单克隆抗体(McAb)制备注意事项

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单克隆抗体制备步骤及注意事项

单克隆抗体制备步骤及注意事项单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAb）是指由单一B细胞克隆分离得到的抗体，其具有高特异性和高亲和力。

制备单克隆抗体的方法主要有杂交瘤技术和重组DNA技术。

以下是单克隆抗体制备的步骤及注意事项。

步骤一：抗原免疫1.选择合适的抗原：根据需要检测的分子或细胞表面标志物，选择合适的抗原。

2.免疫动物：常用的动物有小鼠、兔子等。

选择适合的动物后，根据抗原的种类和免疫动物对该抗原的敏感性，设计免疫方案。

3.免疫计划：免疫计划包括免疫剂量、免疫途径和免疫次数等。

通常先进行原位免疫，然后再以单体或混合抗原进行体内免疫。

步骤二：细胞融合1.收集脾细胞：在最佳时期，解剖免疫动物，取出脾脏。

2.细胞培养：将收集的脾细胞在无菌条件下分散成单个细胞，并在培养基中培养，以供细胞融合使用。

3.准备骨髓瘤细胞：选择合适的骨髓瘤细胞，例如NS0或SP2/0等。

将其培养至对数生长期。

4.细胞融合：在抗原刺激下，将脾细胞与骨髓瘤细胞以一定比例混合，用聚乙烯醇或其他化合物促进细胞融合。

步骤三：细胞筛选与扩展1. HT增重培养：用含有hprt缺陷的培养基筛选融合细胞，以选择杂交瘤细胞。

2. Limited Dilution扩展：以一细胞一孔的方式将杂交瘤细胞进行有限稀释，使其实现单克隆化。

3.细胞培养：将单克隆细胞株移植到培养瓶中，进行培养和扩增。

步骤四：单克隆抗体鉴定1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：用ELISA方法筛选单克隆细胞株，检测其抗原特异性。

2.免疫组织化学检测：将单克隆抗体应用于细胞和组织切片，检测其在特定细胞或组织中的反应。

3.流式细胞术：通过流式细胞仪检测单克隆抗体与特定细胞表面标志物的结合情况。

步骤五：单克隆抗体生产与纯化1.细胞培养：将单克隆细胞株培养扩增至一定程度。

2.抗体收集：将培养上清液进行抗体收集。

3.纯化与浓缩：利用亲和层析、离子交换、凝胶过滤等技术，对抗体进行纯化和浓缩。

单克隆抗体制备流程

单克隆抗体制备流程单克隆抗体是一种来源于单一B细胞克隆的抗体，具有高度的特异性和亲和力，被广泛应用于生物医药领域。

其制备流程主要包括免疫原制备、动物免疫、细胞融合、筛选和鉴定等步骤。

下面将详细介绍单克隆抗体制备的流程。

1. 免疫原制备。

首先需要准备纯化的抗原蛋白，可以是蛋白质、多肽、细胞膜蛋白等。

抗原蛋白的纯度和活性对单克隆抗体的制备至关重要，因此需要进行严格的纯化和活性检测。

通常采用亲和层析、离心、电泳等方法进行抗原蛋白的提取和纯化。

2. 动物免疫。

将纯化的抗原蛋白注射到小鼠或兔子等动物的体内，诱导其产生特异性抗体。

在免疫过程中，需要注意控制免疫程序，监测抗体滴度，以及合理调整免疫方案，以提高单克隆抗体的产量和质量。

3. 细胞融合。

从免疫动物中获取脾细胞或骨髓细胞，与骨髓瘤细胞（如SP2/0、NS-1等）进行融合，得到杂交瘤细胞。

杂交瘤细胞具有较高的产抗体能力，能够长期稳定地分泌单克隆抗体。

4. 筛选和鉴定。

通过ELISA、免疫印迹、细胞免疫荧光等方法对杂交瘤细胞培养上清液进行筛选和鉴定。

筛选出特异性较强的单克隆抗体阳性杂交瘤细胞，并进行亚克隆的鉴定，最终获得单克隆抗体细胞株。

5. 扩大培养和纯化。

将筛选出的单克隆抗体细胞株进行扩大培养，获得大量的单克隆抗体上清液。

然后采用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等方法对单克隆抗体进行纯化，获得高纯度的单克隆抗体制剂。

总结。

单克隆抗体制备流程是一个复杂而又精细的过程，需要在每个环节都严格控制条件，确保单克隆抗体的产量和质量。

通过上述步骤的实施，可以获得高效、高纯度的单克隆抗体，为生物医药领域的研究和应用提供有力支持。

单克隆抗体制备流程

单克隆抗体制备流程单抗制备流程1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。

这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

一、细胞融合前准备(一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。

一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。

下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0.5ml ip↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射)↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。

要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。

商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过0.5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。

单克隆抗体制备步骤及注意事项

单克隆抗体制备步骤及注意事项一、脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。

无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。

2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。

3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。

再以同样的方法洗涤离心一次。

4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。

注意事项：➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。

二、骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。

2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。

3.制备细胞悬液，计活细胞数。

4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。

注意事项：➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。

➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。

➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。

小牛血清的浓度一般在10～20%。

细胞的最大密度不得超过106个/mL。

➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。

细胞的倍增时间为16～20小时。

➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。

➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。

三、细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。

2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。

单克隆抗体的制备原理及方法

单克隆抗体的制备原理及方法单克隆抗体是一种由单一克隆B细胞产生的抗体，具有高度的特异性和亲和力。

它在生物医药领域有着广泛的应用，包括疾病诊断、治疗和生物学研究等方面。

本文将介绍单克隆抗体的制备原理及方法，希望能对相关领域的研究人员有所帮助。

一、制备原理。

单克隆抗体的制备原理主要包括以下几个步骤，抗原免疫、细胞融合、筛选和鉴定、扩增和保存。

首先，通过将目标抗原注射到实验动物体内，诱导其产生特异性抗体。

然后，从免疫动物体内获得B细胞，与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。

接着，通过细胞培养和筛选，筛选出产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。

最后，对所得的单克隆抗体进行扩增和保存，以备进一步的实验和应用。

二、制备方法。

1. 抗原免疫。

选择合适的实验动物，根据抗原的特性和研究需要，选择合适的免疫方案，包括抗原的种类、免疫的途径和次数等。

2. 细胞融合。

将获得的B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。

融合细胞的筛选条件包括杂交瘤细胞的生长条件、培养基的成分和杂交瘤细胞的筛选方法等。

3. 筛选和鉴定。

通过特异性抗原的筛选和鉴定，筛选出产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。

鉴定的方法包括ELISA、免疫印迹、免疫荧光等。

4. 扩增和保存。

对所得的单克隆抗体进行扩增和保存，以备进一步的实验和应用。

扩增的方法包括体外培养、动物体内生长等。

三、实验注意事项。

在进行单克隆抗体的制备过程中，需要注意以下几个方面的实验注意事项，实验动物的选择和管理、抗原的制备和纯化、细胞融合和杂交瘤细胞的培养条件、单克隆抗体的鉴定和保存等。

四、应用前景。

单克隆抗体作为一种重要的生物医药制剂，在疾病诊断、治疗和生物学研究等方面具有广阔的应用前景。

随着生物技术的不断发展，单克隆抗体的制备技术也在不断完善，相信在未来会有更多的应用领域被开发出来。

综上所述，单克隆抗体的制备原理及方法是一个复杂而又具有挑战性的过程，需要研究人员在实验操作中严格把关，以确保所得的单克隆抗体具有高度的特异性和亲和力。

单克隆抗体与基因工程抗体的制备技术

单克隆抗体与基因工程抗体的制备技术掌握：1.杂交瘤技术的基本原理2.抗体工程的基本技术一、单克隆抗体技术（Monoclonal antibody，McAb）（一）概述：克隆（clone）：由单个细胞繁殖、扩增而形成性状均一的细胞集落的过程称为克隆。

多克隆抗体（polyclonal antibody，PcAb）：大多数抗原分子具有多个表位，每一种表位均可刺激机体一个B细胞克隆产生一种特异性抗体。

传统制备抗体的方法是用包含多种表位的抗原物质免疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。

因此，所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，称为多克隆抗体。

单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）：由一个仅识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体，称为单克隆抗体−−→单个克隆→B−）淋巴细胞化学性质单一、特异性强的抗体（单克隆抗体细胞群①哺乳动物在感染病原体后，体内会形成多种相应的B淋巴细胞（浆细胞），因而产生多种特异性抗体。

②每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。

多克隆抗体：劣势：均一性差、特异性低、排斥副反应强。

单克隆抗体：优势：活性专一、特异性强、纯度高、副反应弱。

（二）杂交瘤技术的基本原理1.杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞后同时保持两者的主要特性。

2.细胞的选择与融合：(1)亲本1：经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。

(2)亲本2：肿瘤细胞，通常选择多发性骨髓瘤细胞（Sp2/0）。

其具备以下特点为：①与B细胞为同一体系，可增加融合的成功率②稳定、易培养③自身不分泌Ig或CK④融合率高⑤是HGPRT缺陷株3.融合剂（fusogen）①引起融合的病毒：副粘病毒②化学制剂：聚乙二醇（PEG）③细胞电融合技术：电脉冲（三）选择培养基的应用1.细胞融合是一个随机的物理过程。

融合后可能出现以下情况：①脾细胞与瘤细胞②瘤细胞与瘤细胞③脾细胞与脾细胞④未融合的瘤细胞⑤未融合的脾细胞⑥细胞多聚体形式2.杂交瘤细胞的选择性培养基——HAT培养基细胞的DNA合成一般有两条途径：(1)主要途径：糖和氨基酸→核苷酸→DNA(2) 替代途径：1) 细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：①次黄嘌呤（hypoxanthine，H）②甲氨蝶呤（aminopoterin，A）③胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）2)三者取前缀缩写为HAT培养基3)原理：叶酸作为重要的辅酶参与DNA主要合成过程，氨基喋呤是叶酸的拮抗剂，能阻断该主要合成途径。

单克隆抗体制备步骤及注意事项

单克隆抗体制备步骤及注意事项制备步骤如下：1.免疫原选择：选择具有免疫原性的抗原作为单克隆抗体制备的靶点。

免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类等。

2.动物模型选择：根据免疫原的性质选择适合的动物模型，如小鼠、兔子等。

应考虑动物模型对免疫原的免疫响应情况以及制备成功的单克隆抗体的应用价值。

3.免疫原注射：将免疫原注射到动物模型体内，通常通过多次注射来诱导免疫反应。

在注射前，可以选择适当的佐剂来增强免疫原的免疫原性，如完全弗氏佐剂或委氏佐剂。

4.混合细胞瘤的制备：在免疫原注射后，等待免疫反应充分发生。

细胞瘤可用于细胞融合，产生融合细胞并筛选单克隆抗体。

常用的细胞瘤包括SP2/0和NS-15.细胞融合：将免疫小鼠脾细胞和癌细胞融合成杂交瘤细胞。

融合的常见方法有聚乙二醇融合法和电融合法。

6.肿瘤细胞筛选：将融合细胞播种在含有选择剂的培养基上，通过选择剂来杀死未融合细胞和不产生抗体的融合细胞，留下产生单克隆抗体的细胞。

7.单克隆抗体筛选：对产生的单克隆细胞进行筛选，常用的方法有ELISA和细胞免疫荧光检测。

8.单克隆抗体培养：将筛选出的单克隆细胞进行扩增培养，获得大量的细胞。

9.单克隆抗体纯化：将培养得到的细胞培养上清进行蛋白A/G亲和层析柱纯化，获得纯化的单克隆抗体。

10. 单克隆抗体鉴定：通过Western blot、免疫组化或其它适当的方法对单克隆抗体进行鉴定，确定其特异性和亲和力。

注意事项如下：1.免疫原的选择应根据具体实验要求合理选择，确保其免疫原性和制备成功的单克隆抗体的应用价值。

2.在注射免疫原前，应充分考虑动物模型对所选择免疫原的免疫响应情况，并进行充分的预备实验和试验。

3.免疫小鼠注射免疫原时，需要严格控制免疫原注射的剂量和频率，以避免过度免疫导致不良反应。

4.细胞融合时，应根据实验要求选择合适的融合方法，并注意细胞融合的时间和条件，以获得高效的细胞融合率。

5.单克隆抗体筛选和鉴定时，应使用多种合适的方法进行综合评估，确保获得特异性和亲和力较高的单克隆抗体。

制备单克隆抗体的技术要点

制备单克隆抗体的技术要点1．交瘤技术的技术流程如图4-1所示。

图4 杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本流程2．技术要点1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。

免疫的方法取决于所用抗原的性质。

免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。

2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。

骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。

3）细胞融合融合是杂交瘤技术的关键一步，细胞融合应在无菌条件下，于室温或37℃水浴中进行。

瘤细胞与脾细胞之比为1：8～10，在l～2min内滴加50%PEG 1.0ml 边加边摇，静置1-2min。

然后再在2～3min内缓慢滴加无血清培养液，终止反应。

1000rpm离心10min。

最后加含20%小牛血清的HA T培养液。

将细胞混匀，接种于96孔培养板中培养，每孔加0．1ml，同时还加0．1ml的饲养细胞悬液。

4）阳性克隆的筛选应尽早进行。

通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。

检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。

具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。

常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。

其中ELISA 法最简便，RIA法最准确。

阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。

5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。

克隆化应尽早进行并反复筛选。

这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。

反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。

克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。

（1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。

这种方法操作复杂，效率低，故不常用。

（2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。

单克隆抗体制备标准化操作方案

单克隆抗体制备标准化操作方案(McAb-sop)第一章: 小鼠免疫第二章: 滋养细胞的制备第三章: 细胞融合第四章: 筛选分泌抗体的杂交瘤细胞 (ELISA法) 第五章: 杂交瘤细胞的亚克隆培养第六章: 杂交瘤细胞系的冻存与复苏第七章：腹水制备第八章：附件第一章小鼠免疫小鼠免疫是单抗制备的关键一环,质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证。

好的免疫效果：血清效价达一万以上，脾脏粘连且大小是正常鼠的两倍以上。

小鼠的选择：选择与所用骨髓瘤细胞同源的Balb/c健康雌性小鼠，鼠龄在8～12周。

为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。

免疫原：免疫原的纯度一般并不重要。

但有时免疫原纯度也会造成很大影响，若杂质存在使免疫反应减弱，或筛选方法不能区分对特意性成分反应的抗体及对杂质反应的抗体，以及有些抗原的免疫原性十分强，即便痕迹量的存在，也会影响对所识别抗原的免疫反应。

上述诸情况下使用纯化抗原会更有利。

常用的免疫方案：（一）可溶性抗原初次免疫： 50～100μg蛋白抗原加等体积福氏完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500μl/只小鼠，四周后进行第二次免疫第二次免疫：50～100μg（25～50ug，为初免剂量一半）蛋白抗原（与初免等量），加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500μl/只小鼠两周后采小鼠尾静脉血离心取血清测效价（用ELISA方法检测）效价达一万以上的小鼠融合前三天取抗原25μg（50～100ug，与初免剂量相同）加强免疫，尾静脉注射，注射体积200μl/只300ul/只，效价在一万以下的小鼠继续第三次免疫第三次免疫：50μg蛋白抗原加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠腹腔注射，注射体积500μl/只，小鼠融合前三天取抗原25μg加强免疫，注射体积200μl/只。

（二）颗粒性（细胞）抗原可用5×106~2×107细胞与完全佐剂混合，作皮下或腹腔注射，2~3周后重复一次，但佐剂改为不完全佐剂，再待2~3周后用同样剂量细胞或半量细胞静脉注射，3~4天后取脾融合。

单克隆抗体制备的基本原理

单克隆抗体制备的基本原理一、单克隆抗体的概念抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。

常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。

一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。

即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。

因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。

由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。

因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。

随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。

1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。

这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。

通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。

与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。

单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。

德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。

二、杂交瘤技术（一）杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。

单克隆抗体的制备流程

单克隆抗体的制备流程制备单克隆抗体的流程包括动物的选择与免疫以及细胞融合两个步骤。

在动物的选择方面，纯种BALB/C小鼠是较为理想的选择。

这种小鼠温顺、离窝的活动范围小，体弱，食量及排泄物也较少，适合在洁净的实验室中饲养。

目前，许多实验室都选择纯种BALB/C小鼠来进行杂交瘤技术。

在免疫方案的选择方面，合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功以及获得高质量的单克隆抗体至关重要。

一般来说，根据抗原的特性不同，需要制定不同的免疫方案。

对于可溶性抗原，由于免疫原性较弱，需要加佐剂。

常用的佐剂包括XXX完全佐剂和XXX不完全佐剂。

初次免疫时，抗原的剂量一般为1-50μg，加福氏完全佐剂进行皮下多点注射或脾内注射（一般0.8-1ml，0.2ml/点）。

之后，每隔3周进行一次免疫，剂量同初次免疫，但XXX不完全佐剂进行皮下或腹腔内注射（ip剂量不宜超过0.5ml）。

第三次免疫时，剂量同前两次，不加佐剂，进行腹腔内注射，5-7天后采血测其效价。

如果需要加强免疫，剂量一般为50-500μg，可以进行腹腔内或静脉内注射。

对于可溶性抗原，还有一些更新的免疫方案，如将可溶性抗原颗粒化或固相化、改变抗原注入的途径以及使用细胞因子作为佐剂等。

对于颗粒抗原，免疫性较强，不需要加佐剂就可以获得很好的免疫效果。

以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1-2×107个细胞。

初次免疫时，抗原剂量为1×107/0.5ml，进行腹腔内注射，之后每隔2-3周进行一次免疫，剂量同初次免疫。

如果需要加强免疫，在融合前三天进行1×107/0.5ml的腹腔内或静脉内注射。

在细胞融合前的准备工作中，选择合适的骨髓瘤细胞系也是十分重要的。

骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样可以提高杂交融合率，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量的单克隆抗体。

在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖。

为了促进细胞的生长繁殖，需要加入其他活细胞，这些细胞被称为饲养细胞。

杂交瘤技术制备单克隆抗体

01
A蛋白-Sepharose CL 4B
02
亲和层析法
三、单克隆抗体的应用
检验医学诊断试剂病原微生物抗原抗体的检测肿瘤抗原的检测免疫细胞及其亚群的检测激素测定细胞因子的测定蛋白质的提纯肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术
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HAT培养基： H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA
HAT选择培养基的原理
淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断
01
不需任何特殊设备
02
克隆出现效率高
03
实验室常用方法
04
方法：
05
细胞悬液通过系列稀释
06
每个培养孔含0.5～1个细胞
07
有限稀释法
在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系时，细胞培养过程中随时可能发生细胞污染，分泌抗体能力丧失等 “慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮 “快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复苏
细胞融合
培养骨髓瘤细胞：
对数生长期
浑圆、透亮、均一、排列整齐
避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞 1-2×107
免疫脾细胞的制备： 1-2×108 无菌手术
常用小鼠腹腔巨噬细胞，5-8×106
分泌细胞生长因子
吞噬衰老细胞和微生物
存活一般不超2周，不影响杂交瘤细胞的纯化
01
02
03
04
饲养细胞：
01
骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻

单克隆抗体制备注意事项

单克隆抗体(McAb)制备技术1975年Khler和Milstein首次利用杂交瘤技术生产单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)获得成功，开创了免疫学和分子生物学研究的新纪元，被人们誉为“免疫学中的一场革命”，该项技术具有巨大生命力和发展前景，目前已被成功地用于分子生物学、免疫学、细菌学、病毒学、生物化学、遗传学、药物学等许多领域的研究。

下面以抗空肠弯曲菌共同抗原McAb的制备为例，介绍McAb的制备技术。

一、材料和方法(一) 材料1 PRMI1640培养液 PRMI1640培养基粉104g，双蒸馏水1000ml，抽滤或高压蒸气灭菌，每瓶80ml分装。

2 完全PRMI1640培养液 PRMI1640培养液80ml,1mol/L Hepes2ml,0.2mol/L谷氨酰胺1ml，青、链霉素溶液(1000u/ml)1ml，灭活小牛血清20ml。

3 次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷(HT母液×100)次黄嘌呤1361mg，胸腺嘧核苷387mg，蒸馏水加至100ml。

在45～50℃水浴中溶解，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置-20℃中保存。

4 氨基喋呤(A母液×100)氨基喋呤176mg，蒸馏水90ml，1mol/L NaOH 0.5ml，加蒸馏水至100ml，再加0.5ml 1mol/L HCl中和，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置-20℃中保存。

5 HAT选择性培养基完全PRMI1640培养液100ml,100×HT母液1ml，100×A母液1ml。

用5%NaHCO3调整pH值至7.4左右。

6 HT培养液完全RPMI1640培养液100ml，100×HT母液1ml。

用5%NaHCO3调整pH值至7.4左右。

7 50%聚乙二醇(PEG)溶液将PEG(MW4000)放在试管内加盖，121.3℃高压蒸气灭菌20min。

使用前加入等量的pH值8.2无血清培养液，置56℃混合，直至完全溶解，移置37℃备用。

单抗配制过程护士要注意事项_概述说明

单抗配制过程护士要注意事项概述说明1. 引言1.1 概述本文旨在概述单抗配制过程中护士需要注意的事项。

随着单克隆抗体治疗的普及，单抗配制成为了临床工作中不可或缺的环节。

正确而规范地完成单抗配制过程对于确保治疗效果、保证患者安全至关重要。

因此，本文将介绍在单抗配制过程中，护士应该关注和遵循的几个主要方面。

1.2 文章结构本文按以下几个部分进行阐述：引言、单抗配制过程护士要注意事项、警示和风险提示、术语解释与常见问题解答以及结论。

通过这些部分的详细介绍，读者将能够全面了解在单抗配制过程中所需遵循的步骤、注意事项和相关知识。

1.3 目的本文旨在提供给从事临床工作的医务人员参考，特别是与单克隆抗体治疗有关的护士。

通过详细描述单抗配制过程中需要注意和遵循的各个方面，我们的目标是帮助他们更好地理解并正确执行单抗配制工作，提高临床操作的准确性和安全性。

以上为“1. 引言”部分内容。

2. 单抗配制过程护士要注意事项:2.1 确认患者信息和医嘱:在开始单抗配制之前，护士必须仔细核对患者的个人信息，包括姓名、年龄、性别等，并与医嘱进行一致性确认。

确保所使用的单抗是给予正确的患者，并且符合医生指示。

2.2 准备工作环境和材料:在开始单抗配制之前，护士需要确保工作环境整洁无菌。

清理工作台面并使用消毒剂对其进行消毒。

同时，检查所有所需材料是否齐全并处于有效期内，包括注射器、针头、试剂、溶剂等。

2.3 配置单抗的步骤与规范操作:以下是配置单抗的步骤和规范操作：1) 准备好所有需要用到的药物及溶液。

2) 戴上手套和口罩以确保个人卫生，并避免污染药品。

3) 按照医嘱中规定的剂量准确称量所需药物。

4) 将溶剂转移到药品瓶中，并轻轻摇动使其充分溶解。

5) 将药品抽取并注入空白的注射器中。

6) 顺利进行专用贴纸（标签）的填写以确保能够识别瓶上的药物信息。

7) 在专门的装满可回收容器中丢弃废弃物和使用过的药品容器。

请注意，以上步骤只是一个基本的示例，并且应根据实际情况和医生指示进行调整。

单克隆抗体制备的原理和基本流程

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