鼠源单克隆抗体技术
人源化抗体
人源化抗体人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体通过基因克隆及DNA重组技术等进行改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，同时又降低了其异源性，有利应用于人体。
然而，即使通过嵌合抗体技术把C区替换，人源化抗体V区的互补决定区（CDR）和框架区（FR）也仍有可能诱导相当强的抗体反应。
因此，研究者开始着手将部分CDR和FR区也改造为人抗体序列，以便能进一步提高抗体的人源化程度，降低药物抗体反应发生的可能。
经过数年的研究和改进，人们已经创建并完善了以重构抗体、表面重塑抗体、去免疫化抗体和链替换抗体等为代表的多种人源化抗体技术。
人源化抗体技术重构抗体重构抗体是由异源抗体中和抗原结合相关的残基与人抗体重新剪接构建的抗体，包括互补决定区移植、部分互补决定区移植和特定决定区转移。
构建重构抗体的流程：①克隆分析亲本鼠单抗的V区基因，确定CDR和FR区；②通过数据库检索比对及辅助计算机分子模拟等，找出有最大同源性的人FR 区模板；③确定需要保留和改变的关键残基，经基因合成、真核表达、检测实际结合效果后，对需要保留和改变的关键残基进行相应的修正；④最终获得高亲和力的、具有与亲本鼠单抗相同抗原结合表位的人源化抗体。
表面重塑抗体表面重塑抗体是通过对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造而获得的人源化抗体。
表面重塑抗体的库构建流程：①首先在结构数据库中寻找鼠源的最大同源性蛋白，利用相应的软件并采用分子三维结构分析的方式确定表面残基的位置；②在公用数据库中寻找最大同源性的人抗体序列，在相应的表面残基位置上尝试替换为相应的人抗体残基（替换中要兼顾考虑被替换残基的侧链匹配情况和与CDR是否在空间上紧邻）；③确定替换后的残基种类，即可采用定点突变或基因合成等方法获得人源化后的表面重塑抗体V区基因；④克隆入相应的表达载体进行表达，并分析改造后的抗原结合情况。
去免疫化抗体去免疫化抗体的构建与前面介绍的其他人源化抗体技术类似，其技术流程主要分为以下5个步骤：①建立亲本鼠单抗的三位结构分子模型，通常需要在最大同源性已知三维结构抗体的三维结构模型的引导下，由相应的计算机软件完成；②利用相关的公用数据库，来寻找鼠单抗序列可能的人T细胞识别表位，也允许同时通过体外试验来确定可能的人T细胞识别表位；③通过以人胚系VH和VL基因为模板并与之比对，结合已有的不破坏原抗体结构和抗原结合位点的人源化抗体改造规律，确定需要被替换的残基；④通过分子模拟检验这些被替换的残基；⑤表达改造后的抗体，并检验改造的效果。
单克隆抗体药物研制的关键技术之一：抗体药物靶标筛选
白作 为 抗 体 药 物 靶 标 来研 发 抗 体 药 物 。 这 种 方 法 的缺
点 主 要 集 中在 两 方 面 ：一 是 所 能 得 到 的抗 体 药 物 靶标 的 数 量 极 其 有 限 ，并 且 这 些 靶 标 都 是 十 多年 前 就 已经 发 现 的 ：二 是 历 时 长 ，一 般 需 要 十 到 二 十 年 的 时 间 。 随着 人 类 基 因组 计 划 的完 成 和 蛋 白组 学 研 究 的开 展 ， 发 现 的 新 基 因 和 新 蛋 白 越 来 越 多 ， 人 们 从 中 看 到
克 隆 抗 体 在 疾 病 治 疗 方 面 的作 用 越 来 越 受到 人 们 的重 视 。 目前 美
国Ｆ ＤＡ 已 批 准 了 ３ 种 抗 体 治 疗 药 ２ 物 及 ７ 抗 体 融 合 蛋 白药 物 ， 其 中 种 鼠 单 抗 ３ ，嵌 合 抗 体 ６ ，人 源 化 抗 体 １ 种 ， 人 抗 体 种 种 ３ ９ ， 抗 体 融 合 蛋 白７ ， 有 １ 个 用 于 治 疗 肿 瘤 ， 另 外 种 种 ３
单 克 隆抗 体 药 物 引 导 了生 物 技 术 的 第 二 次 革 新 浪
了希 望 ，但 是 如 何 尽 快从 众 多 的 基 因 中挑 选 出可 用 来
中 国 医药 技术 经 济 与 管理 Ｉ２ １ ． ０２４
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研 发 新 药 的 基 因 ， 如 何 选 择 最 佳 的 技 术 方 法 来 挑 选 这 些 基 因 ，如 何 在 基 因和 蛋 白功 能 尚 未 充 分 了解 之前 开 发 药 物 ，如 何 建 立 抗 体 药 物 靶 标 筛 选 和 抗 体 药物 筛 选 技 术 ， 降 低 研 发 成 本 和 风 险 ， 这 些 都 是 生 物 医 药 产 业 所 面 临 的 重 大挑 战 。
简介鼠源单克隆抗体
张明刚3090101659简介鼠源单克隆抗体众所周知，抗体是于二十世纪三十年代才在世界上通用的词，本质是与相应抗原特异结合的具有免疫功能的球蛋白！而能与抗体特异结合的物质叫做抗原！一、鼠源单克隆抗体的产生历史1、需要证明每种B细胞只能产生单一的抗体2、提取并体外培养骨髓瘤细胞3、解决B细胞与骨髓瘤细胞融合的问题4、如何筛选融合成功的骨髓杂交瘤细胞5、骨髓杂交瘤细胞的体外或体内培养早在1847年，Bence Jones在骨髓瘤患者尿中发现了本周氏蛋白，后被证明是均一的抗体轻链，而生物体产生抗体的基本特点是多样性及不均质性,因而在20世纪50年代之前对这一现象一直没有很合理的解释。
1957年Burnet 提出了抗体产生的细胞系选择学说，认为每个B细胞只能产生一种抗体，且它以独特的受体形式在细胞表面，只与特定的抗原决定簇结合。
后被证明是对的。
后来1965年Sachs等人成功的诱导出骨髓瘤细胞，并且在体外培养成功。
1957年冈田等人用高浓度的仙台病毒是小鼠细胞发生融合。
1975年Kao和Chayluk 提出用聚乙二醇作为融合剂，80年代发现啦电融合技术，解决啦细胞融合问题。
因为细胞融合存在存在A-A、B-B、A-B三中融合方式。
因而如何筛选A-B方式便极为重要。
1964年Littlefiled 创建了融合细胞的筛选方法。
利用两种不同生化缺陷的双亲进行杂交，借助于含有次黄嘌呤、甲氨蝶呤、胸腺嘧啶核苷的HAT选择性培养基选择出了所需杂交细胞。
在这些理论基础上Kohler和Milstein 发表了《分泌特异性抗体融合细胞的持续培养》这篇文章，提出用仙台病毒使小鼠骨髓瘤细胞和经羊红细胞免疫的小鼠脾细胞融合产生的杂交瘤细胞，既具有骨髓瘤细胞永生的特性和脾细胞产生抗羊红细胞抗体的能力。
这一工作为后来制备单抗提供了依据，也标志着单克隆抗体的产生！二、鼠源单克隆抗体的制备1、融合前的准备工作2、融合3、融合后的管理（一）融合前的准备工作（1）准备工作包括组织培养材料的制备、组织培养用水（去离子水）、培养基（高糖DEME、RPMI-1640两种培养基）、血清（常用胎牛血清）、抗生素（2）小鼠免疫用特定的抗原来刺激小鼠，第一次免疫往往产生多价的低亲和力的IgM,随着多次免疫产生了主要为二价的IgG.。
单克隆抗体
单克隆抗体生物技术制药之单克隆抗体【摘要】杂交瘤技术使鼠源单克隆抗体被广泛用于人类疾病的诊断和研究，建立了治疗性抗体的第一个里程碑。
随着生物学技术的发展和抗体基因结构的阐明，应用ＤＮＡ重组技术和抗体库技术对鼠单抗进行人源化改造，先后出现了嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体，它们从不同角度克服了鼠单抗临床应用的不足，使抗体制备技术进入了一个全新的时代。
【关键词】单克隆抗体、分类、制备、纯化、应用【前言】1975年Koehler和Milstein创立了体外杂交瘤技术(Koehler等,1975)，得到了鼠源性单克隆抗体，开始了多克隆抗体走向单克隆抗体的新时代。
与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有无可比拟的优越性，它具有特异性高、效价高、纯度高、理化性状均一、重复性强、成本低并可大量生产等优点。
鼠源性单抗应用于人类有较强的免疫原性，但主要缺陷是诱发人抗鼠抗体（human anti－mouse antibody，HAMA）反应，其次是鼠单抗不能有效地激活人体的生物效应功能，因此限制了其临床应用(Dhar等，2004)。
减少或避免HAMA反应并提高疗效的主要途径是鼠源性单抗人源化，随着对各类抗体结构和氨基酸序列及其变异的种属和功能之间关系的深入了解，而能够利用抗体工程技术对抗体结构进行改造。
抗体的应用经历了非人源抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体，最终到制备全人源单抗的转基因小鼠和噬菌体展示文库等不同的阶段。
1、单克隆抗体定义抗体主要是由B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。
动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。
当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞，被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。
如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂制增殖而形成细胞群，即单克隆。
从鼠源到全人源单克隆抗体制备技术及改造策略的研究进展
从鼠源到全人源单克隆抗体制备技术及改造策略的研究进展摘要：近年来，单克隆抗体是生物制药领域研究和发展最快的领域之一，单克隆抗体具有地耐药性、高效性、专一性等多种优越特性而受到各界关注，随着单克隆抗体制备技术的不断出现，对其稳定性和亲和力提出了更高的要求，本项目从全人源单克隆技术出发，探讨其改造策略以及未来发展方向关键字：鼠源，全人源，单克隆抗体单克隆抗体是一种由人类通过采用各种化学技术或者人工方式制备，由单一b 受体细胞的单克隆抗体细胞产生的一种抗体。
其高度均一，且仅针对某一特定受体抗原上的表位。
单克隆免疫抗体的制备方法主要具有产物纯度高、交叉免疫反应少、制备时间和成本低、结构均一、特异性强等特点，其主要生物学机理功能主要特点是与抗原分子结合后不能产生间接免疫受体分子或直接阻断配体。
当前已有40多种单抗体克隆免疫抗体被广泛用于自身自体免疫功能性疾病、肿瘤和器官移植等各个方面，效果显著。
1全人源单克隆抗体制备技术自从1975年，KOHLER等人通过杂交瘤技术成功获得了具有抗原特异性的鼠源性单克隆抗体，从而开启了单克隆抗体开发的新纪元。
随着多年发展，单克隆抗体已经成为人们疾病诊治的重要工具。
而鼠源性抗体来源于小鼠，在对人体使用时，存在着诸多缺陷，为解决此类问题，全人源单克隆抗体被提出，是未来单克隆抗体的主要研究方向之一，目前使用较为广泛的全人源单克隆抗体制备技术有以下几种：1.1噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术至1990年成功实施以来，经过30年的发展，已经成为该领域应用最广的制备技术之一。
噬菌体抗体库技术的应用原理是使用PCR技术（聚合酶链式反应技术），将人体抗体编码的基因序列通过技术进行扩增，然后将抗体的基因序列插入到噬菌体中的适当位置，并通过建立一个噬菌体抗体库，让人体抗体和另一个噬菌体外壳上的蛋白进行相融，将两者互相融合的蛋白质形式展示在噬菌体的表面。
噬菌体抗体库技术将通过构建好的抗体库与抗原进行结合，并通过抗原与抗体的差异性相互结合的基因组原理，通过筛选，挑出一种能与目的抗原进行结合的噬菌体，在通过噬菌体基因测序，得到一种新的基因序列,并将其通过基因组技术应用于全人源抗体中。
鼠源单克隆抗体人源化进展
自1975年单克隆抗体杂交技术问世以来，鼠源单克隆抗体（mAb）被誉为神奇的子弹，广泛用于肿瘤检测与治疗。
然而，鼠源单抗作为异源性蛋白在人体内可诱鼠单抗人源化成为最早出现的基因工程抗体。
发抗鼠抗体的生成（HAMA），可产生毒性反应，并使mAb在体内消除加快，这严重影响了鼠单抗的治疗效果。
为解决这一难题，从80年代初期发展到现在，鼠单抗人源化经历了如下历程：恒定区人源化→可变区人源化→利用抗体库技术获得完全人源序列（如图）。
1．恒定区人源化--鼠/人嵌合抗体（chimeric antibody）由于异源性Ab的免疫反应约有90%是针对恒定区（C区），要降低mAb的抗原性，必须对Ab的恒定区进行人源化[1]。
其原理使从分泌某mAb的杂交瘤细胞基因组中分离和鉴别出重排的功能性可变区（V区）基因，经基因重组与Ig恒定区基因相拼接，插入到适宜的表达载体中，构成鼠/人嵌合的轻重链基因表达质粒，经转染骨髓瘤细胞，通过筛选即可制备出鼠/人嵌合抗体。
这种嵌合抗体同鼠源抗体比较至少有以下两个优点：首先，它可以按需要对抗体的效应基因进行选择或剪切。
例如人Ig的同种型IgG1和IgG3对介导补体依赖及细胞介导的溶解作用具备优势，因而利用该技术可以拼接不同亚类的人C区基因，来改变抗体的效应功能，使原细胞毒性较低的IgG2a和IgG2b变成细胞毒性较高的IgG1和IgG3，增强抗体的免疫治疗功能，可用来杀死肿瘤细胞。
其次，在治疗中使用人而不是鼠mAb的同种型，大大减小了鼠源mAb作为异种蛋白对人体的免疫原性，它通过避免抗同种型抗体的产生，减少了HAMA的生成。
例如，当鼠对鼠Ig互补决定区（CDR）产生免疫耐受时，用鼠抗-淋巴细胞Ab可以激发抗独特型反应，但相对那些对可变区不耐受的动物来说，该鼠的抗独特型反应被推迟并很微弱[2]。
Lobulio 对鼠/人嵌合抗体在人体内的动力学和免疫反应的研究表明，鼠/人嵌合抗体在人体内的半衰期比mAb长6倍以上。
大鼠单克隆抗体的优势有哪些？
⼤⿏单克隆抗体的优势有哪些？（1）⼤⿏与⼩⿏抗体的组成成分不同，对于⼩⿏异种抗原能使⽤⼤⿏单抗进⾏研究，但不能⽤⼩⿏单抗。
即最⼤的优点是可以⽤于⼩⿏模式⽣物的研究。
由于⼩⿏基因结构、个体发⽣和发育过程、组织细胞结构和功能与⼈类相近，⼩⿏在了解功能基因、疾病基因以及在整体⽣物⽔平上研究复杂的⽣命现象和未知基因的功能⽅⾯已经成为重要的模式⽣物，在⽣物医学领域受到了⼴泛的应⽤。
随着我国⽣物技术的发展，⼩⿏模型的使⽤将会越来越多。
国家科技部在“⼗⼀五”期间将《⼈类重⼤疾病⼩⿏模型的建⽴与应⽤》列为国家科技⽀撑计划重⼤专项，以推进我国在重⼤疾病研究和创新药物的开发研究。
从世界范围看，现在使⽤⼩⿏模型的实验室很多，⽽可⽤于⼩⿏模型研究的⼯具抗体却⼗分有限，缺乏针对⼩⿏的单抗给研究造成了很⼤困难。
可以预见⼤⿏单抗在这⼀领域的需求将快速增长，潜在的市场达数⼗亿美元。
（2）其次，⼤⿏单抗在细胞上清中的产量⽐⼩⿏单抗⾼，⼀般⼤⿏的细胞上清可达70-120ug/ml，⽽⼩⿏单抗只有20-70ug/ml。
由于从腹⽔中提纯抗体含有动物⾃⾝免疫球蛋⽩的污染，⽆法满⾜⼀些要求⾼的实验，⽽且制备腹⽔给动物造成很⼤痛苦，从动物保护和福利⾓度考虑，⽬前国际上很多国家已经禁⽌通过腹⽔⼤量⽣产单抗。
因此利⽤细胞上清提纯抗体将成为⼤势所趋，从⽽⼤⿏单抗⾼产量的优点显得特别突出。
即使是国内仍然普遍采⽤腹⽔⽣产单抗，⼤⿏腹⽔的产量（⼀般30-40ml，最⾼50ml）也⽐⼩⿏的（⼀般7-9ml，最多15ml）要⾼得多。
（3）独特的⼤⿏免疫球蛋⽩⽣化及⽣物学特性，⼤⿏抗体能固定⼈或兔的补体，因此,⼈类K细胞能⽤IgA2b抗体杀死其靶细胞。
（4）⼤⿏⼗倍于⼩⿏，但⼆者均有3周的妊娠期且在同样的年龄成熟,⼤⿏平均每窝产仔7.67只，⽽BALBPc ⼩⿏平均每窝仅5.2只。
（5）⼤⿏单抗可以像⼩⿏单抗⼀样⽤于实验室研究、临床诊断、抗体芯⽚等，还可以经⼈源化发展成为治疗性抗体药物，因此⼀定程度上可替代⼩⿏单抗。
简介单克隆抗体技术及其人源化技术
简介单克隆抗体技术及其人源化技术摘要：单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程，其中人源化抗体是一个重要的里程碑。
鼠源性mAb由于可引起免疫反应而削弱其疗效，因而逐渐被人源化mAb所取代，甚至出现全人mAb取代人源化mAb的趋势。
本文主要介绍了全人mAb的生产方法之一，转基因小鼠技术，并对该项技术的应用作了些展望。
关键词：单克隆抗体；人源化；转基因小鼠；Cre/LoxPAbstract:After its advent, monoclonal antibody has gone an uneven way to its present wide applications in clinical practices, during which the humanized antibody set an important milestone. Murine mAbs are trended to be replaced by humanized mAbs or even human mAbs as murine mAbs’ immuno-side effects may reduce therapeutic effects. The paper briefly introduces tansgenic mice technology as one of generating human mAbs methods as well as share some prospects.Key Words:Monoclonal Antibody(mAb); Humanization; Transgenic Mice; Cre/LoxP一、单克隆抗体背景介绍从1975年英国学者Milstein和德国学者Kohler利用小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞融合[1]，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞既能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
鼠源性单克隆抗体的应用原理
鼠源性单克隆抗体的应用原理一、简介鼠源性单克隆抗体是一种能够特异性识别和结合抗原的蛋白质分子。
它由一种特殊的细胞线通过克隆技术生产出来，具有高度的结构稳定性和亲和性。
鼠源性单克隆抗体在医学研究和临床实践中具有广泛的应用。
二、原理鼠源性单克隆抗体的应用基于其结构和功能上的特点：1.特异性结合：鼠源性单克隆抗体可以与特定的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
这种特异性结合是由抗体的可变区域决定的，可变区域能够识别和结合抗原的特定表位。
这使得鼠源性单克隆抗体能够用于特定抗原的检测和分离。
2.亲和力：鼠源性单克隆抗体通常具有较高的亲和力，即与抗原的结合强度。
这种亲和力可以通过克隆和筛选的过程中进行优化，以选择出具有最佳结合能力的抗体。
高亲和力的鼠源性单克隆抗体能够在低浓度的抗原中快速、稳定地结合，从而提高检测和治疗的灵敏度和效果。
3.多功能性：鼠源性单克隆抗体不仅可以结合抗原，还可以激活免疫细胞，介导细胞毒性，促进细胞凋亡等。
这使得鼠源性单克隆抗体在抗体治疗、免疫研究和癌症治疗等领域具有广泛的应用。
三、应用领域鼠源性单克隆抗体在以下领域有重要的应用：1.诊断和治疗：鼠源性单克隆抗体可以用于特定抗原的检测和诊断。
例如，通过检测特定抗原的单克隆抗体，可以快速、准确地确定疾病的诊断结果。
此外，鼠源性单克隆抗体还可以用于治疗。
它们可以与抗原结合并介导免疫细胞的激活，从而抑制疾病的进展。
2.药物研发：鼠源性单克隆抗体在药物研发中具有重要的作用。
通过使用鼠源性单克隆抗体，可以快速筛选和识别潜在的药物靶点，并评估药物的疗效和安全性。
此外，鼠源性单克隆抗体还可以用作药物的载体，将药物靶向到特定的组织和细胞。
3.生物学研究：鼠源性单克隆抗体在生物学研究中广泛应用。
它们可以用于抗原的定位、蛋白质的表达与鉴定、细胞分型和分离等。
鼠源性单克隆抗体还可以用于免疫组织化学、免疫印迹和免疫沉淀等实验技术。
4.癌症治疗：鼠源性单克隆抗体在癌症治疗中具有重要的应用。
单克隆抗体的应用及其发展
单克隆抗体的应用及其发展摘要：1975 年德国学者Kohler 和英国学者Milstein 发明了杂交瘤技术。
他们成功地将骨髓瘤细胞和产生抗体的B 淋巴细胞融合为杂交瘤细胞，这种合成的杂交瘤细胞稳定、有致瘤性、能产生抗体，其分泌的抗体是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体，故称之为单克隆抗体(简称单抗)。
自从鼠源单抗之后，单抗历经了鼠源性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人源性抗体4 个发展阶段。
近年来随着分子生物学和细胞生物学的发展，单克隆抗体的应用已日益普及，单抗理论几乎应用到生物学研究的每一个区域。
单克隆抗体制备技术的发展也就显得尤为重要。
关键词：单克隆抗体、应用、发展趋势一、单克隆抗体的应用自1975年Kohler和Milstein报道，通过细胞融合建立能产生单克隆抗体的杂交瘤技术以来，这个最基础的具有开创性的理论在生物科学的基础研究以及医学，预防医学，农业科学等领域的广泛应用和实践，充分显示它对生命科学各领域产生的巨大而深远的影响，由于单抗有着免疫血清或抗体无法比拟的优点，迄今全世界已研制成数以千计的单抗，有的已投入市场，有的正在进行应用考核和深入观察。
1.1 单抗在诊断学中的应用单抗应用最广泛的是诊断，主要用于病原诊断，病理诊断和生理诊断，随着微生物学，寄生虫学，免疫学的研究进展，人类对感染性和寄生虫性疾病有了新的认识，一个病原体存在着许多性质不同的抗原，在同一抗原上，又可能存在许多性质不同的属，种，群，型特异性抗原，采用杂交瘤技术，可以获得识别不同抗原或抗原决定簇的单抗，从而可以对感染性疾病和寄生虫病进行快速准确的诊断，同时可以用于调查疾病流行情况，流行毒株或虫株的分类鉴定，为病原的防疫治疗提供资料。
目前应用单抗诊断试剂诊断的人，畜禽，植物等病毒、细菌或寄生虫病已上百种，其中乙肝，狂犬病，乙型脑炎等人兽共患病三十余种；鸡新城疫，马立克，猪瘟等畜禽病二十余种；植物病毒病十余种；人，畜禽细菌病二十余种，弓形虫、疟疾、旋毛虫等寄生虫病三十余种.另外，单抗还成功应用于含量极微的激素、细菌毒素、神经递质和肿瘤细胞抗原的诊断。
单克隆抗体
生物技术制药之单克隆抗体【摘要】杂交瘤技术使鼠源单克隆抗体被广泛用于人类疾病的诊断和研究，建立了治疗性抗体的第一个里程碑。
随着生物学技术的发展和抗体基因结构的阐明，应用ＤＮＡ重组技术和抗体库技术对鼠单抗进行人源化改造，先后出现了嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体，它们从不同角度克服了鼠单抗临床应用的不足，使抗体制备技术进入了一个全新的时代。
【关键词】单克隆抗体、分类、制备、纯化、应用【前言】 1975年Koehler和Milstein创立了体外杂交瘤技术(Koehler等,1975)，得到了鼠源性单克隆抗体，开始了多克隆抗体走向单克隆抗体的新时代。
与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有无可比拟的优越性，它具有特异性高、效价高、纯度高、理化性状均一、重复性强、成本低并可大量生产等优点。
鼠源性单抗应用于人类有较强的免疫原性，但主要缺陷是诱发人抗鼠抗体（human anti－mouse antibody，HAMA）反应，其次是鼠单抗不能有效地激活人体的生物效应功能，因此限制了其临床应用(Dhar等，2004)。
减少或避免HAMA反应并提高疗效的主要途径是鼠源性单抗人源化，随着对各类抗体结构和氨基酸序列及其变异的种属和功能之间关系的深入了解，而能够利用抗体工程技术对抗体结构进行改造。
抗体的应用经历了非人源抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体，最终到制备全人源单抗的转基因小鼠和噬菌体展示文库等不同的阶段。
1、单克隆抗体定义抗体主要是由B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。
动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。
当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞，被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。
如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂制增殖而形成细胞群，即单克隆。
单克隆抗体的制备技术
单克隆抗体的制备技术单克隆抗体是一种特定的抗体，由同一种克隆的B细胞产生，并具有相同的抗原结合特异性。
这种抗体制备技术是通过将B细胞与瘤细胞融合而形成的杂交瘤细胞来实现的。
以下是关于单克隆抗体制备技术的详细解释。
1. 免疫原制备：要制备单克隆抗体，首先需要准备免疫原。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖脂或其他小分子化合物。
免疫原的选择基于所需抗体的特异性。
一般来说，免疫原应具有较高的纯度，并且能够激发免疫系统产生特定的抗体。
2. 免疫动物免疫：接下来，将免疫原注射到实验动物体内，以激发其免疫系统产生抗体。
常用的实验动物包括小鼠、大鼠或兔子。
在注射过程中，免疫原通常与佐剂混合以增强免疫反应。
注射免疫通常在一段时间内进行多次，以确保充分激发免疫系统产生抗体。
3. B细胞的筛选和融合：在动物免疫后，从其脾脏或骨髓中收集B细胞。
这些B细胞是产生抗体的主要细胞类型。
通过在培养基中培养，可以增加B细胞的数量。
然后，将这些B细胞与一种名为骨髓瘤细胞的癌细胞融合。
这种骨髓瘤细胞有着无限增殖的能力，而B细胞则提供了抗体生产所需的特定性。
4. 杂交瘤细胞的筛选：融合后的细胞形成了杂交瘤细胞。
这些细胞具有两个来源的特性，具有骨髓瘤细胞的无限增殖能力和B细胞的抗体产生能力。
为了筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞，可以使用细胞培养基中的特定抗原进行筛选。
只有与特定抗原结合的杂交瘤细胞才能存活和增殖。
5. 克隆的建立：经过筛选后，单个杂交瘤细胞被分离并单独培养，以建立纯化的单个细胞克隆。
这些克隆细胞会持续产生与免疫原结合的特定抗体。
这些单克隆抗体可以通过培养细胞并收集培养上清液来获取。
6. 单克隆抗体的纯化和特性分析：单克隆抗体的纯化是将其从其他细胞产物和杂质中分离出来。
这通常包括离心、过滤和亲和层析等步骤。
纯化后的抗体可以进行各种特性分析，如亲和性测定、特异性测定和功能性分析等。
这些测试可以验证抗体的特异性和效能。
总结：单克隆抗体的制备技术是一种通过将免疫的动物B细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞的方法。
简述单克隆抗体技术的基本原理
简述单克隆抗体技术的基本原理单克隆抗体技术是生物技术领域的一项重要技术，在医药研发、诊断和治疗等方面都有着广泛的应用和前景。
单克隆抗体技术的基本原理是通过选择一种特定的免疫细胞，获取它产生的特异性抗体并使其进行不限制性复制，最终获得具有高度特异性和稳定性的单克隆抗体。
下面将详细介绍单克隆抗体技术的基本原理，包括鼠源性、嵌合型和人源性单克隆抗体技术，以及单克隆抗体生产的流程和应用。
一、鼠源性单克隆抗体鼠源性单克隆抗体是最早使用的单克隆抗体，其制备原理是将鼠类动物免疫一种抗原，收集其脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞，然后将杂交瘤细胞单克隆化，即从杂交瘤中分离出单个克隆细胞并培养扩大。
鼠源性单克隆抗体的优点是制备简单、产量高，但由于小鼠免疫系统与人类的巨大差异，鼠源性抗体往往容易引起免疫原性反应，从而限制了其在临床应用中的使用。
二、嵌合型单克隆抗体为了克服鼠源性单克隆抗体的局限性，研究人员提出了嵌合型单克隆抗体技术。
嵌合型单克隆抗体是由人源性的Fc区和鼠源性的可变区域组成，它可以确保高度特异性和稳定性的又可以降低免疫原性反应。
嵌合型单克隆抗体的制备方法是将人源性的IgG1的Fc片段与包含鼠源性单克隆抗体的可变区域进行基因重组，最终获得嵌合型单克隆抗体。
嵌合型单克隆抗体优点是高度特异性和稳定性、免疫原性反应小。
嵌合型单克隆抗体的制备过程较为复杂，且其效价可能比鼠源性单克隆抗体略低。
随着生物技术的不断发展，研究人员逐渐开始研制具有人源性的单克隆抗体，其能够更加充分地体现在人体内生物学免疫动态，从而降低了潜在的体内免疫原性反应。
人源性单克隆抗体制备方法有两种，一种是在小鼠背景中将人源性单克隆抗体进行筛选和生产，另一种是通过人免疫系统获得人源性单克隆抗体。
人免疫系统产生抗体的原理与小鼠类似，但需要额外进行一系列的筛选和优化步骤，以保证细胞系的干净和稳定性。
由于人源性单克隆抗体与人体内的免疫系统具有良好的兼容性和相似性，因此在临床应用中具有极高的价值。
抗体的制备
单抗：过程：单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。
是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。
制备过程：1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。
一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。
抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
(1)抗原制备。
(2) 免疫动物的选择。
(3)免疫程序的确定。
（免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。
最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。
在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。
）2、细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。
将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。
在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。
在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。
未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。
只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
单克隆抗体制备技术的主要步骤
单克隆抗体制备技术的主要步骤单克隆抗体的制备，就像是一场科学的探险，充满了刺激和挑战，咱们从头说起。
得从小老鼠说起。
这小家伙可不是普通的宠物，而是咱们的英雄。
科学家会给它注射一些特定的抗原，这个抗原就像是个小小的“敌人”，让小老鼠的免疫系统开始工作，嘿，想想就有点好玩。
小老鼠体内开始产生各种抗体，搞得它好像身处战斗的第一线，真是个勇敢的小战士。
得等小老鼠慢慢“发威”，这些抗体就像是它的战斗力，越多越好。
经过一段时间后，咱们就能从小老鼠的体内提取到它的脾脏。
听起来是不是有点吓人？其实这就像是从老鼠身上“挖掘”出宝藏，没什么大不了的。
小老鼠的脾脏里含有大量的B细胞，这些B细胞可是产生抗体的主力军，简直就是抗体工厂。
一旦得到了脾脏，接下来就要把这些B细胞和一些肿瘤细胞融合在一起。
这个步骤可谓是“天生一对”，因为肿瘤细胞能在体外无限增殖，而B细胞则是抗体的“工匠”。
融合之后，咱们就得到了混合细胞，哎哟，真是个“好组合”。
这时候，有些细胞会自顾自地生活，有些则会变得非常专一，开始专门生产一种特定的抗体。
就像一个公司里的员工，有的人忙着做自己的事情，有的人却只关注某一项工作。
经过一番筛选，找到那些生产抗体的细胞，这个过程叫做“克隆”。
从一开始的“乱七八糟”到最后的“精英出战”，真是让人激动！每一批细胞都被放在特定的培养基里，细心照料，让它们茁壮成长。
这些小细胞们在培养基里就像小鱼在水里，游来游去，慢慢地，咱们就能从中筛选出那些最棒的抗体制造者。
咱们就得让这些优质细胞开始大量生产抗体。
把它们放进大大的培养罐里，给它们提供营养，让它们“好好干活”。
这时候，抗体就像流水线上的产品，源源不断地出来，真是让人看得眼花缭乱。
经过几天的忙碌，咱们就能得到一大桶一大桶的抗体，简直是喜从天降。
不过，光有抗体可不行，得把它们从培养液中提取出来。
这就需要一些“化学小把戏”了，用离心机把细胞和培养基分开，然后收集那些抗体。
提取出来的抗体就像是经过千辛万苦的矿工，终于挖到了宝藏。
单克隆抗体在人体内的应用
单克隆抗体在人体内的应用
鼠源单抗人源化
2. 可变区人源化——CDR移植Ab (CDR grafting antibody) 优点：CDR移植抗体中 非人序列含量低（约5%），研究已证实其免疫原性 大大减小。并且在人体内的 血清半衰期延长。 缺点：CDR移植抗体 与抗原结合的能力远不及其亲代鼠源McAb。为了恢
单克隆抗体在人体内的应用
解决上述问题的主要途径便是使 鼠源性单抗人源化 或 研制完全的人 源性抗体
鼠源单抗人源化（嵌合抗体，改型抗体，镶面抗体）、抗体库技 术 及 转基因小鼠技术 成为人源化和人源性抗体制备的三大主要技术，
在治疗性抗体的研制中起到关键作用
单克隆抗体在人体内的应用
鼠源单抗人源化 鼠源单抗人源化经历了如下历程：
HGPRT-
单克隆抗体在人体内的应用
HAT培养基
单克隆抗体在人体内的应用
单克隆抗体在人体内的应用
鼠源性单抗应用于人体时具有较强的免疫原性， 将诱发产生 人抗鼠抗体( human anti-mouse antibody, HAMA ) 反应； 鼠源性单抗通常不能有效地激活人体的免疫反 应，如 补体依赖的细胞毒(CDC)作用 及 抗体依 赖的细胞毒(ADCC)作用。
到扩增，将抗体可变区与恒定区组合得到具有完整功能的全人单克隆抗体。
噬菌体抗体库技术 具有：能够得到完全人源性Ab、分离抗体速度快、简单易
行等优点。
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转基因小鼠技术
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几种已被批准上市的McAb药物
Rituxan ( Rituximab,Mabthera，利妥昔单抗 )，Genentech公司生产，商品 名为美罗华。是1997年第一个被美国FDA批准用于人肿瘤治疗的基因工程 1997年FDA批准Zenapax(daclizumab，PDL公司生产)上市。它是靶向为 抗体，最初被用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤， 总有效率达60%，现在正在探 198C6索年D用2美5于抗国治原FD疗的A抗人批体源准病化抗相单CD关抗3淋，鼠巴是单瘤第抗和1O个K中无T枢3严上神重市经不，系良改统反善淋应了巴的许瘤免多。疫肾抑移制植剂病，人能的有存活。 效减缓器官移植所引起的免疫反应
鼠源单克隆抗体制备通用技术要求
鼠源单克隆抗体制备通用技术要求General technical requirements for preparation of mouse monoclonal antibody目次前言 (II)1 范围 (1)2 规范性引用文件 (1)3 术语和定义 (1)4 技术要求 (1)5 人员要求 (4)6 设施设备与生产环境 (5)7 生产和质量控制 (5)8 抗体制品的检验要求 (7)鼠源单克隆抗体制备通用技术要求1 范围本文件规定了鼠源单克隆抗体（以下简称“鼠单抗”）制备的技术要求、人员要求、设施设备与生产环境、生产和质量控制、抗体制品的检验要求。
本文件适用于鼠源单克隆抗体制品的生产。
2 规范性引用文件下列文件中的内容通过对文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件。
不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 14925 实验动物环境及设施GB/T 25915.1-2010 洁净室及相关受控环境第1部分空气洁净度等级GB 51110 洁净厂房施工及质量验收规范3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
3.1骨髓瘤细胞B-淋巴浆细胞系统恶性增殖所致一种肿瘤。
3.2抗原能诱导机体发生免疫应答的物质。
3.3杂交瘤细胞用骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合而成的细胞。
3.4饲养细胞帮助其它活的细胞在体外细胞培养中生存与繁殖的细胞。
3.5腹水将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于BALB/C小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含有单抗的腹腔积液。
4 技术要求4.1 制备流程4.1.1 鼠单抗制备流程见图1。
4.1.2 图1中骨髓瘤细胞培养、骨髓瘤细胞筛选、细胞融合、HAT选择性培养的制备过程应在洁净室内完成。
4.1.3 4.1.2条中的洁净室空气洁净度等级应符合GB/T 25915.1-2010中ISO7级的要求。
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免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴 母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强 免疫3天后的脾脏。
融合比例： 骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10 融合剂：40%PEG（分子量1000-2000） 融合24小时后加HAT培养液 2周后
免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原 颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原 性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗 原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。 ③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应 答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。
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骨髓瘤细胞系选择要点： 稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT
骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞
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免疫动物
培养骨髓瘤细胞
收集致敏的B淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞
细胞融合
HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞
检测筛选阳性细胞
克隆化培养（反复3-5次）
获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株
McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水）
McAb 纯化及鉴定
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鼠和人的单克隆抗体
抗体分泌杂交瘤是由生长是不确定的骨髓瘤细胞得到 的。一些不能分泌的骨髓瘤细胞系缺乏次黄嘌呤-鸟 嘌呤磷酸核糖基转化酶(HGPRT), 被确定作为融合配 偶。 为了选择成功的融合细胞,细胞须在一个含有次黄嘌呤, 氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的介质中培养,这样只有 融合细胞可以增生。 噬菌体的发展加强了抗体库的筛选,从而为获得人类单 克隆抗体提供了新的手段.
构建多价体Fv抗体
为了增加单价体scFv的亲和性，可以强制缩合肽段 使它们形成多聚体。
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产生系统
细菌,酵母菌,植物,昆虫细胞和哺乳动物细胞的抗体 和抗体片段的产物都有它的表达系统. 细菌：不能装配所有糖基化的抗体,但是可以装配抗 体片段的产物. 酵母菌：可以表达完整的抗体,但含有高的甘露糖和 多分支的寡糖,而且在效应器功能方面有缺陷。 携带杆状病毒群的昆虫细胞植物：它们的抗体都含有 碳水化合物,但结构上和哺乳动物细胞产生的不同. 骨髓瘤细胞和哺乳动物非淋巴样细胞：都可以表达全 功能抗体。
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制备单克隆抗体的基本技术
1 抗原提纯与动物免疫 2 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 3 细胞融合 4 抗体检测 5 杂交瘤的克隆化和冻存 6 McAb的制备 7 单克隆抗体的纯化
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免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提 供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血 清中抗体效价不一定最高。
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单链Fv片段
scFv在非靶组织中滞留时间较短，在血液中清除速 度较快且更易侵入肿块。它有较低的免疫原性，并 较易和蛋白质及肽结合。
单一抗体片段
它和轻链可变区相互作用的粘连的碎片影响了他们 的溶解度和稳定性。它和抗原的亲和力较低而且和 不相干的抗原有交叉反应的趋势。
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杂交瘤技术的理论基础
淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即 一种克隆只产生一种抗体
细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保 持双方亲代细胞的特性
利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞， 并克隆化，制备McAb
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当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融 合在一起。融合细胞含有两个不同的细 胞核，称为异核体，产生具有原来两个 细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交 细胞（hybrid cell）。
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单克隆抗体简介
一般流程
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动画
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基本概念
抗原决定镞（抗原表位） 细胞克隆 多克隆抗体 单克隆抗体
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Antigenic determinant
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人类抗体基因的转移
用同源重组技术删除重链结合区（JH）及Ck区可以遏 制鼠胚胎干细胞上的IgH和IgK的基因位点，这样的小 鼠不产生抗体。
要达到最有效的人类抗体基因转移，需要克隆酵母菌人 工染色体（YACs），因为它可以和大片段的染色体 DNA吻合。
通过融合缺乏鼠HGPRT的ES细胞和包含YAC的酵母菌原生 质球，最终将YAC插入片段整合到鼠的胚系上。被选择 的ES细胞微量注入胚细胞后，产生成功整合人抗体序列 的小鼠，该序列可以在DNA胚系里编码大部分IgH和IgK 基因位点。
第三章 鼠源单克隆抗体
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概述
在过去的二十五年里,利用杂交瘤细胞生产了成千上万 的鼠单克隆抗体.人们用同样的技术从转基因鼠中克隆 人类的抗体，并设计了全长型抗体和重组片段,它们可 以被用于多种诊断和治疗。而且如果他们能在哺乳动 物细胞,牛奶及植物中表达,就可以大量获得.
一个世纪以前,Paul Ehrlich提出了著名的侧链理论来解 释抗原抗体的相互作用.他不久又铸造了一个虚构的短 语”魔弹”来形容抗体对准及中和抗原.七十五年以后 Georges Köhler and César Milstein发明了单克隆抗体技 术,因此为细胞生物学和临床诊断学的巨大进步铺平了 道路.
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转基因小鼠体内的人抗体
免疫后的转基因小鼠可以产生功能上很重要的高亲 和力的人抗体。通过普通的杂交瘤技术可以实现克 隆和生产。 鼠体内的人抗体和人细胞产生的人抗体可以通过他 们糖基化的状态加以区别 。 预期的结果在最初的实验中达到了，该实验利用含 人抗体的小鼠和由鼠分离的杂交瘤细胞和啮齿类动 物细胞系得到人抗体。
改用HT培养液 2周后 改用一般培养 液
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一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开 始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤 细胞系。
可靠的筛选方法须在融合前建立，避免 由于方法不当贻误筛选时机。
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克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。 目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细 胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分 泌细胞分开。
缺陷株 常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 等。 保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤）
防止支原体污染（胎牛血清） 融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的
形态，活细胞计数高于95％ 融合比例 脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环节
需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆 化和扩大培养过程中 常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞 饲养细胞一般在融合前一天制备
是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊 化学基团，又称表位(epitope).
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细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞 集团
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Polyclonal antibody,PcAb：针对多种抗 原决定簇的混合抗体
Monoclonal antibody,McAb:由单个B细胞 克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源 抗体
克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次 克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板
法、显微克隆法 阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体
丢失、变异及污染
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有限稀释法
从阳性分泌孔中收集杂交瘤细胞，经过 逐步稀释，使每孔只有一个细胞。
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单克隆抗体制备具体步骤
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小结
从杂交瘤细胞得到的鼠单克隆抗体提供了生物学临 床研究和诊断的重要工具。仅人类基因组工程预期 能定义大约100，000个编码同等数量蛋白质的功能 基因。 最激动人心的发展之一是人单克隆抗体的治疗上的 应用，它比鼠抗体更有效和安全。Ehrlich的最早 的关于“魔弹”的预言将会被实现。
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HAT选择培养基的原理
HAT选择培养基组分 次黄嘌呤（hypoxanthine,H) 氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂 胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)
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抗原免疫的脾细胞
（B细胞） 1. 抗体分泌（Ig+) 2.HGPRT+在HAT生长
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抗体片段的重组
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由重链可变区和轻链可变区组成的Fv片段，是包 含抗原结合位点的最小免疫球蛋白片段。然而， Fvs的两条链的结合力比Fab段的要低，Fab段也是 由CH1和CL的不变区组成的。VH和VL之间是由肽段 连接的，二硫键和“节和孔突变”可以加固他们 的连接。
单克隆抗体McAb
小鼠骨髓瘤细胞 （B细胞恶性肿瘤）
1.具永生性 2.8-AG筛选出
HGPRT-株
PEG 融合 HAT筛选
脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞） （HGPRT+、Ig+）
8-AG8：杂氮鸟嘌呤
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融合的结果及命运
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未融合的骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
脾-脾杂交细胞
未融合的脾细胞
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细胞DNA合成途经
1.替代途径：次黄嘌呤（H）
HGPRT
2.主要途径：