鼠源单克隆抗体

单克隆抗体McAb


一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开 始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤 细胞系。 可靠的筛选方法须在融合前建立，避免 由于方法不当贻误筛选时机。
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克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。 目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细 胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分 泌细胞分开。 克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次 克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板 法、显微克隆法 阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体 丢失、变异及污染
单链Fv片段
scFv 在非靶组织中滞留时间较短，在血液中清除速 度较快且更易侵入肿块。它有较低的免疫原性，并 较易和蛋白质及肽结合。
单一抗体片段
它和轻链可变区相互作用的粘连的碎片影响了他们 的溶解度和稳定性。它和抗原的亲和力较低而且和 不相干的抗原有交叉反应的趋势。
构建多价体Fv抗体
为了增加单价体scFv的亲和性，可以强制缩合肽段 使它们形成多聚体。
1 2 3 4 5 6 7 抗原提纯与动物免疫 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 细胞融合 抗体检测 杂交瘤的克隆化和冻存 McAb的制备 单克隆抗体的纯化
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免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提 供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血 清中抗体效价不一定最高。 可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完 全佐剂注射小鼠腹腔 2-4周后加强免 疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复 多次） 冲击免疫（融合前3天进行） 选用6-12周龄Balb/c小鼠
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HAT选择培养基的原理

HAT选择培养基组分 次黄嘌呤（hypoxanthine,H) 氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂 胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)
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抗原免疫的脾细胞 （B细胞） 1. 抗体分泌（Ig+) 2.HGPRT+在HAT生长
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含抗体的奶
为了使哺乳动物的乳腺产生乳蛋白以外的其它蛋白 质,可以从超排卵供体的输卵管微量注射数百个复 制体到受精卵而引入胚系序列,使外来基因和DNA融 合,这些基因编码乳房特殊调节序列.经过一段时间 的离体培养,可以把胚胎转移到假孕动物的输卵管 或子宫,并发育到产期.
最初的奶纯化阶段使用普通的操作，也就是移去酪 蛋白和脂肪。澄清的乳清包含高浓度的相关抗体， 它可以通过离子交换和亲和层析来纯化。纯化的抗 体和从哺乳动物细胞培养中得到的抗体没有区别。
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单抗生产的方法： 动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸 或液体石蜡，1周后腹腔注射杂交瘤细胞， 7-10天后出现腹水，无菌采集。
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单抗纯化方法：

盐析 凝胶过滤 离子交换层析 亲和层析法 辛酸沉淀法
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单克隆抗体特性 理化性状高度均一，生物活性专一，只 与一种抗原表位发生反应，特异性强， 纯度高，易于实验标准化和大量制备
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颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很 好的免疫效果 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂 目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的 免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原 颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原 性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗 原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。 ③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应 答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。
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免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴 母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强 免疫3天后的脾脏。 融合比例： 骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10 融合剂：40%PEG（分子量1000-2000） 融合24小时后加HAT培养液 2周后 改用HT培养液 2周后 改用一般培养 液
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产生系统
细菌,酵母菌,植物,昆虫细胞和哺乳动物细胞的抗体 和抗体片段的产物都有它的表达系统. 细菌：不能装配所有糖基化的抗体,但是可以装配抗 体片段的产物.
酵母菌：可以表达完整的抗体,但含有高的甘露糖和 多分支的寡糖,而且在效应器功能方面有缺陷。
携带杆状病毒群的昆虫细胞植物：它们的抗体都含有 碳水化合物,但结构上和哺乳动物细胞产生的不同. 骨髓瘤细胞和哺乳动物非淋巴样细胞：都可以表达全 功能抗体。



淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即 一种克隆只产生一种抗体 细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保 持双方亲代细胞的特性 利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞， 并克隆化，制备McAb
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当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融 合在一起。融合细胞含有两个不同的细 胞核，称为异核体，产生具有原来两个 细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交 细胞（hybrid cell）。
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鼠和人的单克隆抗体
抗体分泌杂交瘤是由生长是不确定的骨髓瘤细胞得到 的。一些不能分泌的骨髓瘤细胞系缺乏次黄嘌呤-鸟 嘌呤磷酸核糖基转化酶(HGPRT), 被确定作为融合配 偶。
为了选择成功的融合细胞,细胞须在一个含有次黄嘌呤, 氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的介质中培养,这样只有 融合细胞可以增生。 噬菌体的发展加强了抗体库的筛选,从而为获得人类单 克隆抗体提供了新的手段.
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小结
从杂交瘤细胞得到的鼠单克隆抗体提供了生物学临 床研究和诊断的重要工具。仅人类基因组工程预期 能定义大约100，000个编码同等数量蛋白质的功能 基因。
最激动人心的发展之一是人单克隆抗体的治疗上的 应用，它比鼠抗体更有效和安全。 Ehrlich 的最早 的关于“魔弹”的预言将会被实现。
小鼠骨髓瘤细胞 （B细胞恶性肿瘤） 1.具永生性 2.8-AG筛选出 HGPRT-株
PEG 融合 HAT筛选
脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞） （HGPRT+、Ig+）
8-AG8：杂氮鸟嘌呤
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融合的结果及命运
未融合的骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 脾-脾杂交细胞
未融合的脾细胞
骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞
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免疫动物 收集致敏的B淋巴细胞
培养骨髓瘤细胞 收集骨髓瘤细胞
细胞融合
HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞
检测筛选阳性细胞
克隆化培养（反复3-5次）
获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株
McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水）
McAb 纯化及鉴定
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制备单克隆抗体的基本技术
Preparation by size: gel filtration chromatography
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单克隆抗体McAb
Preparation by charge: ion exchange chromatography
单克隆抗体简介
一般流程
单克隆抗体McAb
单克隆抗体McAb
单克隆抗体McAb
动画
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基本概念

抗原决定镞（抗原表位） 细胞克隆 多克隆抗体 单克隆抗体
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Antigenic determinant

是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊 化学基团，又称表位(epitope).
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哺乳动物细胞表达
哺乳动物细胞系表达的重组子抗体,暂时或稳定的 决定于所需要的蛋白质量. 为了获得稳定的转染体细胞系,可以广泛的应用中 国仓鼠卵巢细胞(CHO)或鼠骨髓瘤细胞系。利用占 优势的或隐性的扩增标记进行载体扩增后,可以增 加这些细胞的生产力. 骨髓瘤细胞可以被表达载体转染,该载体包含免疫 球蛋白基因和谷氨酰胺合成酶基因,骨髓瘤细胞可 以在游离谷氨酸的介质中培养.
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抗体片段的重组
由重链可变区和轻链可变区组成的Fv片段，是包 含抗原结合位点的最小免疫球蛋白片段。然而， Fvs的两条链的结合力比Fab段的要低，Fab段也是 由CH1和CL的不变区组成的。VH和VL之间是由肽段 连接的，二硫键和“节和孔突变”可以加固他们 的连接。
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第三章 鼠源单克隆抗体
Hale Waihona Puke Baidu
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概述
在过去的二十五年里,利用杂交瘤细胞生产了成千上万 的鼠单克隆抗体.人们用同样的技术从转基因鼠中克隆 人类的抗体，并设计了全长型抗体和重组片段,它们可 以被用于多种诊断和治疗。而且如果他们能在哺乳动 物细胞,牛奶及植物中表达,就可以大量获得. 一个世纪以前,Paul Ehrlich提出了著名的侧链理论来解 释抗原抗体的相互作用.他不久又铸造了一个虚构的短 语”魔弹”来形容抗体对准及中和抗原.七十五年以后 Georges Kö hler and Cé sar Milstein发明了单克隆抗体技 术,因此为细胞生物学和临床诊断学的巨大进步铺平了 道路.

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骨髓瘤细胞系选择要点： 稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT 缺陷株 常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 等。 保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤） 防止支原体污染（胎牛血清） 融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的 形态，活细胞计数高于95％ 融合比例 脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环节 需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆 化和扩大培养过程中 常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞 饲养细胞一般在融合前一天制备
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有限稀释法

从阳性分泌孔中收集杂交瘤细胞，经过 逐步稀释，使每孔只有一个细胞。
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单克隆抗体制备具体步骤
单克隆抗体是将抗体产生 细胞与具有无限增殖能力的骨髓 瘤细胞相融合，通过有限稀释法 及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一 的单克隆细胞系而产生的。
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重组子抗体的细菌产物
离体培养重组后的大肠杆菌的细胞质包涵体可以产生抗 体片段。分子内二硫键形成功能性抗体片段可以分泌到 壁膜间隙甚至大肠杆菌的介质，这需要融合细菌信号肽 到抗体N末端。然而，高水平表达常常导致不溶解的抗 体片段转运到周质腔后积累。 大肠杆菌一些折叠部分的过度表达，不能增加可溶性抗 体片段的产量。
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细胞DNA合成途经
1.替代途径：次黄嘌呤（H）
HGPRT 2.主要途径： 氨 基 酸 谷氨 酰 胺 尿核苷单磷酸
鸟嘌呤核苷酸
（A-）
胸腺嘧啶核苷酸 TK 3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）
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甲氨蝶呤（aminopterin）

甲氨蝶呤是一种叶酸拮抗剂，可阻断 DNA合成的主要途径，这样DNA的合成 需要补救途径来完成。该途径需要次黄 嘌呤（H）、胸腺嘧啶脱氧核苷（T）等 前体存在。而且细胞内要有次黄嘌呤-鸟 嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）、胸腺 嘧啶核苷激酶（TK）存在。若缺乏其中 一种酶，该补救途径便不能发挥作用。
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细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞 集团
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Polyclonal antibody,PcAb：针对多种抗 原决定簇的混合抗体 Monoclonal antibody,McAb:由单个B细胞 克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源 抗体
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杂交瘤技术的理论基础
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转基因小鼠体内的人抗体
免疫后的转基因小鼠可以产生功能上很重要的高亲 和力的人抗体。通过普通的杂交瘤技术可以实现克 隆和生产。 鼠体内的人抗体和人细胞产生的人抗体可以通过他 们糖基化的状态加以区别 。 预期的结果在最初的实验中达到了，该实验利用含 人抗体的小鼠和由鼠分离的杂交瘤细胞和啮齿类动 物细胞系得到人抗体。
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人类抗体基因的转移
用同源重组技术删除重链结合区（JH）及Ck区可以遏 制鼠胚胎干细胞上的IgH和IgK的基因位点，这样的小 鼠不产生抗体。 要达到最有效的人类抗体基因转移，需要克隆酵母菌人 工染色体（YACs），因为它可以和大片段的染色体 DNA吻合。 通过融合缺乏鼠HGPRT的ES细胞和包含YAC的酵母菌原生 质球，最终将YAC插入片段整合到鼠的胚系上。被选择 的ES细胞微量注入胚细胞后，产生成功整合人抗体序列 的小鼠，该序列可以在DNA胚系里编码大部分IgH和IgK 基因位点。