植物生理生化指标测定

小黑豆相关生理指标测定

1.表型变化：鲜重、株高、主根长和叶面积

鲜重：取处理好的植株，擦干根和叶表面水分，测量整株植物的重量，每个测6个重复。

株高：取处理好的植株，测量从根和茎分隔处到植株最高点的高度，记录，每个测6个重复。

主根长：取处理好的植株，测量从根和茎分隔处到主根最远点长度，记录，每个测6个重复。

叶面积：取处理好的植株，选择第二节段的叶片，测量叶面积，叶面积测量方法是测每个叶片最宽处长度作为叶的长，测叶片最窄处长度作为叶的宽，叶片长和宽的乘积即为叶表面积。每个测6个重复。

2.总蛋白、可溶性糖、丙二醛（MDA）和H2O2含量测定

样品处理：取0.5g样品（叶片要去除叶脉、根要先用清水清洗干净），速在液氮中冻存，在遇冷的研钵中加液氮研磨，然后加入1.5ml的Tris-HCl（pH7.4）抽提，将抽提液转移到2ml的EP管中，于4℃，12000rpm离心15min，取上清，保存在-20℃下，上清液可用于总蛋白、丙二醛（MDA）、可溶性糖和H2O2含量测定。

总蛋白测定（Bradford法）：样品反应体系（800ul H2O+200ul Bradford+5ul 样品），空白对照为（800ul H2O+200ul Bradford）。测定后带入标准曲线Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量，X代表OD595)，计算得出蛋白含量。

可溶性糖测定：样品反应体系（1ml蒽酮+180ul ddH2O+20ul样品提取液）；空白对照（1ml蒽酮+180ul ddH2O），测定OD625后带入标准曲线：Y=0.0345X+0.0204(Y代表OD625，X代表可溶性糖含量（ug）)

蒽酮配方：称取100mg蒽酮溶于100ml稀硫酸（76ml浓硫酸+30mlH2O）.注意：浓硫酸加入水中时，一点一点递加，小心溅出受伤。

丙二醛（MDA）测定：在酸性和高温条件下，丙二醛可与硫代巴比妥（TBA）反应生成红棕色的3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮，在532nm处有最大吸收波长，但该反应受可溶性糖的极大干扰，糖与TBA的反应产物在532nm处也有吸收，但其最大吸收波长在450nm处。采用双组分分光光度法，可计算出MDA含量。MDA的计算公式为：MDA（umol/L）=6.45OD532-0.56OD450.

反应体系为：400ul 0.6%TBA+350ul H2O+50ul样品，80℃水浴10min后，测OD532和OD450。对照用Tris-HCl.

0.6%TBA配方：称取硫代巴比妥0.6g，溶于少量1M NaOH中，待其完全溶解后用10%TCA（称取10gTCA三氯乙酸，溶于100ml蒸馏水中，待其溶解即可）定容至100ml。

H2O2测定（二甲酚橙法）：样品反应体系（82ul溶液A+820ul溶液B （A:B=1:10）+150ul样品提取液），30℃水浴30min，测OD560。标准曲线为:Y=0.01734X-0.0555(Y代表OD560，X代表H2O2含量)

溶液A（200ml）：FeSO4.7H2O 0.1835g；(NH4)2SO4 0.0872g；H2SO4(浓硫酸18M)4.58ml，加水定容。

溶液B（200ml）：二甲酚橙0.0234g；山梨醇6g，加水定容到200ml

3.可溶性蛋白、SOD、POD和CAT活性测定

样品处理：取0.5g样品，速在液氮中冻存，在遇冷的研钵中加液氮研磨，然后加入1.5ml的Tris-HCl（pH7.0）（内含有20%甘油、1mmol/L ASA（抗坏血酸）、1mmol/L DTT（二硫苏糖醇）、1mmol/L EDTA、1mmol/L GSH（还原型谷胱甘肽）、5mmol/L MgCl2）抽提，将抽提液转移到2ml的EP管中，于4℃，12000rpm离心15min，取上清，保存在-20℃下，上清液可用于可溶性蛋白、SOD、POD和CAT含量测定。

1mmol/L的ASA配制：先配制10mmol/L的母液—称取176.13mg的ASA，溶于100ml的Tris-HCl（pH7.0）中即可，然后稀释10倍即可。

1mmol/L的DTT配制：先配制10mmol/L的母液—称取154.25mg的DDT 溶于100 ml的Tris-HCl（pH7.0）中即可，然后稀释10倍即可。

1mmol/L的EDTA配制：用30mmol/L的EDTA稀释30倍即可。

5mmol/L的MgCl2配制：称取MgCl2.6H2O的101.5mg溶于100ml的Tris-HCl （pH7.0），即可。

样品提取液的配制（200ml）：取10mmol/L的ASA母液20ml，10mmol/L 的母液DTT20ml，取30mmol/L的EDTA母液7ml，称取203mg的MgCl2.6H2O，最后再量取20ml的甘油，将最终体积定容到200ml，即可。

可溶性蛋白测定（Bradford法）：样品反应体系（800ul H2O+200ul Bradford+5ul样品），空白对照为（800ul H2O+200ul Bradford）。测定后带入标准曲线Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量，X代表OD595)，计算得出蛋白含量。

SOD测定：SOD活性的测定是根据照光时，体系中产生氧自由基使硝基四唑蓝还原成蓝色甲(在560nm处有一吸收峰), 而超氧化物歧化酶作为氧自由基的清除剂可抑制此反应。•一个酶活单位定义为将硝基四唑蓝的还原抑制到对照一半(50％)时所需的酶量。

14.5mmol/L的dl-甲硫氨酸（分子量149.21）（现用现配）：称取甲硫氨酸216.4mg，加少量Tris-HCl(pH7.0)溶解后，用Tris-HCl(pH7.0)定容到100ml，即可。

30mmol/L的EDTA（292.25）（现用现配）：称取EDTA药品876.75mg，加少量Tris-HCl(pH7.0)溶解后，用Tris-HCl(pH7.0)定容到100ml，即可。

2.25mmol/L的NBT（硝基四唑蓝）（817.6）（现用现配）：称取NBT药品18

3.96mg，加少量Tris-HCl(pH7.0)溶解后，用Tris-HCl(pH7.0)定容到100ml，即可。

60umol/L的核黄素(376.36)（现用现配）：先称取225.81mg的核黄素，加少量50mM Tris-HCl(pH7.4)溶解后，用50mM Tris-HCl(pH7.4)定容到10ml，配制成60mmol/L的母液，然后取100ul到100ml的Tris-HCl(pH7.4)中，即可配制成60umol/L的核黄素。

测酶活的反应介质：测定前在54ml的14.5mmol/L的dl-甲硫氨酸中分别加入EDTA、NBT和核黄素各2ml，此为反应混合液。