大肠杆菌K88-LTB在原核细胞中的高效表达
仔猪大肠杆菌病的临床特点及其防治措施
仔猪大肠杆菌病的临床特点及其防治措施作者：许红蕊来源：《现代畜牧科技》2016年第06期摘要：仔猪大肠杆菌病是一种传染病，主要是由于感染致病性大肠杆菌而导致，严重危害新生仔猪，导致生长发育不良或者死亡。
在仔猪不同的生长期，加之感染病原血清型有所不同，使其在临床上表现出不同的症状，一般分为黄痢型、白痢型以及水肿型。
本文主要介绍该病的防治措施，供参考。
关键词：仔猪；大肠杆菌病；流行特点；临床症状；防治措施中图分类号：S858.28 文献标识码：B文章编号：2095-9737（2016）06-0168-011 流行特点仔猪产出后，如果环境污染严重，会导致包括有害的微生物和有益菌在内的各种微生物趁机侵入体内，通常是经由口腔和脐带断端侵入。
当致病性大肠杆菌侵入到仔猪肠道后，能够定居在肠道，主要是通过黏附素实现的。
传染源和传播途径：该病的主要传染源是病猪和带菌猪，一般病菌会经由粪便排出体外，并对饲料、水源、饲养用具造成污染，还会使母猪的皮肤和乳头被污染，从而在仔猪吮乳、饮食或者舐舔时通过消化道感染病菌。
季节特点：一般黄痢型和白痢型没有明显的季节性，黄痢型通常只要在猪场发生过一次流行，就会不断复发，一般在母猪产仔旺季、炎热夏季、寒冷的冬季，以及潮湿多雨的季节出现严重发病，但采取分散饲养相对较少发生。
水肿型通常在每年的4～5月份和9～10月份比较容易发生。
年龄特点：幼龄猪对该病都具有易感性，主要是在出生到断乳这一阶段容易发生。
黄痢型一般是出生24h以内的新生猪仔最容易感染，大部分在出生后大约第三天出现发病，最晚不会超过7天。
在梅雨季节，还有些仔猪会在出生后12h左右就出现发病。
白痢型通常是10～30日龄的仔猪容易发生，其中最容易在6～12日龄发生，而小于7日龄以及大于30日龄的仔猪较少发病。
水肿型一般是在断奶期容易发生，尤其是断奶后1～2星期比较常见。
2 临床症状黄痢型：该类型是新生仔猪容易发生的急性传染病，且容易致死。
大肠杆菌表达体系的特点
大肠杆菌表达体系的特点
大肠杆菌表达体系是一种常用的重组蛋白表达方法，具有以下特点：
1. 简单易用：大肠杆菌是一种常见的细菌，易于培养和操作。
其表达体系基于质粒介导的转化和表达，具有操作简单、成本低廉的优点。
2. 高表达水平：大肠杆菌表达体系能够实现高表达水平，通常可以达到10-50%的总蛋白含量。
这一特点使其成为生物制药和科学研究领域中最受欢迎的表达体系之一。
3. 多种表达宿主：大肠杆菌表达体系有多种表达宿主，包括
BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、Origami(DE3)等。
这些表达宿主具有不同的特点，能够适应不同的表达需求。
4. 可定制化：大肠杆菌表达体系可以通过基因工程技术进行改造，实现蛋白质的定制化表达。
例如，可以通过融合表达标签、选择性培养、调控表达等方式来优化表达效果。
5. 可用于生物制药：大肠杆菌表达体系可以用于制备多种蛋白药物，如重组人胰岛素、干扰素、白介素等。
这些蛋白药物已经被广泛应用于临床治疗和研究领域。
总之，大肠杆菌表达体系是一种快速、高效、可定制化的表达系统，已经成为蛋白质表达和生物制药领域中最常用的表达系统之一。
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猪大肠杆菌病疫苗有哪些？猪大肠杆菌疫苗使用方法介绍
猪大肠杆菌病疫苗有哪些？猪大肠杆菌疫苗使用方法介绍畜牧堂倪老师为你,讲解该疾病的治疗预防:猪大肠杆菌病疫苗有哪些?目前，国内已商品化的猪大肠杆菌病疫苗有仔猪大肠杆菌病K88-K99双价基因工程活疫苗、仔猪水肿病多价油乳剂灭活疫苗、仔猪大肠杆菌病K88-K99双价基因工程灭活疫苗、仔猪大肠杆菌病三价灭活疫苗、仔猪大肠杆菌灭活苗。
猪场可用大肠杆菌K88ac-LTB双价基因工程菌苗，新生猪腹泻大肠杆菌K88、K99双价基因工程菌苗，子猪大肠杆菌腹泻K88、K99、987P三价灭活苗，MM-3工程菌苗(含K88ac及无毒肠毒素LT两种保护性抗原成分)等苗进行免疫接种。
猪大肠杆菌疫苗怎么使用?接种妊娠母猪，保护性抗体可通过初乳传递给哺乳仔猪，预防由产肠毒素大肠杆菌感染引起的仔猪黄痢。
猪大肠杆菌疫苗使用方法：耳根部皮下注射。
妊娠母猪在分娩前10-20天种1毫升。
目前，猪场主要使用K88、K99、987P三价菌苗来控制猪大肠杆菌病。
即可使用单苗，也可使有联苗，例如大肠杆菌病和产气荚膜梭菌病(红痢)联苗。
通常是初次妊娠的母猪分别在产前21天、14天每头注射l头份，之后只在产前14天进行1次免疫接种即可。
但在临床上来说，疫苗免疫效果有所不同，这主要是由于大肠杆菌具有各种血清型，抗原比较复杂，且变异性较强，从而导致购买的疫苗效果较差，无法很好的预防该病。
不过只要接种疫苗就具有一定的效果，尽管无法从根本上抑制该病，但及时配合使用药物进行控制就能够使病程明显缩短，减少死亡，且不容易出现复发。
根据本猪场的实际情况选择接种适宜的疫苗。
为预防猪水肿病，可在本猪场分离致病性菌株，并制成自家灭活菌苗，于仔猪断奶前1星期给每头肌肉注射2mL，能够促使仔猪得到较好的免疫效果。
猪大肠杆菌病能用药物预防吗?可以的。
母猪从产前1星期到产后1星期，可饲喂添加适量抗生素的饲料，并在产仔当天给其注射一针长效抗生素，用于控制母猪体内的细菌数量，不仅能够有效避免其发生乳房炎、子宫炎，同时还能够有效避免后代仔猪接触感染致病性大肠杆菌，另外还能够在一定程度上预防仔猪呼吸道疾病。
我国兽用基因工程疫苗商品化进展
我国兽用基因工程疫苗商品化进展邓秋红;丁春宇;刘玉倩;王占锋;郑杰【摘要】对1991-2012年在我国获得注册并取得产品批准文号的兽用基因工程疫进行了分类总结,分析了我国兽用基因工程疫苗商品化现状和存在的主要问题,展望了兽用基因工程疫苗的发展前景.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2013(047)006【总页数】5页(P59-63)【关键词】兽用基因工程疫苗;商品化;进展【作者】邓秋红;丁春宇;刘玉倩;王占锋;郑杰【作者单位】北京华都诗华生物制品有限公司,北京102600;北京华都诗华生物制品有限公司,北京102600;北京华都诗华生物制品有限公司,北京102600;北京华都诗华生物制品有限公司,北京102600;北京华都诗华生物制品有限公司,北京102600【正文语种】中文【中图分类】S859.797疫苗的应用是控制动物传染病的有效手段。
按照制备工艺水平可以将疫苗分为传统疫苗和新型疫苗。
传统疫苗也称为常规疫苗［1］主要是指是通过人工方法或自然筛选获得减毒或无毒的活的病原微生物制成的生物制剂(活疫苗)或者通过理化方法将病原微生物灭活制成的生物制剂(灭活疫苗)。
传统疫苗的应用为我国动物疫病的防控作出了巨大贡献，目前依然是我国控制动物传染病的主要手段。
但是随着畜禽饲养规模的增加和饲养方式的变化，在动物疫情日渐复杂以及新病原和变异株的不断出现的新形势下，传统疫苗在生产和应用过程中的局限性愈来愈明显:有些病原不适宜用常规法培养，很难用传统技术制备疫苗;有些病原灭活条件严格，灭活不当会人为造成疫病流行;有些减毒的病原存在毒力返强或与田间野毒发生重组的风险;疫苗在田间的免疫效果受母源抗体影响严重;有些疫苗需多次接种，应激反应大且人工耗时费力。
为弥补传统疫苗的缺陷，生物学技术应用成果被逐步引入到疫苗设计领域，人们可以利用分子生物学技术对病原微生物的基因组进行改造，降低其致病性，提高其免疫原性;或者根据疫病防控需要，通过基因重组技术将不同病原的抗原性基因插入到载体中，制成联苗或多价苗。
大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略精编
大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略精编Document number：WTT-LKK-GBB-08921-EIGG-22986在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略赵军侯云德（病毒基因工程国家重点实验室 100052 北京）本世纪60至70年代对大肠杆菌的研究使之成为自然界中最普遍为人们所认识的生物体。
大肠杆菌具有两个显着特征：操作简单和能在廉价的培养基中高密度培养，它的这些特征加上十多年外源基因表达的经验使其在大多数科研应用中成为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。
尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。
这归因于每种基因都有其独特的结构、mRNA 的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、外源基因和在密码子利用上的主要差别以及蛋白质对宿主的潜在毒性等等。
但知识的大量积累还是有助于为表达方面某些特定的困难提供一般的解决方法。
大肠杆菌作为表达系统的主要障碍包括：不能象真核蛋白那样进行翻译后修饰、缺乏将蛋白质有效释放到培养基中的分泌机制和充分形成二硫键的能力。
另一方面，许多真核蛋白在非糖基化的形式下能保留其生物学活性，因而也就可以用大肠杆菌来表达。
如何实现外源基因在原核细胞中的有效表达，自60年代以来，对影响外源基因在其表达体系中表达效率的各个因素作了大量实验研究，并有多篇归纳性综述发表[1，2，3]。
国内针对外源基因在原核细胞中高效表达的关键因素，构建了高效表达载体[4]，并在此基础上成功表达了一系列细胞因子的基因[5，6，7]。
我们在分析了国内外有关在原核系统中表达蛋白的实验资料的基础上，对在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略所涉及的内容进行全面的总结，以期有助于我国在这方面的研究。
有效表达载体的构型构建表达质粒需要多种元件，需要仔细考虑它们的组合，以保证最高水平的蛋白质合成。
表达载体的基本结构如图1所示[8]。
RBSPR -35 -10 SD codingsequence TT Tet Ori-35 -10Stop codonTTGACA(N)17TATAAT UAAUUGAUAGStart codonmRNA 5' UAAGGAGG(N)8 AUG(91%)16S rRNA 3'HO AUUCCUCC GUG(8%)UUG(1%)启动子(以杂和的tac启动子为例)位于核糖体结合位点（RBS）上游10-100bp处，由调节基因（R）控制，调节基因可以是载体自身携带，也可以整合到宿主染色体上。
大肠杆菌高效表达重组蛋白策略
大肠杆菌高效表达重组蛋白策略前言重组蛋白的制备在蛋白结构分析和医疗应用领域十分重要。
药物蛋白的研究需要高纯度的重组蛋白来进行药物动力学和物理化学的研究[1]。
重组蛋白在检测酶活、连接配体、蛋白相互作用等生物学领域广泛应用。
已经表达出多种重组蛋白被证明有很大的应用潜力[2,3]。
通过基因工程改造的方法已经获得了许多性状优良的宿主菌表达系统，尤其是通过大肠杆菌可以大量表达外源基因编码的重组蛋白[4]。
但是仍然有两个问题制约着大肠杆菌表达系统对重组蛋白的表达：一个是表达量低，还有一个就是表达错误折叠的蛋白包涵体[5]。
蛋白的表达和纯化工艺一直在发展进步，但是超过30%的重组蛋白为不具有生物活性的包涵体，严重影响了重组蛋白的生产应用[6,7]。
在理想条件下，重组蛋白由强启动子进行表达，产生大量的具有生物学活性的可溶性重组蛋白。
但是，强启动子会导致重组蛋白的过表达,从而影响宿主菌体的生长并产生包涵体[8]。
在某些条件下可以通过变性、复性的方法使包涵体恢复活性[9]，但是复性后的蛋白是否能够完全恢复活性仍然未可知。
一般来讲，可以通过表达条件的优化来促进蛋白的可溶性表达，比如：诱导温度、培养基组成、宿主菌的种类。
还可以通过多种方案来解决蛋白不溶的问题：蛋白重新折叠[10]，构建融合蛋白[11]。
另外想要进一步增加蛋白可溶性可以与分子伴侣共表达[8]或者低温诱导[12]。
本文对目前主要的促进蛋白可溶表达的方法进行了比较全面的总结。
1.大肠杆菌表达系统的构建1.1选择表达宿主菌对于大规模的表达重组蛋白，一般选择胞内表达或者周质空间表达。
与周质空间表达相比，胞内表达的表达量更高，因此应用更为广泛。
在实验研究和实际生产中，已经有很多大肠杆菌表达系统广泛应用于。
在表达体系中较为常用的大肠杆菌为B菌株和K12菌株及它们的衍生菌株（表1[13]）。
美国国立研究院已经认证了K12菌株的标准性以及安全的使用方案，因此K12菌株在生产应用中具有极大的优势。
大肠杆菌高效表达的构建
如何构建高效表达的分子克隆?策略:构建一个高效表达的分子克隆,包括了对宿主菌的选择及相应载体的构建。
基因工程技术的核心是基因表达技术。
目前已经构建了多种基因表达系统。
包括真核和原核生物基因表达系统。
下面以大肠杆菌为例来说明如何构建高效表达的分子克隆。
一、大肠杆菌作为宿主菌的特点1、原核生物单细胞异样，生长快，代谢易于控制。
能快速获得大量基因代谢表达代谢产物。
2、基因结构简单，便于基因操作和基因分析。
3、原核生物内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的载体。
4、生理代谢途径及基因表达机制比较清楚。
但是，大肠杆菌缺乏翻译后加工和蛋白质折叠系统。
没有类似真核细胞的亚细胞结构和表达产物稳定因子。
内源性蛋白酶会降解表达的外源蛋白。
在细菌浓缩的微环境，蛋白产物分子间作用增强。
因而为了外源基因的高效表达，需构建大肠杆菌工程菌株。
常用的外源基因表达工程菌株有BL21，HMS174 ，M5219。
RB791等。
二、大肠杆菌高效表达系统的构建1、优化载体的设计i.对转录起始的启动子序列和决定mRNA翻译的SD序列进行优化。
具体方法如，组合强的启动子和终止子。
理想的启动子是细胞生长初期不表达，细胞达到一定密度后，某种特定的诱导因子诱导RNA聚合酶开始转录。
有诱导型和组成型两种类型启动子。
诱导型如lac,trp,λP.组成型如T7 噬菌体启动子。
ii.增加SD序列中与核糖体16SrRNA互补配对的碱基序列。
使SD序列中6-8个碱基与核糖体16SrRNA的碱基序列的碱基序列完全配对。
一般而言，该序列列至少含有AGGAGG中的四个碱基。
iii.根据待表达外源基因的不同情况调整SD序列与起始密码子ATG之间的距离与碱基的种类。
二者之间一般有3-9 个碱基。
iv.防止核糖体结合位点附近序列转录后形成‘茎环’的二级结构。
如果形成该二级结构会影响mRNA的表达。
2、提高稀有密码子tRNA的表达作用。
i.通过定点突变将稀有密码子转换为宿主菌内高频出现的同义密码子。
大肠杆菌K88ac菌毛蛋白亚基因的克隆、表达和免疫原性研究
中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十＝次学术研讨会各ｌ“Ｌ、咖酶Ｏ．２５ＩＩＬ，混和后加水至总量为２５皿：反应的循环参数为９４℃预变性１０ｍｊｎ：９４℃变性ｌｍ．ｍ；５６℃退火ｌｍｉｎ：７２℃延伸ｌｍ．ｎ。
进行３０个循环；７２。
Ｃ继续延伸１０ｍｉｎ。
１．２．２Ｋ８８ａｃ表达载体的构建ＤＮＡ片段的分离纯化、连接、转化、质粒的提取、限制性内切酶反应、细菌的诱导、表达等均按常规方法进行，参见Ｊ．萨姆布鲁克等Ｉ，１的方法。
１．２．３ｓＤｓ＿ＰＡＧＥ电泳分析将含有重组质粒ｐＱＥ３０．Ｋ∞的Ｅ∞打ｘＬｌ．Ｂｌｕｅ经ＩＰｌ．Ｇ诱导一定时间后。
离心（１００００９，２ｍｉｎ）收集菌体，用ＰＢｓ（ｐＨ７．４）悬浮菌体沉淀，在经超声波破碎，１０ｏｏＯｇ离心ｌＯｍｉｎ后。
分别取上清和沉淀加入２×蛋白上样缓冲液，经沸水浴５ｍｉｎ后，ｌＯ０００９离心１０ｍｉｎ取上清加样，以１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ进行分析ｕＪ。
１．２．４重组蛋白多克隆抗体的制备将含有纯化重组蛋白的缓冲液与弗氏完全（或不完全）佐剂按照１：１充分混匀乳化好后，首次按照２００岭抗原的剂量免疫新西兰大白兔。
首次免疫２周后，加强免疫。
二免按照ｌｏｏ呜抗原的剂量免疫后一周，采血检测抗体效价，然后颈动脉放血，３７℃恒温箱中放置１ｈ，于４℃冰箱放置一段时间后，析出的透明、淡黄色上清液即为重组蛋白的抗血清。
离心后分装于一７０℃保存【７１．１．２．５蛋白质印迹分析ｍｓｔｅｍｂｌｏＯ将重组蛋白与对照样品进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ。
用半干电转仪将凝胶中的蛋白转印至硝酸纤维索膜上，将膜用５％脱脂奶粉封闭。
然后加一抗，缓冲液洗涤后加入二抗。
漂洗后加入ＤＡＢ显色液显色，用去离子水终止显色反应ｐＪ．１．２．６动物免疫保护试验（１）细菌最小致死量（ＭＬＤ）的确定①细菌计数Ｉ”取５０ｐＬ一２０℃冻存的ｃ８３Ｍ菌液接种到５ｍＬ无抗性液体ＬＢ培养基中．３７℃过夜培养后，取３００吐重新接种到３０ｍＬ无抗性液体ＬＢ培养基中，３７℃培养１２小时，测细菌ＯＤ值，用平板计数法测定每毫升大肠杆菌的菌数。
大肠杆菌高效表达重组蛋白策略
中国生物工程杂志 China B i otechnol ogy,2007,27(9):103～109大肠杆菌高效表达重组蛋白策略3任增亮1,2 堵国成2,3 陈 坚1,2 吴 敬1,233(1食品科学与技术国家重点实验室江南大学 无锡 214122 2江南大学生物工程学院 无锡 214122)(3江南大学工业生物技术教育部重点实验室 无锡 214122)摘要 大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早和目前应用最广的经典表达系统。
利用该系统表达重组蛋白具有许多优越性,但其表达效率受诸多因素的影响。
综述了国内外利用大肠杆菌表达系统高效表达外源蛋白的策略,主要包括选择合适的启动子、改变信号肽结构、提高mRNA 稳定性、提高翻译效率、表达稀有密码子、降低包涵体形成及蛋白降解,利用融合蛋白与分子伴侣、调控发酵条件实现高密度培养等。
关键词 大肠杆菌 基因工程 重组蛋白 克隆 表达中图分类号 Q786收稿日期:2007207219 修回日期:20072082213教育部新世纪人才计划资助项目(吴敬),江苏省自然科学基金资助项目(BK2007019)33通讯作者,电子信箱:jing wu@jiangnan .edu .cn 表达重组蛋白受许多因素的影响,如菌体生长特性,基因转录水平,产物到达部位,翻译后修饰过程以及蛋白的修复调控等[1]。
虽然一些含复杂二硫键结构或者来源真核生物需要翻译后修饰的蛋白,不能利用E.coli 系统[2]得到高效表达而选择植物细胞、哺乳动物细胞组织[3,4]和其它微生物宿主,但是大肠杆菌具有遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等优点[5],是基因表达技术中发展最早和目前应用最广泛的经典表达系统[6],迄今已有大量有关该系统高效表达重组蛋白的研究[7]。
1 表达载体的构建 表达载体的构建是实现高效表达的关键步骤。
一个完整表达载体包含必需的几个元件(图1)。
大肠杆菌表达体系的特点
大肠杆菌表达体系的特点
大肠杆菌表达体系是一种广泛应用于生命科学领域的基因表达系统。
大肠杆菌表达体系的主要特点包括以下几个方面。
首先，大肠杆菌表达体系具有高效的表达能力。
大肠杆菌是一种常见的细菌，具有快速繁殖和高表达的特点，使其成为一种理想的表达宿主。
此外，大肠杆菌中有许多表达小分子的系统，在外源基因表达后能够迅速转录和翻译，使其具有高度的表达效率。
其次，大肠杆菌表达体系具有方便的操作性。
在大肠杆菌表达体系中，外源基因通常以质粒的形式存在于大肠杆菌细胞中。
这种质粒可以通过大肠杆菌的经典转化方法，如热激转化、电转化等，便捷地进行基因克隆。
此外，大肠杆菌表达体系在诱导表达等方面也具有简单可行的特点，使其在实验室中得到广泛的应用。
第三，大肠杆菌表达体系具有良好的调控性能。
大肠杆菌表达体系可以通过调控诱导体的种类、浓度和诱导时间等条件来控制外源基因的表达水平。
因此，可以根据需要调节目标蛋白的表达水平，实现定量和定向表达等目的。
最后，大肠杆菌表达体系具有广泛的适用范围。
大肠杆菌表达体系适用于各种规模的实验，从小规模酶活性测定到大规模蛋白制备均可。
此外，大肠杆菌表达体系还可以用于生产大量细胞因子、酶及其他蛋白质，以用于制药及其他领域的应用。
综上所述，大肠杆菌表达体系是一种高效、方便、可调控和广泛适用于生命科学研究的基因表达系统，其表达方式的特点为基因克隆简便、操作方便、表达率高、表达水平可调节、适用范围广泛等。
大肠原核表达
大肠原核表达摘要：1.大肠杆菌原核表达概述2.大肠杆菌原核表达的优点3.大肠杆菌原核表达的应用领域4.大肠杆菌原核表达的局限性5.我国在大肠杆菌原核表达领域的发展正文：1.大肠杆菌原核表达概述大肠杆菌原核表达，是指将目标基因通过重组DNA 技术插入到大肠杆菌的基因组中，使大肠杆菌能够表达出目标蛋白质。
这种方法具有操作简便、成本低廉、表达速度快等优点，因此在生物制药、生物材料、生物能源等领域得到了广泛应用。
2.大肠杆菌原核表达的优点（1）操作简便：大肠杆菌原核表达的操作步骤相对简单，包括基因克隆、转化、筛选等过程，便于实验室进行常规操作。
（2）成本低廉：与真核表达系统相比，大肠杆菌原核表达的成本较低，可以降低药物研发和生产的成本。
（3）表达速度快：大肠杆菌生长速度快，繁殖周期短，可以快速获得大量目标蛋白质。
3.大肠杆菌原核表达的应用领域（1）生物制药：大肠杆菌原核表达广泛应用于生物制药领域，例如通过大肠杆菌表达胰岛素、重组人生长激素等药物。
（2）生物材料：大肠杆菌原核表达可以用于生产生物材料，如通过大肠杆菌表达重组蛋白聚糖、重组胶原蛋白等。
（3）生物能源：大肠杆菌原核表达可以用于生产生物能源，如通过大肠杆菌表达脂肪酶、纤维素酶等酶类，以促进生物质的降解和转化。
4.大肠杆菌原核表达的局限性尽管大肠杆菌原核表达具有许多优点，但仍存在一定的局限性，如表达的蛋白质可能存在生物活性低、稳定性差等问题。
此外，大肠杆菌表达的蛋白质可能受到宿主细胞内源性蛋白酶的降解，从而影响蛋白质的产量和纯度。
5.我国在大肠杆菌原核表达领域的发展我国在大肠杆菌原核表达领域取得了显著的成果。
近年来，我国科学家通过优化表达载体、增强启动子等元件，不断提高大肠杆菌原核表达的效率和质量。
猪大肠杆菌病的发病原因与综合防控
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疾 病 防
治
每天及时清理圈舍粪便，因为母猪粪便中含有大量的病原微 生物，如果粪便在舍内积聚过多，就会增加污染饲料、饮水和用具 的风险，仔猪通过接触这些物质而感染发病。日常管理中需要定期 清洗或刷洗料槽或水槽，保持这些饲喂器具干净卫生，避免饲料或 饮水受到大肠杆菌的污染。试验证明，每天定时清理料槽、饮水槽， 并及时给仔猪补充铁制剂，可以大大降低仔猪发生水肿病和黄 （白）痢的几率[3]。
1 发病原理
1.1 内毒素
大肠杆菌外膜中含有一种脂多糖，属于内毒素，因为在大肠杆 菌菌体崩解后会释放出来这种脂多糖，脂多糖中的类脂 A 属于毒 力因子，具有内毒素功能，能够进入动物机体的血液中，对全身起 到败血症的严重危害和作用[1]。
1.2 外毒素
大肠杆菌不仅具有内毒素，还拥有外毒素，并且外毒素中含有 不耐热肠毒素和耐热肠毒素两大类。其中不耐热肠毒素不仅分子 量大而且具有抗原性，在 60℃的高温下，经过 10min 就可以被破 坏，可见在高温环境中生存能力较差。不耐热毒素还能够激活机体 毛细血管上皮细胞的腺苷环化酶，促进机体产生更多的环腺苷酸， 刺激肠黏膜细胞增加分泌量，致使猪只消化道菌群失去平衡，最后 引起腹泻和脱水症状。耐热肠毒素能够激活回肠上皮细胞的鸟苷 环化酶，促使消化道产生大量的环腺苷酸，刺激肠道分泌大量的黏 液，进而也能够引起分泌性腹泻。
或有本病流行的地区，疫苗以单苗免疫为主，具有 针对性强的特点，非疫区猪场或新建猪场可免疫三联疫苗。
3.3 做好消毒管理
消毒能及时阻止疾病的传播，特别是发现有病猪的地区，一定 要通过科学消毒的方式来阻止疾病扩散。所有外来人员和车辆进 场时需在大门口彻底消毒后再进入，对于车辆一定不能漏掉司机 的消毒。如果人员来自于疫区或同行猪场，最好在消毒后再穿戴场 内专用衣物进入。每周不低于 2 次的场内消毒，在地面撒生石灰 粉，或全场喷雾 2%氢氧化钠热溶液。场周边道路要经常打扫卫生 和喷消毒液，墙面可涂刷石灰乳。每天带猪消毒 1 次，消毒剂可选 择刺激性小、安全性高、消毒力强的过硫酸氢钾溶液或稀碘溶液。 接种疫苗时，为防止病原的扩散，最好一猪一针头，或注射过程中 做好针头的消毒工作。做去势、助产等手术时，一定要将手术器械、 手臂等彻底消毒。实验室采集病料分离病原时，用完的病料不能随 意丢弃，最好在 2%氢氧化钠热溶液中浸泡 4h 以上消毒后再处理。 病死猪尸体要焚烧或深埋，深埋时挖坑深度不低于 2m，最好填埋
如何构建一个高效表达真核生物基因的大肠杆菌的表达体系
如何构建一个高效表达真核生物基因的大肠杆菌的表达体系华中师范大学生命科学学院生物科学2011211870 李书婷概要：构建一个高效的表达体系,包括了对宿主菌的选择及相应载体的构建。
基因工程技术的核心是基因表达技术。
影响基因在大肠杆菌中表达的因素是多方面的，以下我就从载体选择、启动子、终止子、核糖体结合位点、密码子、质粒拷贝数、表达产物的稳定性、受体细胞代谢等方面说明构建大肠杆菌高效表达的方法。
大肠杆菌作为宿主菌的特点1，原核生物单细胞异样，生长快，代谢易于控制。
能快速获得大量基因代谢表达代谢产物。
2，基因结构简单，便于基因操作和基因分析。
3，原核生物内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的载体。
4，生理代谢途径及基因表达机制比较清楚。
关键词：表达载体启动子终止子核糖体结合位点翻译密码子质粒拷贝数一、表达载体表达载体应具有以下条件：1、能够独立复制。
2、应具有灵活得多克隆位点和方便的筛选标记，便于外源基因的克隆、鉴定和筛选。
而且多克隆位点应位于启动子序列之后，以使外源基因表达。
3、应具有很强的启动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别。
4、应具有使启动子受抑制的阻遏子，只有在受到诱导时才能进行转录。
5、应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关基因。
6、所产生的mRNA必须有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列。
二、启动子启动子是表达载体最重要的组成成分，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，决定了mRNA合成的速度。
启动子是在转录水平上影响基因表达。
转录的最大速率取决于启动子中碱基的组成，往往会因为一个碱基的不同，启动子效率可能提高上千倍。
也就是说启动子会有强弱之分。
要获得高校表达必须选择强启动子。
由于真核基因启动子不能被大肠杆菌RNA聚合酶识别，因此必须将真核基因编码区连接在大肠杆菌RNA聚合酶能够识别的强启动子控制之下。
通常用的强启动子有lac、trp、tac、bla、λP L等，将外源基因插入这类启动子的下游，可以增加基因的表达产量。
大肠杆菌热敏肠毒素B亚基的原核表达及生物学活性分析
大肠杆菌热敏肠毒素B亚基的原核表达及生物学活性分析王会;何孔旺;陆承平【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2011(019)002【摘要】从大肠杆菌K88（LT＋,ST＋）菌株中扩增热敏肠毒素B亚基基因（ltb）,得到454 bp片段,克隆至pMD18-T载体后,与pET32a（＋）定向连接,并转化入大肠杆菌BL21中,用IPTG 30℃诱导表达重组LTB蛋白。
SDS-PAGE显示,重组蛋白分子量约为34 kDa,超声波裂解后,表达产物主要以包涵体形式存在。
经鉴定,纯化复性后的LTB蛋白保留部分与GM1结合的生物学活性。
%The gene of Escherichia coli heat-labile enterotoxin subunit B was cloned into plasmid pET32a vector and transformed into E.coli BL21.The recombinant protein was expressed after being induced by IP TG at 30℃.The SDS-PAGE indicated that the molecular weight of recombinant LTB was about 34 kDa.Most of the recombinant protein existed in inclusion body after ultrasonication,and part of protein regained bio-activity of binding with GM1 after renaturation.【总页数】6页(P31-36)【作者】王会;何孔旺;陆承平【作者单位】山东省枣庄市畜牧兽医局,枣庄277100;江苏省农科院兽医研究所,南京210014;南京农业大学,南京210095【正文语种】中文【中图分类】S852.44【相关文献】1.产肠毒素大肠杆菌的热敏肠毒素B亚基（LT—B）和耐热肠毒素（ST）基？… [J], 徐兵;张兆山2.猪大肠杆菌热敏肠毒素B亚基基因的克隆及高效表达 [J], 王嘉福;冉雪琴;叶在荣;吴拥军3.猪大肠杆菌热敏肠毒素A亚基基因的克隆及核苷酸序列分析 [J], 王嘉福;冉雪琴;叶在荣;吴拥军4.大肠杆菌热敏肠毒素B亚基的原核表达及其免疫增强作用的探讨 [J], 王会;何孔旺5.大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在干酪乳杆菌中的分泌表达及其GM1结合活性分析 [J], 葛俊伟;姜艳平;汪淼;刘敏;乔薪瑗;唐丽杰;李一经因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
制药平时作业答案
1.大肠杆菌表达系统是原核表达系统，生产的产物是多肽蛋白质或融合蛋白质；产生部位在菌体内；培养方式容易；提纯难度一般，产物一般在菌体内提纯时需要破碎细胞；产物活性对原核生物好，对真核生物差；潜在危险性不大。
酵母表达系统是真核表达系统，可生产多肽蛋白质或糖基化蛋白质；产生部位可在菌体内，也可分泌至胞外；培养方式容易；如果产物分泌至胞外则提纯难度不大，如果产物在胞内，提纯时需破碎细胞；生产的产物活性接近天然产物；潜在危险性不大。
哺乳动物细胞表达系统生产的产物是完整的糖基化蛋白；产物均可外分泌；培养方式较难，成本高；提纯较简单；由于蛋白质能正确折叠和翻译后加工，产物活性最接近或可完全到达天然产物活性；但哺乳动物细胞表达系统有潜在危险性。
2.(1)先将组织切成碎片，然后用溶解蛋白质的酶处理而得到单个细胞，再用离心法收集细胞。
(2)将细胞植入营养培养基，使细胞在培养基中增殖到覆盖瓶壁表面，用酶把细胞从瓶壁上消化下来，再接种到若干培养瓶中进行扩大培养。
(3)将培养所得的细胞“种子”冷藏于液氮中，从液氮中取出一部分细胞“种子”进行解冻、复活培养，进行扩大培养以获得足够的细胞量。
(4)将细胞接种于大规模生物反应器中进行大规模培养，按照产物的不同形式进行产物分离纯化。
对于积累在细胞内的产物，可通过收集细胞后进行破胞，再经过分离纯化获得产物；对于由细胞分泌到培养液中产物，可以通过浓缩、纯化培养液来获得产品；而对于那些必须加入诱导剂进行培养或病毒感染培养才能得到的产物的细胞，可加入上述诱导剂诱导或病毒感染后，收集细胞，再经分离纯化得到产物。
3.(1)确定生产用原材料：毒种传代和制备用鸡胚来源于SPF鸡群，生产用毒种为WHO推荐并提供的流感病毒株。
(2)毒种种子批的建立和检定：以WHO推荐并提供的流感毒株代次为基础，传代建立主种子批和工作种子批，至成品疫苗病毒总传代不得超过5代。
建立的种子批应进行检定，检定合格后保存。
仔猪大肠杆菌基因工程疫苗
仔猪大肠杆菌病基因工程灭活疫苗（K88ac-ST1-LTB）新生仔猪大肠杆菌病是由产肠毒素性大肠埃希氏菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)引起的一种高度接触性、急性、致死性腹泻，特征是排黄色或黄白色稀粪。
临床上以1～7日龄新生仔猪下痢为主要特征，其中1—3日龄最多见。
个别耐过仔猪经较长时间才能正常生长，但病愈存活后其生长发育和生产性能指标受到严重影响。
大肠杆菌性腹泻在我国广泛流行，新生仔猪大肠杆菌性腹泻的发病率和死亡率在不同地区各有差异，发病率为5.69%～86.5%，死亡率为17.0%～73.0% 。
本病是影响养猪业发展的主要疾病之一。
产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)有两类致病因子：一类为黏附素（或称定居因子，起吸附固定作用，主要分为K88、K99、987P、F41等，其中以K88为主。
另一类为肠毒素(耐热性肠毒素ST和不耐热性肠毒素LT)，是直接导致腹泻的因子。
细菌通过黏附素固定在肠黏膜表面，大量繁殖后产生ST与LT两种肠毒素，引起剧烈腹泻，脱水、酸中毒、低血钾等。
辽宁益康生物股份有限公司科研人员经过大量的流行病学调查，病原菌的分离鉴定，致病因子的研究，从细菌致病机理出发，成功地研发出免疫谱宽，免疫效果好，使用安全的仔猪大肠杆菌基因工程疫苗，从根本上解决了新生仔猪大肠杆菌性腹泻免疫预防这一难题，现将有关情况报告如下。
一、疫苗免疫机理妊娠母猪临产前进行大肠杆菌基因工程灭活疫苗免疫接种，产生三种抗体（抗ST1抗体、抗LT抗体、抗K88抗体），仔猪出生后吮食初乳，获得母源抗体产生被动免疫，从而抵抗大肠杆菌在肠道定居增殖，有效中和肠毒素，获得保护力。
二、产品特点1、具有良好的免疫原性。
针对致泻因子耐热肠毒素（ST）、不耐热肠毒素（LT）和主要黏附因子K88，采用基因工程技术构建的GE-3菌株，可以有效表达K88ac-ST1-LTB融合蛋白，并辅以氢氧化铝胶佐剂，在保留了K88ac和LTB良好免疫原性基础上，赋予了ST1免疫原性。
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大肠杆菌K88-LTB在原核细胞中的高效表达
【摘要】利用PCR技术, 从大肠杆菌中扩增出不含信号肽序列的K88基因和LTB基因片段，将其克隆到表达载体pQE-30中, 构建了原核表达载体pQE30-K88-LTB，并转入大肠杆菌中。
诱导后，蛋白电泳分析结果显示，目的蛋白获得高效表达。
经蛋白印记检测表明，表达的蛋白能与大肠杆菌阳性血清和重组蛋白抗血清发生特异性反应。
【关键词】K88；LTB；表达
肠毒素大肠杆菌是引起世界上发展中国家婴幼儿及到这些国家旅游者腹泻的主要致病菌，危害严重。
现已知大肠杆菌定居因子和肠毒素与疾病密切相关，定居因子是大肠杆菌细胞表面菌毛，肠毒素是大肠杆菌产生的毒性分泌蛋白，有不耐热肠毒素和耐热肠毒素两种。
当病原菌感染宿主后，大肠杆菌首先通过定居因子粘附到小肠粘膜上皮细胞刷状缘受体上，抵抗住肠道蠕动与肠内分泌物清洗，维持ETEC在肠道内生长繁殖。
然后释放出肠毒素，与小肠细胞膜上的特异受体结合，引发细胞内水、电解质失衡，造成细胞吸收障碍，产生水样、脱水性腹泻。
定居因子与小肠粘膜粘附和肠毒素致毒是大肠杆菌腹泻不可或缺的两个必要条件。
我们在前人研究工作基础上，构建了一种能表达大肠杆菌pQE30-K88-LTB 融合蛋白的基因工程菌株，并计划把它转化到乳酸菌中进行表达，研制大肠杆菌基因工程活疫苗，利用乳酸菌作为载体，经口服途径进入胃肠道，将大肠杆菌基因表达在活乳酸菌的表面，刺激机体的胃肠道产生粘膜免疫和体液免疫，以期达到增加疫苗的安全性，提高疫苗免疫效果，为更有效地预防婴幼儿和旅行者腹泻，提供一种新型基因工程菌苗的候选菌株。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒模板菌株和感受态细胞BL21、表达载体pQE-30，由本实验室保存；克隆载体pMD18-T, 购自大连宝生物工程有限公司。
1.1.2 主要试剂、酶类限制性内切酶和其它工具酶为MBI公司产品；弗氏完全(或不完全) 佐剂、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体为Sigma公司产品；其他试剂为国产分析纯。
1.1.3 引物设计根据已发表的K88和LTB基因设计两对引物，序列如下：
K88-上游引物：GGATCCTTTGGTAATGTATTGAATG
K88-下游引物：GGTACCTTACTCTTTGAATCTGTC
LTB-上游引物：GGTACCCTCCCCAGACTATTACAGAACTAT
LTB-下游引物：AAGCTTGTTTTTCATACTGATTGCCGC
1.1.4 测序DNA序列由上海生工生物技术服务有限公司测定。
1.2 方法
1.2.1 PCR 扩增
1.2.1.1 DNA模板的制备用移液器无菌取少量大肠杆菌接种到5ml液体LB 培养基中，过夜培养后，采用煮沸法制备模板DNA。
1.2.1.2 K88和LTB基因的PCR扩增PCR反应体系为1μLDNA模板、2μLdNTP、2.5μL PCR缓冲液、上下游引物各1μL、Taq酶0.25μL，混和后加水至总量为25μL；反应的循环参数为94℃预变性10min；94℃变性1min；56℃退火1min；72℃延伸1 min，进行30个循环；72℃继续延伸10min。
1.2.2 pQE30-K88-LTB表达载体的构建质粒的提取和纯化、酶切反应、DNA 片段的分离纯化、连接、质粒转化、菌株诱导表达等，参见分子克隆实验指南的方法。
1.2.3 蛋白电泳分析参见分子克隆实验指南。
1.2.4 重组pQE30-K88菌毛蛋白的纯化纯化过程按照Qiagen蛋白质纯化试剂盒说明书进行。
1.2.5 重组蛋白抗血清的制备将含有纯化重组蛋白的缓冲液与弗氏完全(或不完全) 佐剂按照1︰1充分混匀乳化好后, 按照100μg/kg抗原的剂量免疫新西兰大白兔。
首次免疫2周后, 隔周加强免疫。
末次免疫后一周, 颈动脉放血, 于4℃冰箱保存, 析出的透明、淡黄色上清液即为K88-LTB融合蛋白的抗血清。
1.2.6 蛋白质印迹分析分别以K88、LTB单因子血清和自制的重组K88-LTB 融合蛋白抗血清作第一抗体, 按1︰300 稀释；羊抗鼠抗体作第二抗体,按1︰5 000 稀释使用。
2 结果
2.1 K88ac基因的扩增结果
图1: K88、LTB基因PCR扩增结果
1.3 DNA Marker DL2000;
2. K88基因的PCR产物;
4. LTB基因的PCR产物
2.3 重组K88-LTB 融合蛋白基因的表达将鉴定正确重组质粒pQE30-K88-LTB导入到宿主菌中，诱导处理后, 进行SDS-PAGE分析。
结果表明(图2)，重组K88菌毛蛋白亚基基因获得高效表达。
图2 SDS-PAGE电泳结果
1. 加IPTG诱导3h的重组菌;
2. 加IPTG诱导6h的重组菌;
3. 空载体;
4. 蛋白Marker
2.4重组K88-LTB菌毛蛋白抗血清的免疫学检测自制的融合蛋白抗血清和K88、LTB单因子血清做一抗分别对重组工程菌株的总蛋白进行蛋白印记检测。
结果表明(图3),均能检测到大小约
为31kDa的阳性反应条带。
图3 融合蛋白的蛋白印记结果
1,6.蛋白Marker; 2. 阴性血清对照; 3. K88单因子血清为一抗的蛋白印记结果;
4. 重组菌抗血清为一抗的蛋白印记结果;
5.LTB单因子血清为一抗的蛋白印记结果
3 讨论
本项研究通过DNA 重组技术对大肠杆菌的主要粘附因子K88基因进行体外改造，去除了信号肽序列，扩增了K88和LTB基因，构建了重组表达质粒pQE30-K88-LTB，经IPTG诱导后，利用pQE-30载体本身的启动子实现了在大肠杆菌内的高效表达。
经蛋白印记检测表明，表达的抗原蛋白能与大肠杆菌阳性血清和重组蛋白抗血清发生特异性反应。
证明表达的融合蛋白具有免疫原性，并
进一步为构建以乳酸菌为载体的口服基因工程疫苗的研究提供了重要的参考依据。