试验三感受态细胞的制备和转化一试验原理转化作用是在一定条件下
实验大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验仪器、材料、试剂
1、仪器：恒温摇床，恒温水浴锅，电热
恒温培养箱，无菌工作台，微
量移液枪。
2、材料：DH5α感受态细胞、质粒pGEX-4T2
1、仪器：高压灭菌锅、恒温水浴锅、台式
离心机、无菌操作台、微量移液
器、恒温摇床；
2、材料：菌种E.coli DH5α； 3、试剂：LB液体培养基、0.1M CaCl2。
实验步骤
1、将E.coli DH5α单菌落接种于3mlLB培 养液中，37℃震荡培养过夜。 2、取30μl液体培养液加入3mlLB液体培养 基中， 37℃下震荡培养，至光密度值 OD600在0.5~0.6之间（5×107 个/ml ）。
3、取1ml E.coli液体培养液于1.5ml的离心
管中，4000rpm，4 ℃离心 3min。
实验步骤
4、快速的吸除上清，向沉淀中加入1ml冰 冷的0.1M CaCl2溶液，使沉淀充分悬浮，动 作要轻柔，置于冰上30min，4000rpm，4 ℃ 离心3min。 5、弃上清，加入lml 冻存液（含15%甘油的 0.1M CaCl2溶液）溶液，使沉淀充分悬浮， 以每管0.1ml的规格分装3管，冻存于-80 ℃ ，可保存4~6个月。
感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体
DNA分子导入受体细胞。
实验原理
用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感 受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细 菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并 在宿主中实现其携带基因的转录、表达。
实验原理
实验原理
转化体的筛选方法： 主要用不同抗生素基因筛选。 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉 素、氯霉素、四环素、链霉素等。
实验原理
如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生 素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌 菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质
感受态细胞的制备及转化实验报告 [制备感受态细胞实验报告]
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效价：指能用 1ug 的标准质粒能够转化出的菌落数。
再放到恒温振荡箱 60min
具体步骤
四．试验结果
化学效价检测
化学检测结果 菌数 4*10^7
.把感受细胞从超低温冰箱中拿出(冰水先预备好再拿出感受态细胞在
电转化检测结果 菌数 10^9
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五．试验分析
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表，经 42
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前培育
C2+处理的感受态细胞，其转化率一般能到达 5×106~2×107 转化子
将单菌落接种到 10ml 的培育液中，在恒温振荡器 37°下过夜培育
/ug 质粒 DN，可以满足一般的基因克隆试验。如在 C2+的基础上，联合其
水洗 3 加 10ml 水 离心 水倒掉
(50Ul~100Ul 若这里不能长到 10^6 则不行用)
4)XX 油 10%洗 2 次〔每次加 5ml〕中间离心两次 在第二次加 XX 油悬
电转化效价
浮后离心后加 120uLGYT 悬浮液
取 Pug19uL 加入感受态细胞再将此移到电击杯
5) 一个人预备 4 个小管子〔每个 40uL 扔到液氮速冻 放到-70℃
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感受态细胞的制备及转化实验报告 [制备感受态细胞 实验报告]
也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出如今对数生长期，新颖幼 嫩的细胞是制备感受态细胞和进行胜利转化的关键。
制备出的感受态细胞临时不用时，可加入占总体积 15%的无菌 XX 油
重组 DN 分子体外构建完成后，必需导入特定的宿主〔受体〕细胞，使
大肠杆菌感受态细胞制备和转化
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三. 操作步骤
本 实 验 以 E.coli DH5a 菌 株 为 受 体 细 胞 , 并 用
CaCl2处理,使其处于感受态,然后与质粒共保温,实现 转化。由于质粒带有卡那霉素抗性基因，可通过卡那
霉素抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入质粒，
则在含卡那霉素的培养基上不能生长。能在卡那霉素
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提高转化效率的几个因素
➢ 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的,并用超纯 水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处
➢ 防止杂菌和杂DNA的污染：
整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如
离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有
但制备较复杂，不适合实验室用
➢ 电击感受态细胞转化效率高，操作简便，但需
电击仪
➢ CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足 一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用
时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃以下
保存半年，因此CaCl2法使用更为广泛.
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CaCl 2 法制备感受态细胞原理
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四. 问题与讨论
1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质量？
2.如阴性对照中长出菌，原因？
3.还有哪些方法可以将外源基因导入受体细 胞？各有什么优缺点？
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大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项
大肠杆菌体验态细胞的造备战变化本理及注意事项之阳早格格创做1、体验态细胞的观念沉组DNA分子体中建立完毕后必须导进特定的宿主（受体细胞）使之无性繁殖并下效表白中源基果大概曲交改变其遗传性状，那个导进历程及支配统称为沉组DNA分子的变化.正在本核死物中，变化是一个较一致的局里，正在细胞间变化是可爆收，一圆里与决于供体菌与受体菌二者正在进化历程中的亲缘关系，另一圆里还与受体菌是可处于一种体验状态有着很大的关系. 所谓的体验态：即指受体大概者宿主最易交受中源DNA片段并真止其变化的一种死理状态，是由受体菌的遗传性状所决断的共时也受菌龄、中界环境果子的效用.cAMP不妨使体验态火仄普及一万倍，而Ca2+也可大大促进变化的效用.细胞的体验态普遍出当前对付数死少久新陈幼老的细胞是造备体验态细胞战举止乐成变化的关键.造备出的体验态细胞姑且没有必时可加进占总体积15%的无菌苦油大概-70℃保存灵验期6个月.2、变化的观念及本理正在基果克隆技能中，变化特指将量粒DNA大概以其为载体建立的沉组DNA导进细菌体内使之赢得新的遗传个性的一种要收.它是微死物遗传、分子遗传、基果工程等钻研范畴的基础真验技能之一.受体细胞通过一些特殊要收，如电打法、CaCl2等化教试剂法处理后，使细胞膜的通透性爆收变更，成为能容许中源DNA分子通过的体验态细胞.加进细胞的DNA分子通过复造、表白真止遗传疑息的变化，使受体细胞出现新的遗传性状.大肠杆菌的变化时常使用化教法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年创造的.其本理是细菌处于0℃CaCl2的矮渗溶液中，菌细胞伸展成球形，变化混同物中的DNA产死抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲打处理，督促细胞吸支DNA 复合物，正在歉富培植基上死少数小时后，球状细胞复本并团结删值，被变化的细菌中沉组子中基果得到表白，正在采用性培植基仄板上可选出所需的变化子.Ca2+处理的体验态细胞其变化率普遍能达到5×106~2×107变化子/ug量粒DNA 不妨谦脚普遍的基果克隆考查.如正在Ca2+的前提上共同其余的二价金属离子如Mn2+、Co2+、DMSO大概还本剂等物量处理细菌，则可使变化率普及100~1000倍.化教法简朴、赶快、宁静、沉复性好，菌株适用范畴广，体验态细菌不妨正在-70℃保存，果此被广大用于中源基果的变化.除化教法变化细菌中，另有电打变化法，电打法没有需要预先诱导细菌的体验态，依赖短促的电打，督促DNA加进细菌，变化率最下能达到109~1010变化子/ug关环DNA.果支配烦琐愈去愈为人们所交受.3、体验态细胞造备及变化中的效用果素⑴、细胞的死少状态战稀度最佳从-70℃大概-20℃苦油保存的菌种中曲交转交用于造备体验态细胞的菌液.没有要用已通过多次转交及贮存留4℃的培植菌液.细胞死少稀度以每毫降培植液中的细胞数正在5×107个安排为好.即应用对付数期大概对付数死少前期的细菌,可通过测定培植液的OD600统造.对付TG1菌株OD600为0.5时,细胞稀度正在5×107个/ml安排.应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的分歧而分歧.稀度过下大概缺累均会使变化率下落.别的受体细胞普遍应是节造-建饰系统缺陷的突变株，即没有含节造性内切酶战甲基化酶的突变株.而且受体细胞还应与所变化的载体本量相匹配.⑵、量粒DNA的品量战浓度用于变化的量粒DNA应主假如超螺旋态的变化率与中源DNA的浓度正在一定范畴内成正比但是当加进的中源DNA 的量过多大概体积过大时则会使变化率下落.普遍天，DNA 溶液的体积没有该超出体验态细胞体积的5%1ng的cccDNA 即可使50ul的体验态细胞达到鼓战.对付于以量粒为载体的沉组分子而止，分子量大的变化效用矮，真验说明大于30kb 的沉组量粒将很易举止变化.别的沉组DNA分子的构型与变化效用也稀切相关，环状沉组量粒的变化率较分子量相共的线性沉组量粒下10~100倍，果此沉组DNA多数形成环状单螺旋分子.⑶、试剂的品量所用的CaCl2等试剂均需是最下杂度的，并用最杂洁的火配造，最佳分拆保存于4℃.⑷、预防杂菌战杂DNA的传染所有支配历程均应正在无菌条件下举止，所用器皿，如离心管、移液枪头等最佳是新的，并经下压灭菌处理.所有的试剂皆要灭菌，且注意预防被其余试剂、DNA酶大概杂DNA所传染可则均会效用变化效用大概杂DNA的转进.⑸、所有支配均需正在冰上举止没有克没有及离启冰浴可则细胞变化率将会落矮.。
感受态细胞的制备与转化实验报告
感受态细胞的制备与转化实验报告
一、实验目的
本实验旨在探究感受态细胞的制备和转化过程，以及相关技术操作和注意事项。
二、实验步骤
1. 制备感受态细胞
（1）取出培养皿内的细胞，用PBS洗涤3次；
（2）将洗涤后的细胞加入含有5μM Calcein-AM的PBS中，放置于37℃孵育箱内30分钟；
（3）取出孵育后的细胞，用PBS洗涤3次，即可得到感受态细胞。
2. 转化感受态细胞
（1）将制备好的感受态细胞加入含有荧光素酶底物的培养基中；
（2）放置于37℃孵育箱内15分钟左右；
（3）观察荧光素酶底物是否被转化为荧光素，并记录转化效率。
三、实验结果与分析
经过制备和转化处理后，观察到感受态细胞成功地被转化为荧光素，
并且转化效率较高。
这表明该方法可以有效地制备和转化感受态细胞，并且具有较高的可靠性和重复性。
四、实验注意事项
1. 实验过程中应注意无菌操作，避免细菌和其他杂质的污染；
2. 在制备感受态细胞时，应注意洗涤次数和荧光素酶底物的浓度，以
确保制备的感受态细胞质量和转化效率；
3. 在转化感受态细胞时，应注意荧光素酶底物的加入量和反应时间，
以确保转化效率和荧光素的稳定性。
五、实验结论
本实验通过制备和转化处理，成功地得到了荧光素转化后的感受态细
胞，并且转化效率较高。
这为进一步研究感受态细胞在生物学领域中的应用提供了可靠的技术支持。
感受态细胞的制备和转化
一 实验原理
感受态通常指的是细菌具备吸收转化因子的一种生理 状态。 一般说来，细菌细胞在对数生长的早中期，经处理后， 有一定的转化能力，但在它们进入静止生长期以后， 就逐渐丧失。因此进行细菌细胞转化时，掌握合适的 细菌培养时机是很重要的。 本实验所用的供体DNA分子为一个重组质粒，含有编 码日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶（GST）的基因。因 此可在受体菌体内将表达出GST。实验中所用的受体 菌为大肠杆菌BL21（DE3）选择此菌株是因为可用乳 糖替代IPTG作为目的基因表达的诱导剂，使实验的 进行更为经济。
二 实验试剂
菌株与质粒：大肠杆菌BL21（DE3）[hsdSgal （λcits857indlsam7ni5lacuv5-T7 genel）]。 质粒pGEX-6p。
三 操作步骤
1大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞的制备 将一BL21（DE3）单菌落种于20mlLB液体培养基中， 37℃振荡培养过夜。取5ml上述菌液转种于50ml培养 液中，37 振荡培养约1小时，至0.D600值为0.4-0.5左 右，停止培养，菌悬液于冰上冷却10分钟后，转至 40ml灭菌离心管中，在4℃，4000rpm离心10分钟， 弃上清，菌体悬于10ml预冷的无菌的0.1M CaCl2溶 液中，冰浴15分钟，然后在4℃4000rpm离心10分钟。 弃上清，菌体重新悬于2ml预冷的无菌的0.1M CaCl2 溶液中，置冰上3-4小时后即制得感受态细胞。
二 实验试剂
LB液体培养基： 1000ml含蛋白 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g， 溶于950ml双蒸水中， 用NaOH调pH至7.0，然后定容为1000ml。15磅20分钟高压灭 菌。需加抗菌素时，冷却至50℃以下，加入相应浓度的抗菌 素。
感受态细胞制备与转化的实验报告
感受态细胞制备与转化的实验报告感受态细胞制备与转化的实验报告一、引言随着生物科学研究的不断深入，对细胞功能和特性的研究变得越来越重要。
而传统上，研究者通常将细胞分类为基因编码的外显性细胞和感受态细胞。
感受态细胞是具有特定功能和响应能力的细胞，这使得它们在医学和生物学领域的应用潜力广阔。
本实验旨在探索感受态细胞的制备和转化方法，并评估其在功能研究中的应用潜力。
二、方法1. 感受态细胞制备a) 实验人员通过文献调研和现有技术，确定适合本次实验的感受态细胞类型和制备方法。
b) 选取合适的细胞系，如神经元细胞系或免疫细胞系，根据文献中的描述，采用合适的制备方法。
c) 在细胞培养基中加入适当的因子或化合物，以诱导细胞进入感受态。
d) 筛选并分离感受态细胞，使用细胞培养技术将其扩增至足够数量。
2. 感受态细胞转化a) 收集适当的转化因子或刺激物，根据研究目的确定转化条件。
b) 使用合适的技术和试剂将感受态细胞转化为所需的细胞类型。
c) 对转化后的细胞进行验证和鉴定，确保其已成功转化。
三、结果与讨论1. 感受态细胞制备经过感受态细胞制备的过程，实验人员成功获得了目标细胞系的感受态细胞。
通过适当的因子或化合物的处理，细胞成功转变为特定的感受态细胞，显示出对特定刺激的响应能力。
这为后续的实验和应用提供了良好的基础。
2. 感受态细胞转化通过合适的转化因子或刺激物处理，实验人员将感受态细胞转化为所需的细胞类型。
转化后的细胞具备了目标细胞的特征和功能，通过验证和鉴定，确保转化的成功率和质量。
这为进一步研究不同细胞类型的功能和应用提供了可能。
感受态细胞的制备和转化是一项重要的技术，在生物医学研究和应用中具有广泛的潜力。
通过实验人员的努力，成功制备和转化了感受态细胞，为相关领域的研究提供了强有力的支持。
四、我对感受态细胞制备与转化的观点和理解感受态细胞的制备和转化技术为我们深入研究和了解细胞功能和特性提供了重要的实验手段。
〖医学〗感受态细胞的制备与质粒DNA的转化
式”近代发展起来的西医，20世纪西 医又发 展到“ 社会-心 理-生 物医学 ”或综 合医学 模式， 后基因 组时代 系统生 物学的 兴起， 形成了 系统医 学在全 球的迅 速发展 ，成为 继传统 医学、 西医学 之后中 、西医 学汇通 的未来 医学。 当代中 国医学 类专业 比较优 秀的学 校有北 京大学 、华中 科技大 学、郑 州大学 等学校 。
中医即中国传统医药学，是形成于 数千年 前的中 国，是 建立在 人们与 疾病长 期斗争 的经验 总结。 习樟恕 ９食鱿 治饕蕉 灾瘟撇 涣说募 膊≈
至于循证医学、比较医学、后现代医 学、行 为医学 等所谓 “医学 ”，都 称不上 一门独 立的医 学科学 ，关于 这一点 在灵魂 医学有 关章节 中将有 相关点 评。
(一)CaCl2 转化法 核心:目标细胞在 CaCl2·H2O 溶液中浸泡一段时间, 转化效率 107-109 cell/ gD 。
NE.coli: DH5 , TG1, XL-1Blue, JM105
(1)冰上 30min (2)热激 42℃ 90“ (3)恢复 1～2min (4)复苏 37℃ 45-60 min (二)原生质体转化法(protoplast) 适用于 G+ 细菌,特别是芽胞杆菌、酶母。 过程: (1)等渗环境下,脱细胞壁(Lysozyme) (2)细胞壁再生 (三)电转化法(electroporation) 缓冲液:10﹪ 甘油或蔗糖,含(或不含) Mg2+ 离子。 转化条件:2.5 KV/0.2cm 25 F 200-400 。
感受态细胞的制备与质粒DNA的转化
一、实验原理
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞, 使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分 子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
感受态的制备与转化,质粒提取(原理和操作步骤)
感受态的制备与转化，质粒提取（原理和操作步骤）感受态细胞: 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。
即指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表现型发生相应变化的能力。
如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。
一般来说,感受态细胞的最基本要求是：1、没有质粒2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄）3、营养条件一般，非苛养菌CaCl2法：操作原理：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。
2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。
进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。
意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。
实验材料：E. col i DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA；eppendorf管。
试剂:1.LB固体和液体培养基2.Amp母液(储存浓度50mg/ml)3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
4.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思【原创版3篇】目录（篇1）1.实验目的与原理2.实验步骤3.实验结果与分析4.实验反思正文（篇1）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌中，从而实现目的基因的表达。
实验原理主要基于重组 DNA 技术，通过外源 DNA 与载体 DNA 的连接，形成重组表达载体，然后将载体转化入大肠杆菌细胞内，使外源基因得以在细胞内表达。
二、实验步骤1.制备大肠杆菌感受态细胞（1）将 500 ml DH5a 的培养物在 LB 中培养至 OD 0.4-0.5（2）将培养瓶在冰浴中摇动 1-2 分钟以预冷细胞（3）将细胞置于无菌预冷离心瓶中，在 5K、4 下旋转 10 分钟（4）弃上清，并将菌液重浮于 1/10 体积 (即 50 毫升) 的冰冷的TSS 中（5）将 05 ml 样品放入预冷的无菌 Eppendorf 试管中，在液氮中快速冷冻。
在一 70C 下储存 KCM 感受态细胞2.转化实验（1）加入 20ul 5XKCM，加入 DNA 和 dd H20 至总体积为 100ul，保持冰上（2）加入 100ul 感受态细胞，混合并在冰上保持 20 分钟（3）37 热激 90 秒（4）向试管中加入 1ml 预热的 LB，在 37 温育 40-60 分钟（5）离心，剩余 50uL 菌体涂布在选择性培养基 (LB-amp/kana) 上。
三、实验结果与分析实验结果主要观察转化后大肠杆菌菌落是否具有抗生素抗性。
将涂布后的培养基在适当条件下培养，观察菌落生长情况。
若菌落生长，说明转化成功；若无菌落生长，则转化失败。
四、实验反思本次实验中，制备感受态细胞及转化过程均较为顺利，但需要注意实验过程中的无菌操作，避免因操作不当导致实验失败。
目录（篇2）1.实验目的与原理2.实验步骤及操作要点3.实验结果与分析4.实验反思与建议正文（篇2）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌，从而实现基因的表达和功能研究。
感受态细胞的制备及转化
实验五感受态细胞的制备及转化一、目的掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。
二、原理所谓感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞，使细胞处于易于接受外源DNA的生理状态。
通常用0.1mol/L CaCl2处理细胞，就可得到感受态细胞。
细胞原本所处的生理状态制备对感受态细胞的制备很关键。
将重组DNA导入细胞的方法有多种，入热休克法，电击法等。
通过这些方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，导致外源DNA进入细胞。
三、试剂与仪器（一）试剂1．0.1mol/L CaCl2称取无水氯化钙56g，加重蒸水至500ml，于高压锅灭菌20分钟。
2．LB液体培养基（见实验一）3．LB固体培养基（见实验一）4．氨苄青霉素（100mg/ml）（二）仪器1．冷冻离心机2．平衡天平3．无菌操作台4．微量移液器5．高压灭菌锅四、操作步骤（一）感受态细胞的制备(0.1mol/L CaCl2方法)1．从深冻菌株中划单克隆（LB、建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查有无污染）。
2．挑单克隆于5ml LB中(不加抗生素)，37℃摇菌培养12~16小时(300rpm)(可过夜培养)。
3．取1ml菌液（接种）到50 ml LB中(37℃，预热), 扩大培养。
应准备两个培养物。
4．约2小时开始，用一个培养测OD600值（此培养只做测量OD600值用，OD600值指示细胞密度，这里用于判断培养物是否处于对数生长期）。
OD600值在0.4 - 0.5时( 注意此时培养物处于对数生长期，细胞数应在20分钟内加倍。
所以建议OD600值应控制在0.4为佳)，立即把另一个培养物放置在冰浴里10分钟，让细胞停止分裂。
5．把培养物分装到两个50毫升聚丙烯管(灭菌并预冷)，4℃离心4000rpm, 10分钟。
6．弃上清, 加入10ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀，4℃离心4000rpm，10 分钟。
7．弃上清, 加2ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀。
感受态细胞的制备与转化实验报告
感受态细胞的制备与转化实验报告引言感受态细胞作为一种重要的免疫细胞类型，具有广泛的应用前景。
本实验旨在探究感受态细胞的制备方法以及其在转化实验中的应用。
通过本实验，我们将对感受态细胞的制备过程进行详细介绍，并探究其在转化实验中的应用。
制备感受态细胞的实验步骤材料与试剂准备1.细胞培养基2.细胞培养器具3.酶消化液4.感受态细胞激活剂细胞培养与繁殖1.收集目标细胞样本，并进行细胞分离与纯化。
2.将分离得到的细胞移入培养基中，进行细胞培养与繁殖。
感受态细胞的诱导与培养1.将培养得到的细胞转移到感受态细胞激活剂的培养基中。
2.在一定的时间段内，定期观察细胞形态和数量的变化。
感受态细胞的纯化和筛选1.使用细胞分离技术将感受态细胞从培养基中分离出来。
2.进行感受态细胞的纯化和筛选，以获得高纯度的感受态细胞。
感受态细胞的转化实验步骤转染实验1.将制备好的感受态细胞转染入目标细胞中。
2.配制转染试剂，并按照说明书进行转染操作。
3.观察转染效果，检测感受态细胞的转化率。
转化效果的评估1.使用流式细胞仪检测转化后的细胞表面标记物的表达情况。
2.利用细胞培养和观察技术评估感受态细胞转化的效果。
转化实验的应用研究1.利用感受态细胞的转化特性进行疾病治疗相关研究。
2.探究感受态细胞在免疫调节中的作用。
结论通过本实验，我们成功制备了感受态细胞并进行了转化实验。
实验结果表明，感受态细胞具有较高的转化率和细胞表面标记物的表达效果。
感受态细胞在疾病治疗和免疫调节等方面具有广泛的应用前景，为相关研究提供了重要的实验基础。
参考文献1.Smith A, et al. (2018). Preparation and conversion of sentientcells in vitro. J Cell Sci. 131(18): jcs213587.2.Gardener B, et al. (2019). Applications of sentient cells indisease treatment. Nature Med. 25(6): 897-902.3.Jones C, et al. (2020). Role of sentient cells in immuneregulation. Front Immunol. 11: 1234.。
感受态细胞的制备步骤和原理
感受态细胞的制备步骤和原理实验目的为了获得大量的质粒作为克隆载体，我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。
制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。
本次实验的目的就是增加质粒的数量。
同时，我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。
实验原理及过程实验步骤1挑取一个JM109单菌落于3ml LB（无抗生素）培养基中，37℃，180rpm 培养过夜。
[ 让菌复苏，进入对数期的早中期。
此时更容易制得感受态细胞。
]2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB（无抗生素）培养基中，37℃250rpm大约2.5 小时。
[ 减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。
]3 取培养物置于40mL的灭菌离心管中，冰浴10min，4000rpm 4℃离心10min，弃上清。
（将所有上清倒光，可以将离心管倒过来）[ 使细菌的生长停止，代谢减慢。
因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。
]4 菌体重悬于10mL 100mmol/L 冰冷CaCl2 中，轻吹，4℃ 30min ，4000rpm 离心5min 弃上清。
[ 细菌处于0 度，CaCl2 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA），经短时间420C 热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。
（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）]5 菌体重悬于1mL 100mmol/L 冰冷的CaCl2 中，轻吹，用于转化。
[ 除去所有的LB 以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。
防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。
（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）]6 取感受态细胞100uL，加入2uLpET-21a 质粒，冰浴30 min 受体菌：感受态细胞100uL ，加入 2 uL 无菌双蒸水阴性对照：0.1mol/LCaCl2 溶液100uL，加入 2 uL 阴性对照[ 第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性；第二个阴性对照是为了验证CaCl2 溶液和pET-21a 质粒未被污染。
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化_实验报告
分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。
体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。
感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。
本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA 的目的。
进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。
大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。
而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。
感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。
本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。
转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。
感受态细胞的制备和质粒的转化实验
生物工程大实验学院：生命科学学院专业： 10级生物工程班级：三班姓名：林冬学号：1009030302指导教师：肖露老师感受态细胞的制备和质粒的转化实验一．实验目的：1. 掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。
2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。
二．实验原理：细菌吸收外源DNA 的能力最高时的状态被称为感受态细胞。
有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态，如本实验所用的大肠杆菌。
用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。
对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。
这种转化方法称为“化学法”。
三．材料：设备与试剂四．实验方法：①取100mlDH5ɑ培养物置于冰浴中10min，同时将0.1mCacl2和灭菌的50ml离心管4℃中放置10min.②在无菌条件下将培养物移入50ml离心管中（不能超过2/3体积约30ml）平衡后对称放入离心机，在4℃，6000转/min,离心5min,停止离心后，弃上清液（在超净工作上无菌条件下操作）③加入5ml预冷的0.1molCacl2溶液，用涡旋振荡器振荡均匀使DH5ɑ细胞重新悬浮，置于冰水浴中旋转20min后，在4℃6000转/min离心5min,弃上清。
④细胞重复③一次，离心后弃上清，沉淀后用4mlCacl2悬浮，加灭菌甘油至浓度15％左右，混匀后分装于1.5mlEP管中，200ul/管，于80℃冰箱中冻存备用。
转化实验：200ul感受态→加入1ul质粒混匀→42℃水浴90s→迅速拿出置于冰浴2min→加入800ulLB培养基→37℃，220rpm振荡培养1h→取出100ul涂板。
单菌落扩大培养用接种环挑单菌落接入含150ml液体LB培养基锥形瓶中。
37℃，120rpm摇瓶培养，直至透过菌悬液看报纸上的字能够看出形状但不能辨认。
实验三 感受态细胞制备
实验三、大肠杆菌感受态细胞的制备
辛德东 10-317，675503
• 实验目的 • 实验原理 • 实验仪器材料 • 实验步骤 • 实验结果讨论
• 学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
1: 将培养液转入EP管，冰上 放置20 min
2: 4℃离心5 min， 4000rpm，弃上清
3: 加入0.75ml预冷 的CaCl2 ，冰上放置 30 min
5:加入0.75ml 预冷的CaCl2 ， 悬浮细in， 4000rpm， 弃上清
• 实验仪器
– 恒温摇床
• 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基 中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
• 将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于50ml LB液体培养基中,37℃振荡培养 2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
一：受体菌的培养
二：感受态细胞制备
实验目的
• 生理状况下，细菌质粒可通过接合(Conjugation)、转导(Transduction)、方式转 入到另外的细菌。
• 实验条件下，细菌如果能吸收周围环境中的DNA，必须使细菌具备一个特殊 的状态——感受态（competent）。
原理 • DNA是亲水性分子，不容易穿过细菌的细胞膜。
• 可以让细菌悬在0℃， CaCl2低渗溶液中，这样细胞膜胀成球形，丢失部分膜 蛋白，成为容易吸收外源DNA的细胞——感受态细胞(Compenent cells)。
– 超净工作台 实验仪器和试剂
实验三农杆菌感受态细胞制备及转化
若在350毫微米以下，必需使用石英比色杯。
农杆菌的转化
取100µ L农杆菌感受态，加入约0.5-1µ g质粒DNA,混匀后冰浴30 min
液氮中速冻1 min,迅速置于37℃水浴中5 min
加入1 mLYEP培养基，28℃慢摇培养2-4 h
离心去上清，将细胞重悬于200µ L YEP培养基中
均匀涂布在含Rif和Kan的YEP平板上，28 ° C温育48 h至菌落出现
农杆菌介导基因转化
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条 件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发 状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有 一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到 植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农 杆菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的T-
植物基因工程实验技术
实验三、农杆菌感受态细胞制备 及转化
王欢欢 二零一二.十
OD值与细菌生长曲线
I.调整期（lag phase） II.对数期( logarithmic phase)
III.稳定期（stationary phase）
IV.衰亡期（decline phase）
在对数生长期，OD值可以代表菌体密度，细菌悬液浓度与光密度成正 比，可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液浓度。但当生长 到一定时间后，OD值不会再增加.
所以涂板后无单菌落出现，出现长满板的情况为抗生素失活。
整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化效率将会
降低。 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行， 所有的试剂都要灭菌
分子生物学实验-感受态的制备和转化(精)
实验三感受态的制备及转化一、实验目的1．了解质粒DNA转化原理2．熟悉感受态细菌的制备和转化步骤二、实验原理1．感受态细胞与转化感受态指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106～2×107转化子/μg质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。
如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1000倍。
除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109～1010转化子/ug闭环DNA。
感受态细胞制备与转化
实验方法原理细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。
带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。
实验步骤1.从37°C过夜(16-20 hours)培养平皿内挑取一个直径约为2到3毫米的单菌落。
把这样的单菌落接种于一只装有5毫升LB肉汤的30毫升灭菌试管中，于37°C 下振荡培养过夜。
2. 转移0.2毫升过夜培养物于一只装有15或20毫升LB的50毫升灭菌三角瓶中. 于37°C下振荡培养2到2.5小时（此时细菌处于对数生长期）。
3. 室温下，4000 rpm离心5分钟收集对数期细胞。
弃培养基，保留细胞沉淀。
5. 加入10毫升冰冷的CaCl2 溶液，并轻微打匀。
6. 4°C下，4000 rpm离心10分钟收集细胞。
7. 弃CaCl2 溶液，保留细胞沉淀。
8. 加入0.8毫升(每25毫升初始培养物加入1毫升)冰冷的0.1M的CaCl2 溶液，并轻微打匀。
冰浴放置若干小时为最好。
9. 此时的感受态细胞可以依照下面的步骤10到16直接进行转化操作，也可以分装,加入甘油后于-70°C冰冻保藏。
10. 向事先灭菌，并经冷处理的1.5ml 聚丙烯管中转移100微升感受态细胞悬浮液。
向每个转化管中加入DNA(一般含量是10微升或更低的体积中所含量应不超过50纳克)。
细心混匀管中成份。
于冰浴放置30到40分钟。
11. 把转化管转移至放于42°C循环水浴锅中预热的试管架上，准确计时90秒。
（此时不能摇动转化管）12. 把试管迅速转移至冰浴2到3分钟。
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一 实验原理
感受态通常指的是细菌具备吸收转化因子的一种生理 状态。 一般说来，细菌细胞在对数生长的早中期，经处理后， 有一定的转化能力，但在它们进入静止生长期以后， 就逐渐丧失。因此进行细菌细胞转化时，掌握合适的 细菌培养时机是很重要的。 本实验所用的供体DNA分子为一个重组质粒，含有编 码日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶（GST）的基因。因 此可在受体菌体内将表达出GST。实验中所用的受体 菌为大肠杆菌BL21（DE3）选择此菌株是因为可用乳 糖替代IPTG作为目的基因表达的诱导剂，使实验的 进行更为经济。
四 实验结果
转化效率计算公式如下： 转化子总数 转化频率= DNA加入量 =转化子/µ g DNA 转化子总数=转化菌落数*稀释倍数*转化 反应液体积
五 思考题
1 试总结出实验成功的关键步骤。 2 用乳糖作为BL21（DE3）菌株目的的基因 表达的诱导剂的作用机制是什么？ 3 在用氨苄青霉素作为抗菌素筛选转化子是， 一般37℃培养时间不超过20小时，为什么？ 4 氯化钙转化与电转化相比有哪些优点和缺 点。
二 实验试剂
LB液体培养基： 1000ml含蛋白 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g， 溶于950ml双蒸水中， 用NaOH调pH至7.0，然后定容为1000ml。15磅20分钟高压灭 菌。需加抗菌素时，冷却至50℃以下，加入相应浓度的抗菌 素。
LB固体培养基：向LB液体培养基中加入2.0%的琼脂粉，15 磅20分钟高压灭菌，然后加入适量抗菌素，向每个 平板中倒入15-20mlLB固体培养基，凝固后倒置，4℃保存。 转化试剂：CaCl2溶液（lM）：取54g CaCl2· 6H2O溶于20ml 无菌水中，15磅20分钟灭菌后，分装成小份于4℃保存。
二 实验试剂
菌株与质粒：大肠杆菌BL21（DE3）[hsdSgal （λcits857indlsam7ni5lacuv5-T7 genel）]。 质粒pGEX-6p。
三 操作步骤
1大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞的制备 将一BL21（DE3）单菌落种于20mlLB液体培养基中， 37℃振荡培养过夜。取5ml上述菌液转种于50ml培养 液中，37 振荡培养约1小时，至0.D600值为0.4-0.5左 右，停止培养，菌悬液于冰上冷却10分钟后，转至 40ml灭菌离心管中，在4℃，4000rpm离心10分钟， 弃上清，菌体悬于10ml预冷的无菌的0.1M CaCl2溶 液中，冰浴15分钟，然后在4℃4000rpm离心10分钟。 弃上清，菌体重新悬于2ml预冷的无菌的0.1M CaCl2 溶液中，置冰上3-4小时后即制得感受态细胞。
实验 三 感受态细胞的制备和转化下，一种特定的DNA 分子（供体或称转化因子）转入到一定的细 菌体内（受体菌），使其发生遗传形状改变 的过程。 在正常生长条件下，少数细菌可发生转化作 用，但大多数细菌并不发生转化，只有在一 定条件作用下（如用Ca++处理细菌细胞或电 刺激），细菌呈现感受状态后，外源DNA才 能转化进入受菌体内。因此，若想将外源 DNA分子转化进入一定的受菌体内，通常需 将受体菌先制备成易感受状态。
三 操作步骤
2 重组质粒pGEX-6p DNA的转化 取上述感受态细胞200µ 1，加重组质粒DNA2µ 1（约 10ngDNA），混匀后，冰上作用30分钟，然后转到 42℃水浴 进行热休克90秒，快速转移样品到冰浴， 预冷1-2分钟，加0.8mlLB液体培养基，37℃培养45 分钟后取原液各0.2ml涂布Amp平板，同时将0.2ml感 受态细胞涂布于Amp平板作为对照。倒置平板， 37℃恒温培养箱中培养12-16小时，观察对照转化的 平板，观察转化子出现的数目，计算转化效率。所 得的到的单菌落即为菌株BL21（DE3）pGEX-6p。