的伦理审查和法规限 制。
未来发展方向
提高技术水平
未来需要不断提高原生质体融合 的技术水平，提高融合效率和遗 传稳定性。
拓展应用领域
植物原生质体融合技术
要点二
细胞大规模培养
通过改进细胞培养技术，可以实现植物原生质体融合后细 胞的规模化培养，为快速繁殖和生产转基因植物提供有效 手段。
生物反应器与细胞工厂的优化
生物反应器设计
针对植物原生质体融合过程，可以设计和优 化生物反应器，实现融合过程的自动化和连 续化，提高融合效率和细胞质量。
细胞工厂构建
通过优化生物反应器中的培养条件和工艺参 数，可以构建高效细胞工厂，实现植物原生
技术应用领域
新品种培育
通过原生质体融合技术，可实现不同品种间 优良性状的整合，快速培育出新品种。
基因功能研究
通过原生质体融合技术，可研究植物细胞中 基因的表达和功能。
抗性改良
利用该技术改良植物的抗逆性，如抗旱、抗 病、抗虫等。
细胞器与细胞生物学研究
该技术可用于研究细胞器的结构和功能，以 及细胞分裂、分化的过程。
原生质体的诱导融合
电融合法
利用电场作用诱导原生质体融合，通 常在特定的电融合装置中进行，需要 在特定的电场强度和脉冲时间下进行 操作。
化学融合法
利用化学物质如聚乙二醇（PEG）等 诱导原生质体融合，通过调节PEG浓 度、pH值等参数来控制融合过程。
融合后细胞的筛选与培养
筛选
通过特定的筛选方法如荧光染色、抗性筛选等，从融合后的细胞群体中筛选出 具有优良性状的细胞。
植物原生质体融合技术
目录
CONTENTS
• 植物原生质体融合技术概述 • 植物原生质体融合技术的基本原理 • 植物原生质体融合技术的应用 • 植物原生质体融合技术的挑战与前景 • 案例研究 • 技术展望
01
CHAPTER
植物原生质体融合技术概述
定义与特点
植物原生质体融合技术PPT课件
+0.3% Macerozyme果胶酶； 0.7M 甘露醇。
▲ 番茄无菌苗的子叶和叶肉细胞：1.5% Cellulysin 纤维素酶+0.3%
Macerozyme果胶酶；102.6g/L 蔗糖。
▲ 水稻种子的愈伤组织的悬浮培养细胞：2% Onozuka Rs 纤维素酶
+1% Driselase 纤维素酶+2% Macerozyme R-10果胶酶+1%
－优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。
－缺点：获得完整的原生质体的数量比较少。
★ 酶解分离法
– 常用的细胞壁降解酶种类：纤维素酶、半纤维素酶、果胶 酶、果酸酶等
– 优点：可以获得大量的原生质体，而且几乎所有的植物或 它们的器官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。
– 缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及
◆ 去除植物细胞壁以获得大量的原生质体 ◆ 诱导原生质体融合形成杂种细胞 ◆ 筛选，培养，促进杂种细胞分裂，分化 ◆ 从细胞团，愈伤组织到最后成株
3
4
◆ Why 技术应用
植物原生质体融合的意义：
◆克服种、属以上植物有性杂交不亲和性 障碍 ◆为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞 创造条件
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◆ How 技术方法
选取在温室中生长两个月左右的烟草植株 从生长健康的植株上摘取充分展开的嫩叶片 经自来水冲洗干净后 放入70%乙醇中进行表面消毒 然后再放入2%次氯酸钠溶液中处理10分钟 接着用无菌水洗涤3～4次，以充分除去消毒剂
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2). 酶解
用一把尖镊子，小心撕去叶片的下表皮， 将叶片切成2cm长的小片，然后放入含 酶溶液中处理。
第16章 植物原生质体融合技术 Plant Protoplast Fusion
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• 宋赵依等（2011）以非致病性尖镰孢F047和对西瓜枯萎菌 有抑制作用的植物内生放线菌SG2、生长较快并对尖孢镰 孢萎蔫专化型有抑制作用的重寄生链霉菌PR进行跨界原生 质体融合，经筛选获得的融合子生长速率和对多菌灵抗药 性均优于F047菌株。
三、原生质体融合的应用
• 在污水工程菌构建上的应用
• 许燕滨等（2005）采用原生质体融合技术，将两株具有含氯 有机化合物降解特性的菌假单胞菌T—l和诺卡氏菌RB-1融合 构建成一株高效降解含氯有机化合物工程菌，应用于造纸漂 白废水，融合菌去除CODCr和TCL的能力比混合菌分别提高 了72.05％和190％。
三、微生物原生质体融合的应用
• 选育抗生素高产菌株
• 张琪等（2009）以红霉素高产茵HE-08-6及低产优组分茵 HA-08-20为出发菌株，其原生质体经紫外诱变后在适宜条 件下进行融合，得到了既保留了亲本HE-08-6的高产性状， 又保留了亲本HA-08-20的组分优良特性，而且具有较好的 传代稳定性优良融合菌株。
体融合的步骤和方法
三
微生物原生质体融合的应用
四
前景及展望
一、概述
• 原生质体：细胞内由原生质组成 的各种结构统称为原生质体，包 括细胞膜、细胞质(包括各种细胞 器、细胞骨架系统及胞基质)和细 胞核等部分,原生质体是由原生质 特化而来。
• 植物细胞即细胞壁内的原生质部 分；动物细胞就是原生质体。
• 吴萍等（2012）以刺糖多孢菌CB11（Saccharopolyspora spinosa CB11）与红霉素高产菌株红色糖多孢菌E2为亲本进 行种间原生质体融合，得到了遗传稳定性良好的高产融合
子S．spinosa X9，其多杀菌素产量可达290 mL，比亲本S．
spinosa CB11(产量为153 g／mL)提高了89．5 %。
谢谢大家！
2、原生质体制备
制 备 流 程
• 原生质体制备的影响因素
3、原生质体的再生
• 原生质体再生的影响因素
1. 培养基 2. 稳定剂 3. 酶解浓度和时间 4. 再生方式 5. 原生质体密度 6. 其他因素：菌龄、预培养、残存菌体等
4、原生质体融合
4、原生质体融合
4、原生质体融合
原 生 质 融 合 过 程
三、微生物原生质体融合的应用
• 改良菌种遗传特性
• 苏云金杆菌以色列变种（Bacillus thuringiensis subsp．
israeleusls）产生的杀虫毒素主要杀死双翅目昆虫，而苏云
金杆菌库斯塔基变种（Bacillus thuringiensis subsp．
kurstaki HD—I）产生的毒素蛋白主要杀鳞翅目昆虫。将 这两个菌株的原生质体进行融合，筛选得到既杀鳞翅目昆 虫、又杀双翅目害虫的重组菌株。（2008）
4、原生质体融合
• 原生质体融合的影响因素
5、融合体的检出与分离
• 融合体中除重组体外，还有异核体或部分结合子、杂合二 倍体或杂合系，这些都会在平板上形成菌落，检出融合体 的方法有多种，在育种工作中可根据实验目的和微生物的 不同加以选择。
① 利用营养缺陷型标记选择融合体 ② 利用抗药性选择融合体 ③ 利用灭活原生质体检出融合体 ④ 利用荧光染色法选择融合体 ⑤ 双亲对碳源利用不同而检出融合体 ⑥ 利用形态差异检出
• 根据融合的目的选择适宜的直接亲本。现在一般认为亲本 应采用具有较大遗传差异的近亲菌株，重组后的新个体具 有更大的杂种优势。
• 作为原生质体融合的二亲本都应该有一定的遗传标记，便 于重组体的检出。常用的遗传标记有：带隐性性状的营养 缺陷、抗性标记、热致死、孢子颜色和菌落形态等作为标 记。
• 实际应用时究竟采用哪各遗传标记，可以根据试验目的确 定。
四、前景及展望
• 原生质体融合技术为遗传操纵、分子生物学和基 础理论研究提供了一种重要工具，也为遗传育种 提供了一种有效手段，已广泛应用于微生物育种 工作的各个方面。
• 近年来，灭活原生质体融合、离子束细胞融合、 非对称细胞融合以及基因重排分子育种等新方法 相继提出并应用于微生物育种，这是原生质体融 合技术的新发展。相信随着技术的不断完善，原 生质体融合在微生物育种中占有的地位会越来越 重要。
三、微生物原生质体融合的应用
• 选育优良的菌种
• 原生质体融合广泛应用到酿酒酵母的改良。
• 彭帮柱（2006）等以酿酒酵母1605和苹果酒酵母E2为 亲本，通过原生质体融合，得到融合子8#菌株，具有 产香能力和发酵能力均强于双亲的优点。
• 封晓霞等（2011）对生产S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的酿酒 酵母（S.cerevisiae）菌株R1进行复合诱变和原生质体 融合。实验采用酶解法获得出发菌株S.cerevisiae R1的 单倍体菌株hR10，对其进行UV和DES复合诱变，所得 菌株与出发菌株相比SAM产量提高了103 %。
一、概述
• 原生质体融合(protoplast fusion)是20世纪70年代发展起来的 基因重组技术。
• 原生质体融合：也称细胞杂交、细 胞融合或体细胞杂交，是指细胞通 过介导和培养，在离体条件下用人 工方法将不同种的细胞通过无性方 式融合成一个核或多核的杂合细胞 的过程。
1、亲本及遗传标记的选择
• 陈洪雷等（2011）以供试菌Pseudomonas putida和Psathyrella candolleana 为出发菌株进行原生质体融合实验，将筛选到 的重组菌用于处理五氯酚(PCP)合成废水以检测重组菌的氯 代酚降解性。结果显示，Xz6-1的PCP去除率为75．98％， 其PCP降解能力较亲本Preudomonas putida提高了21．7l％。
三、原生质体融合的应用
• 在污水工程菌构建上的应用
• 许燕滨等（2005）采用原生质体融合技术，将两株具有含氯 有机化合物降解特性的菌假单胞菌T—l和诺卡氏菌RB-1融合 构建成一株高效降解含氯有机化合物工程菌，应用于造纸漂 白废水，融合菌去除CODCr和TCL的能力比混合菌分别提高 了72.05％和190％。
三、微生物原生质体融合的应用
• 选育抗生素高产菌株
• 张琪等（2009）以红霉素高产茵HE-08-6及低产优组分茵 HA-08-20为出发菌株，其原生质体经紫外诱变后在适宜条 件下进行融合，得到了既保留了亲本HE-08-6的高产性状， 又保留了亲本HA-08-20的组分优良特性，而且具有较好的 传代稳定性优良融合菌株。
体融合的步骤和方法
三
微生物原生质体融合的应用
四
前景及展望
一、概述
• 原生质体：细胞内由原生质组成 的各种结构统称为原生质体，包 括细胞膜、细胞质(包括各种细胞 器、细胞骨架系统及胞基质)和细 胞核等部分,原生质体是由原生质 特化而来。
• 植物细胞即细胞壁内的原生质部 分；动物细胞就是原生质体。
• 吴萍等（2012）以刺糖多孢菌CB11（Saccharopolyspora spinosa CB11）与红霉素高产菌株红色糖多孢菌E2为亲本进 行种间原生质体融合，得到了遗传稳定性良好的高产融合
子S．spinosa X9，其多杀菌素产量可达290 mL，比亲本S．
spinosa CB11(产量为153 g／mL)提高了89．5 %。
谢谢大家！
2、原生质体制备
制 备 流 程
• 原生质体制备的影响因素
3、原生质体的再生
• 原生质体再生的影响因素
1. 培养基 2. 稳定剂 3. 酶解浓度和时间 4. 再生方式 5. 原生质体密度 6. 其他因素：菌龄、预培养、残存菌体等
4、原生质体融合
4、原生质体融合
4、原生质体融合
原 生 质 融 合 过 程
三、微生物原生质体融合的应用
• 改良菌种遗传特性
• 苏云金杆菌以色列变种（Bacillus thuringiensis subsp．
israeleusls）产生的杀虫毒素主要杀死双翅目昆虫，而苏云
金杆菌库斯塔基变种（Bacillus thuringiensis subsp．
kurstaki HD—I）产生的毒素蛋白主要杀鳞翅目昆虫。将 这两个菌株的原生质体进行融合，筛选得到既杀鳞翅目昆 虫、又杀双翅目害虫的重组菌株。（2008）
4、原生质体融合
• 原生质体融合的影响因素
5、融合体的检出与分离
• 融合体中除重组体外，还有异核体或部分结合子、杂合二 倍体或杂合系，这些都会在平板上形成菌落，检出融合体 的方法有多种，在育种工作中可根据实验目的和微生物的 不同加以选择。
① 利用营养缺陷型标记选择融合体 ② 利用抗药性选择融合体 ③ 利用灭活原生质体检出融合体 ④ 利用荧光染色法选择融合体 ⑤ 双亲对碳源利用不同而检出融合体 ⑥ 利用形态差异检出
• 根据融合的目的选择适宜的直接亲本。现在一般认为亲本 应采用具有较大遗传差异的近亲菌株，重组后的新个体具 有更大的杂种优势。
• 作为原生质体融合的二亲本都应该有一定的遗传标记，便 于重组体的检出。常用的遗传标记有：带隐性性状的营养 缺陷、抗性标记、热致死、孢子颜色和菌落形态等作为标 记。
• 实际应用时究竟采用哪各遗传标记，可以根据试验目的确 定。
四、前景及展望
• 原生质体融合技术为遗传操纵、分子生物学和基 础理论研究提供了一种重要工具，也为遗传育种 提供了一种有效手段，已广泛应用于微生物育种 工作的各个方面。
• 近年来，灭活原生质体融合、离子束细胞融合、 非对称细胞融合以及基因重排分子育种等新方法 相继提出并应用于微生物育种，这是原生质体融 合技术的新发展。相信随着技术的不断完善，原 生质体融合在微生物育种中占有的地位会越来越 重要。
三、微生物原生质体融合的应用
• 选育优良的菌种
• 原生质体融合广泛应用到酿酒酵母的改良。
• 彭帮柱（2006）等以酿酒酵母1605和苹果酒酵母E2为 亲本，通过原生质体融合，得到融合子8#菌株，具有 产香能力和发酵能力均强于双亲的优点。
• 封晓霞等（2011）对生产S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的酿酒 酵母（S.cerevisiae）菌株R1进行复合诱变和原生质体 融合。实验采用酶解法获得出发菌株S.cerevisiae R1的 单倍体菌株hR10，对其进行UV和DES复合诱变，所得 菌株与出发菌株相比SAM产量提高了103 %。
一、概述
• 原生质体融合(protoplast fusion)是20世纪70年代发展起来的 基因重组技术。
• 原生质体融合：也称细胞杂交、细 胞融合或体细胞杂交，是指细胞通 过介导和培养，在离体条件下用人 工方法将不同种的细胞通过无性方 式融合成一个核或多核的杂合细胞 的过程。
1、亲本及遗传标记的选择
• 陈洪雷等（2011）以供试菌Pseudomonas putida和Psathyrella candolleana 为出发菌株进行原生质体融合实验，将筛选到 的重组菌用于处理五氯酚(PCP)合成废水以检测重组菌的氯 代酚降解性。结果显示，Xz6-1的PCP去除率为75．98％， 其PCP降解能力较亲本Preudomonas putida提高了21．7l％。