应用活体骨髓瘤细胞制备单克隆抗体

相关主题

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

一共融合６次，每次两种来源的骨髓瘤细胞同时进行融合，每组每次融合３块９６孔细胞培养板。融合率融合生长孔 ÷ 接种孔 × １００％）对比见表１。（融合率％＝
表１两组融合率对比表Ｔａｂｌｅ１Ｃｏｎｔｒａｓｔｔｗｏｇｒｏｕｐｏｆｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｆｕｓｉｏｎ
２００８，２８（１１）２．２融合结果
李永亮等：应用活体骨髓瘤细胞制备单克隆抗体
６５
象。避免措施就是在打小鼠之前用８－氮杂鸟嘌呤处理体外培养的ＳＰ２／０细胞７２ｈ，杀死出现ＨＧＰＲＴ酶逆
６］转Leabharlann Baidu细胞［。利用活体实体瘤制备融合用骨髓瘤细胞
而采取该方法用培养基培养的骨髓瘤细胞进行融合，其成功率相差悬殊，时高时低。为了解决这一问题，史
２］良如等［曾对各种条件，包括骨髓瘤细胞株、融合方
法、ＰＥＧ的型号与使用量、饲养细胞及牛血清等因素进行了摸索，经大量实验证明骨髓瘤细胞活性好坏是融合成功与否的关键所在，并首次采用活体实体瘤细胞进行融合试验，证明该方法能明显提高细胞融合率。本研究在前一段制备单抗工作中出现融合率极低的情况下，利用实体瘤细胞进行融合获得比较满意的结果。在此基础上我们又分别利用实体瘤细胞融合和培养基培养的细胞融合两种方法进行制备单克隆抗体，然后比较两种方法的融合率以及两种方法制备出来的单克隆抗体的相对亲和力，来研究应用活体骨髓瘤细胞制备单克隆抗体方法的可行性。
心１０ｍｉｎ，弃上清。沉淀中加入３～４ｍｌ无血清ＲＰＭＩ１６４０培养液重悬混匀，然后沿管壁缓慢加到装有５ｍｌ淋巴细胞分离液的试管液面上，２０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ。收集云雾状淋巴细胞层后再加入无血清ＲＰＭＩ１６４０培养液用１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ进行细胞洗涤，ＰＭＩ１６４０培养液将细洗涤两次。洗涤完毕用无血清Ｒ胞重悬至１０ｍｌ，混匀计数后备用。１．５体外培养基培养细胞的准备用含２０％特级胎牛血清的ＲＰＭＩ１６４０细胞培养基Ｐ２／０细胞。融合前用８氮杂鸟嘌呤处理ＳＰ２／０培养Ｓ ? 细胞三代以去除ＨＧＰＲＴ酶逆转的细胞突变株，融合时取生长旺盛、形态良好的对数生长期的细胞供融合用。１．６融合按文献［３］的方法进行融合。每组都分别用活体实体瘤细胞和培养基培养细胞进行融合，两组所用的液体试剂都一样。观察统计两种方法的融合率，并进行比较。１．７单克隆抗体的制备ＥＬＩＳＡ方法筛选出阳性杂交瘤细胞克隆，经２～４次有限稀释克隆化后获得稳定分泌特异性ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞株。腹腔注射ＢＡＬＢ／ｃ小鼠（２０ｇ左右）降植０．５ｍｌ／只），１０ｄ后腹腔接种无血清１６４０培养基培烷（１× １０６～３× １０６），注射养的生长良好的杂交瘤细胞（后１０ｄ左右可见小鼠的腹腔明显增大，用针头采集腹水，纯化后分装保存于－８０ ℃。１．８ＭＡｂ的相对亲和力的测定用抗原蛋白分别包被酶标板。从６次融合制备的单克隆抗体中每组随机抽取两株单抗，一共测２４株单抗的相对亲和力。每种腹水单抗从１０ｇ／ｍｌ开始，经倍比稀 μ 释后与包被的蛋白结合，再与工作浓度的羊抗鼠ＩｇＧ ? ＨＲＰ反应，加底物显色后用酶标仪读取Ａ值。以被检单抗的不同浓度为横坐标，以其相应的Ａ值为纵坐标，绘出各株单抗曲线，从各曲线上部趋于平坦段的Ａ值为１００％，查出其Ａ值为５０％相对应的单抗浓度，以此表示
４］各株单抗的相对亲和力［。全部测出后比较两种融合方
法制备出来的单克隆抗体的相对亲和力。
２结果
２．１间接ＥＬＩＳＡ检测抗蛋白抗体最佳条件为：４ ℃ 过夜蛋白包被酶标板，一抗和二抗３７ ℃孵育的时间均为１ｈ，底物３７ ℃ 作用１０ｍｉｎ后终止反应，４５０ｎｍ波长读ＯＤ值。
中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（１１）：６３～６６
檪檪殏
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏
技术与方法
应用活体骨髓瘤细胞制备单克隆抗体
李永亮１田美娜１卢曾军１杨苏珍２刘在新１（１中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州７３００４６）（２河南省农业科学院动物免疫学重点实验室郑州４５０００２）
摘要目的：用活体骨髓瘤细胞ＳＰ２／０做融合提高融合率制备单克隆抗体，并与常规方法比较效果。方法：将ＳＰ２／０细胞打到８周龄的ＳＰＦ级ＢＡＬＢ／ｃ小鼠皮下，待实体瘤生长到直径达２～３ｃｍ时无菌解剖取实体瘤，分离出骨髓瘤细胞进行融合。同时用培养基培养ＳＰ２／０细胞进行融合做比较，分两组进行。比较两种方法的融合率以及两种方法制备出来的单克隆抗体的相对亲和力。结果：做了６次融合，实体瘤融合组融合率为７０．４％，常规法融合组４４．６％，两种方法制备单抗的 ∶ １０００００以上。结论：利用活体实体瘤细胞进行融合能明显提高细胞融合率。相对亲和力均达到１关键词单克隆抗体（ＭＡｂ）ＳＰ２／０细胞活体骨髓瘤细胞融合
檪檪殏
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏
是仙台病毒，但仙台病毒不稳定，制备困难且繁琐，在抗生物保存过程中容易发生活性下降现象。生物素 ? 素系统的方法因工作操作较繁琐、工作量大，在实际工作中不常用。电融合和激光融合的方法需要一定的设备，不适用于大多数实验室。目前常用的就是利用化
［１］学融合剂，应用最广泛的就是聚乙二醇（ＰＥＧ）。然
收稿日期：２００８０６０３修回日期：２００８０９１４９７３ ” 计划资助项目（２００５ＣＢ５２３２０１）国家“ 电子信箱：ｌｉｕｋｅｙ＠ｐｕｂｌｉｃ．ｌｚ．ｇｓ．ｃｎ通讯作者，
融合率第１次第２次第３次第４次第５次第６次平均值２．９％６１．５％７５．３％６２．８％７０．５％７９．２％７０．４％实体瘤组７３．４％４８．３％３９．９％３６．８％５２．８％４６．５％４常规组４４．６％
中图分类号Ｑ８１３单克隆抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ，ＭＡｂ）技术，是将骨髓瘤细胞和经某种抗原诱导产生的特异性Ｂ细胞，经ＰＥＧ等融合剂作用，亦可经电融合或激光融合，形成杂交瘤细胞，然后筛选分离出单个阳性杂交瘤细胞，再将其扩增，最终分离纯化抗体的过程。１９７５年Ｋｏｈｌｅｒ和Ｍｉｌｓｔｅｉｎ首先成功地用杂交瘤技术制备了单克隆抗体，开创了免疫学和分子生物学、乃至整个生命科学研究的新纪元。国内自１９７９年引进杂交瘤技术，经过３０多年的发展，这项技术已经为大多数实验室所掌握。然而许多实验室都不同程度的在制备单克隆抗体过程中遇到融合率低的问题，严重影响了单克隆抗体工程的进展速度。为了提高细胞融合的成功率，各国学者进行了很多尝试。细胞虽在体外培养条件下会自发融合，但频率极低，应用病毒融合剂、化学融合剂和生物素－抗生物素系统的方法会提高融合效率，还可以进行电融合或激光融合。病毒融合剂最早被采用，其中最有效的
６４
中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｖｏｌ．２８Ｎｏ．１１２００８
１材料与方法
１．１材料１．１．１免疫用抗原采用本试验室原核诱导表达并纯化的口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）非结构蛋白。１．１．２实验动物ＳＰＦ级ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，４～８周龄，雌性，由兰州生物制品所实验动物室提供。１．１．３骨髓瘤细胞ＳＰ２／０细胞，属于ＨＧＰＲＴ缺乏的骨髓瘤细胞系，由国家口蹄疫参考实验室保存。１．１．４细胞培养液含２０％特级胎牛血清（四季青）的ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ）细胞培养基，用之前加入青、链霉素（最终浓度为１００单位／ｍｌ）。１．１．５相关试剂弗氏完全和不完全佐剂、ＰＥＧ４０００、ｇＧＨＲＰ均为Ｓｉｇｍａ公司产品；淋巴细胞分山羊抗鼠Ｉ ? 离液为上海恒信化学试剂公司产品；其它ＥＬＩＳＡ相关试剂由国家口蹄疫参考实验室提供。１．２检测抗体间接ＥＬＩＳＡ法的建立抗原蛋白用０．０５ｍｏｌ／ＬｐＨ９．５的碳酸盐溶液稀释％明胶的０．０２ｍｏｌ／Ｌ后包被酶标板，封闭液为含１ｐＨ７．４ＰＢＳ。以正常鼠血清１ ∶ ４００作为阴性对照，蛋白以免疫鼠血清１ ∶ １０００作为阳性对照，用方阵滴定法确ｇＧＨＲＰ）的最佳定包被抗原和酶标记抗体（山羊抗鼠Ｉ ? 组合。结果判定：样品Ａ值大于阴性对照Ａ值的２．１倍判为阳性。１．３ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的免疫第一周将纯化好的蛋白与等量完全弗氏佐剂进行充分乳化制成免疫原，背部皮下多点免疫４周龄ＢＡＬＢ／ｃ雌性小鼠。３周后用不完全弗氏佐剂乳化同等剂量蛋白后进行第２次背部皮下免疫，４周后进行三免。免疫第３次后１０ｄ尾静脉取血测效价大于１ ∶ １０００以上，用灭菌生理盐水稀释同等剂量蛋白尾静脉加强免疫。小鼠加强免疫后第３天取脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合。１．４活体实体瘤细胞的制备首先用８氮杂鸟嘌呤（２０ｇ／ｍｌ）处理三代体外培 ? μ Ｐ２／０细胞，然后在进行抗原三免的前１０天皮下养的Ｓ注射于ＢＡＬＢ／ｃ小鼠背部两侧，每只小鼠注射５× １０５～５× １０６个细胞。１０～１５ｄ后，注射骨髓瘤细胞的部位会长出直径达２～３ｃｍ的实体瘤。融合当天无菌解剖摘取实体瘤，用剪刀将其剪成碎块，然后用注射器内芯在２００目的铜网上研磨过滤。滤液转移到离心管中，加无血清ＲＰＭＩ１６４０培养液到３０ｍｌ，１０００ｒ／ｍｉｎ离