大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法
大肠杆菌电击转化流程
大肠杆菌电击转化流程大肠杆菌感受态制备及电转化流程1.细菌电转化感受态细胞的制备准备：50mL离心管3个10%甘油≥200mL 灭菌蒸馏水≥100mL 冰盒（50mL离心管预冷）2个1）由-80℃冰箱保存的菌种划单菌落，过夜培养16-20h。
晚上将新鲜的菌落接种于装有20mLLB培养基的250mL三角瓶中，37℃振荡培养过夜（约12h），转速控制在200rpm；2）第二天，取过夜培养物以1%接种量（可适当加大）转接入2个含50mLLB培养基的250mL三角瓶中，37℃剧烈振荡（200rpm）培养至OD600约为0.5~0.6；3）将2瓶细菌培养物分别倒入两个预冷的50mL离心管，然后至于冰水混合物中骤冷，一定要骤冷，冰水混合物中冷却至少15min （需要的话这种方式可以存放培养液数小时）3）将离心管于4℃，4000rpm，离心10min，收集菌体，弃上清；4）用50ml灭菌蒸馏水(预冷至4℃)轻轻重悬菌体，先加入少量水重悬菌体，然后把水加满，4℃，4000rpm离心10min，弃上清，再重复一次；5）再用10%甘油重复步骤4）两次，4000rpm离心10min，最后一次倒尽上清后，再用残存管底的甘油悬浮细胞，分装ep管，100μL/支（一般，25mL起始培养物最终用200-250μL l0%甘油悬浮）；6）放入-80℃冰箱中速冻。
或者立即用于电转化。
注意：1）菌种最好是-80℃冻存的，活化后生长状态较好。
2）20ml培养过夜，振荡速度不要过高（一般应该是37℃，300rpm，6h，当天转接，这样一天内工作量太大，这里我们选择过夜培养，时间长，转速控制在200rpm，可以适当缩短时间，前一天晚接种，第二天早转接）3）培养完毕后一定要骤冷，是培养物在短时间内迅速冷却。
冰水混合物中摇动瓶子，大约15min。
4）使用的器皿一点要非常干净，没有化学物质残存，可以先用餐洗净洗，再加入NaOH 固体和蒸馏水产热，最后用蒸馏水反复冲洗干净。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转__[1]...
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由互补产生的β －半乳糖苷酶(LacZ)能够作 用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β －D－ 半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这 个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入 一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会 造成LacZ(β －半乳糖苷酶)基因的失活，破坏α -
步骤需在超净工作台和冰上操作；
4 ．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管
中，在冰上冷却10分钟；
5 ．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；
6 ．弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2
溶液，用移液枪轻轻上下吸动混匀，使细
胞重新悬浮，在冰放置20分钟；
7 ． 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； 8 ．弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2溶液， 用移液枪轻轻上下吸动混匀，使细胞重新悬浮； 9 ．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保 护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存 备用（－80℃）。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 实验原理
• 实验仪器 • 实验试剂
• 实验步骤 • 注意事项
实验原理
进行基因克隆时，体外连接的重组DNA分
子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、 增殖和表达。 感受态细胞(Competent cells):受体细胞经过一 些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后， 细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源 DNA的载体分子通过的感受态细胞。
电转化法制备大肠杆菌感受态细胞 实验步骤
1．前夜接种受体菌（DH5或DH10B）， 挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培 养过夜； 2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB 培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养
大肠杆菌电转化感受态细胞制备.
大肠杆菌电转化感受态细胞制备第一天:1.将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C 下过夜培养2.高温灭菌大的离心瓶(250-500ml以备第二天摇瓶用3.准备几瓶灭菌水(总量约1.5升,保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天:4.转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基的1-2升挡板摇瓶中5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时8.细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天9.用灭菌的冰水重悬浮细胞。
先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升,然后加水稀释至离心管的2/3体积。
10.照上面步骤重复离心,小心弃去上清液11.照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞12.离心,弃上清液13.用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14.照上面步骤离心,小心弃去上清液(沉淀可能会很松散15.用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80°C保存转化方法:1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ,冰上培育约5分钟2. 添加1-3μl DNA ,冰上培育约5分钟3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡中4. 加载P1000,准备好300μl LB 或2xYT5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏(检查时间常数,应该在3以上6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养大肠杆菌感受态细胞制备及转化中的影响因素1、感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后,必须导入特定的宿主(受体细胞,使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA 分子的转化。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
大肠杆菌感受态细胞制备和转化
DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于
细胞表面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收
DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温
一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如
卡那霉素耐药基因得到表达，然后将此细菌培养物
涂在含卡那霉素的选择性培养基上，倒置培养过夜，
即可获得细菌菌落。
④ 涂平板: 将上述菌液摇匀后取80ul涂布于含
Kana的筛选平板上，在菌液完全被培养基
吸收后，37℃倒置培养皿培养12~18h。 2
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分 子实
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生验
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物
学
注意：
1、含卡那霉素的LB固体培养基的配制:将灭菌的 LB固体培养基水浴溶解后冷却至60℃左右,加入 Kana储存液,使终浓度为50-100ug/ml,摇匀后到 平板；
细胞膜的通透性发生暂时性改变, 成为能允许外源 DNA
分子进入的细胞, 称感受态细胞。
2
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1
0
分 子实 生验
物 学
转化
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入 受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它 是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域 的基本实验技术。
2
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实验九，十
大肠杆菌感受态细胞的 制备和转化
一.实验原理
1.概念 感受态细胞
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移
到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种
转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另
一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,
需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后,
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(Jin-Lab)
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(Jin Quan-Wen Lab at XMU)一、大肠杆菌电转化感受态细胞制备：第一天：1. 用枪头或接种环挑取单克隆菌落，接种入盛有5ml LB液体培养基的培养管中，可以准备两管。
37︒C，220rpm，培养过夜（14-16个小时）。
2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）和几个50ml离心管，以备第二天离心收集细菌用。
3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细菌细胞用。
第二天：1．取2-5ml过夜培养液，接入500ml LB (或2XTY)液体培养基中, 控制起始OD600 = 0,03-0,05。
37︒C，220rpm，振摇2-4小时，每半小时测一次OD，当OD 值达到0.4时，停止培养。
2．将菌液在冰上预冷30分钟。
同时，开启离心机，预冷至4︒C。
3．随后将菌液分装到250ml或500ml 预冷的离心瓶中，4︒C，4000rpm离心15分钟。
4．弃上清液，先用少量（如20-50ml）灭菌的冰水重悬沉淀的细胞团，然后加水稀释至离心瓶的2/3体积，充分悬起细胞（可以用手握住瓶体上部震荡！）。
4︒C，4000rpm离心15分钟。
5．弃上清液，加少量灭菌水，重悬菌体，再加水至所有细胞悬浮约500ml冰水中。
4︒C，4000rpm，离心15分钟。
6．弃上清，往离心管中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加10%甘油至终体积约为20ml。
4︒C, 4000rpm, 离心10min。
7．小心弃去上清（沉淀可能会很松散!），加入2ml10%甘油(灭菌，预冷)重悬浮细胞。
8．将悬浮菌液以200ul/管分装于1.5ml的Ep离心管中，在液氮中快速冷冻后，于-70︒C冰箱中保存。
9．检测转化效率：取100 l新鲜制备的感受态细胞，加入0.01ng已知浓度的plasmid DNA，电转化后，将重悬在1ml SOC培养液并复苏的细胞分别取10 l (1%)和100 l (10%)涂板，估测转化效率。
电转化细胞制作及电转步骤
质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤实验原理：利用瞬间高压造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，有利于DNA 等大分子进入。
因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。
109〜1010转化子M g DNA。
,-电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1.前夜接种受体菌（DH5a或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37 C 摇床培养过夜；2.取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37 C摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6 （约2.5-3 小时）；3.将菌液迅速置于冰上。
以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5m l离心管中，在冰上冷却10分钟；5.4C下3000g冷冻离心5分钟；6.弃去上清，加入1500^ l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；7.4C下3000g冷冻离心5分钟8.弃去上清，加入750^ l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9.4C下3000g冷冻离心5分钟10.加入20^ l冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11 .立即使用或迅速置于-70 C超低温保存。
-质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤1.制备选择性培养基平板：在融化的250ml LA培养基中加入250^ l Amp （100mg/ml） , 250 诉l X-gal （20mg/ml）, 25 l IPTG （200mg/ml）,混匀后倒入灭菌培养皿中；2.取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化；3.每管感受态细胞加入1^ l连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上；4.电转化仪选择1800V作为输出电压；5.将要转化的混合物加入预冷的 1 mm的电转化杯中，立即按下按纽电击；6.立即加1ml SOC培养基到转化杯中重悬细胞；7.将细胞转入合适的培养管中37C培养1小时；8.吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板；9.37C培养过夜，观察结果。
实验大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
。
感受态细胞 质粒DNA
蒸馏水
转化体系 100ul
1ul
空白对照 100ul
1ul
实验步骤
2、轻轻混匀，立即放在冰上30min； 3、42℃水浴90s，然后迅速冰浴1-2min； 4、加入0.8ml LB液体培养基，160r/min，37 ℃培养
40min； 5、稀释后，取培养液100ul，涂布于具有50ug/ml
制备感受态旳细胞一般选择对数生长久，新鲜幼嫩旳 细胞是制备感受态细胞和进行成功转化旳关键。常用旳感 受态制备措施涉及KCl、CaCl2等措施；后者因为操作简便 且符合大多数旳分子克隆要求，因而被广泛采用。
实验原理
CaCl2 法旳基本原理： 细菌处于低温（0℃）和低渗旳CaCl2溶液
中，菌体膨胀，细胞膜旳通透性发生了临时性 旳变化，转化混合物中旳DNA形成抗DNase旳 羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，在42℃ 进行短时间旳热激处理，增进DNA旳吸收。
实验原理
2、质粒旳质量和浓度：用于转化旳质粒DNA应主要 是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA旳浓度在一 定范围内成正比，但当加入旳外源DNA旳量过多或 体积过大时，转化效率就会降低。
1ng旳超螺旋态DNA即可使50μl 旳感受态细胞到 达饱和。一般情况下，DNA溶液旳体积不应超出感 受态细胞体积旳5％。
实验原理
CaCl2 法简便易行，用 CaCl2法制备旳 感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA 产生5106-2107个转化菌落。在实际工作 中，每微克有105以上旳转化菌落足以满足 一般旳克隆试验。
制备出旳感受态细胞临时不用时，加入 占总体积15％旳无菌甘油于-70℃，能够保 存六个月。
实验原理
实验大肠杆菌感受态 细胞的制备和转化
大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备
3.大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，同时，DNA在电场力的作用下进入细胞，随后细胞复苏和弥合，从而实现质粒DNA的物理转移。
为避免电击时出现“击穿”，即产生电流，细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。
转化效率为109～1010转化子/µg DNA。
3.1．感受态细胞的制备（1）感受态细胞及材料准备同钙转化感受态细胞的制备相同。
（2）选合适的大肠杆菌在4℃，3000 rpm下离心10min，弃上清液（如需要，沉淀可在4℃的10%甘油中保存1～2天）。
（3）弃上清，离心管中加入少量ddH2O，轻柔的悬浮沉淀后，再将水注满离心杯，4℃，3000 rpm离心10min。
（4）重复步骤（3）1次。
（5）小心弃上清（沉淀可能会很松散），再往离心管中加入少量10%甘油（灭菌，预冷），重悬菌体，再加满10%甘油，4℃，4000 rpm离心10min。
（6）用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2～3ml，将细胞按200μl等份装入微量离心管，放置于－80℃下保存。
（7）按照钙转化感受态细胞方法进行转化效率和抗性检测。
3.2．电转化为了降低离子浓度，待转化的质粒DNA，如质粒或酶连产物，在电转化前应该进行纯化（乙醇沉淀），以下所有步骤都需要保持无菌操作。
（1）从－80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；加入待转化的质粒DNA，冰浴10min；同时将电转化杯进行冰浴。
实际操作中，如果电转化杯浸泡在乙醇中，可提前取出电转化杯，在无菌的超净台上吹干。
（2）打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。
特别注意，不同的电转化杯，所使用的电压不同。
防止电压不够，难以有效转化，以及，电压过高，击爆电转化杯，产生火花，产生危险。
（3）将冰浴后的感受态细胞（含DNA）转移到电转化杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部（注意：其体积以填充电转化杯到电极之间空间即可，具体的用量可参见具体所使用的电转化杯的说明）。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
3. 将菌液快速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作； 4. 吸收1.5ml培养好菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5. 4℃下3000g冷冻离心5分钟； 6. 弃去上清，加入1500 l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
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试验步骤
CaCl2感受态细胞制备试验步骤 电转化法制备大肠杆菌感受态细胞试验步骤
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
第6页
CaCl2感受态细胞制备试验步骤
1. 前夜接种受体菌（DH5 或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中 37℃摇床培养过夜（约16小时）；
2 . 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上猛烈振 荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；
热激法是利用冰凉CaCl2处理对数生长久细 胞, 能够诱导其产生短暂“感受态”, 易于摄取外源 DNA。转化效率为106 ～107转化子/µg DNA。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
第3页
试验仪器
1 . 超净工作台 2 . 低温离心机 3 . 恒温摇床 4 . 恒温培养箱 5 . -70 ℃ 冰箱 6 . 制冰机 7 . 移液器 50ul 、200ul 、1000ul
悬浮；
7. 4℃下3000g冷冻离心5分钟 8. 弃去上清，加入750 l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新
悬浮；
9. 4℃下3000g冷冻离心5分钟 10. 加入20 l冰凉10%甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 11. 马上使用或快速置于-70ºC超低温保留。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理和操作步骤
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5 时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化报告
提高转化效率的几个因素 细胞生长状态和密度
质粒的质量和浓度
试剂的质量
防止杂菌和杂DNA的污染
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提高转化效率的几个因素
细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从 －70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备 感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生 长期时为好，可通过监测培养液的 OD600 来控制。 DH5α 菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同 ),这时比较合适。密 度过高或不足均会影响转化效率。
50ng,体积不超过10μ l)，轻轻摇匀，冰上30-
40min；
A.质粒DNA组：10µl 质粒DNA +50µl感受态细胞悬
液
B.空白对照组:10ul 无菌水＋50µl感受态细胞悬
液
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② 42℃水浴中热击90秒（勿摇动），热击后 迅速置于冰上冷却2min； ③ 向管中加入400μl LB液体培养基(不含卡那 霉素)，混匀后37℃，180rpm振荡培养 40min，使细菌恢复正常生长状态，并表达 质粒编码的抗生素抗性基因(卡那霉素 )； ④ 涂平板：将上述菌液摇匀后取80ul涂布于含 Kana的筛选平板上，在菌液完全被培养基 吸收后，37℃倒置培养皿培养12~18h。 2
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提高转化效率的几个因素
质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。 转化效率与外源 DNA的浓度在一定范围内成正比 ,但 当加入的外源 DNA 的量过多或体积过大时 , 转化效率 就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞 达到饱和。一般情况下 ,DNA 溶液的体积不应超过感
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(Jin-Lab)随着基因工程和生物技术的发展，基因克隆和DNA转化技术已经成为生命科学研究的基本技术之一。
大肠杆菌是广泛应用的微生物基因克隆和表达系统，其中电转化是一种常用的DNA转化方法。
在电转化过程中，使用感受态细胞进行DNA 转化可以提高转化效率和获得更多的转化子。
因此，制备感受态细胞及其转化方法研究对开展基因克隆和表达等方面的研究具有非常重要的意义。
感受态细胞制备方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为Luria-Bertani（LB）培养基。
2.细胞质壁分离方法将DH5α菌株经过预培养后，用LB培养基洗涤一次，收集菌落后进行以下步骤。
•在含有1mM EDTA的冷0.5M葡萄糖缓冲液中洗涤细胞三次；•加入60mg/mL的亚胺青钾（IPTG）处理4小时取得感受态细胞。
3.细胞计数及保存使用平板计数器计数，将细胞用LB培养基稀释至约1 x 10^9/mL，添加10% v/v的甘油保存在-80℃。
电转化方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为SOC培养基（Super Optimal broth with Catabolite repression）。
2.DNA处理方法将所需构建质粒经过酶切和纯化等操作处理后，加入所需菌株中进行转化。
3.转化操作•取感受态细胞保存液用LB培养基洗涤3次；•加入所需DNA，静置30分钟使其与感受态细胞充分结合；•以1mm间隔安置两条电极在电转化仪中；•用微管脚吸取约50μL细胞转移到抗电极侧的铝箔上，用蒸馏水润湿铝箔；•将铝箔上细胞转移到电极之间的空间内，使用脉冲电压脉冲电压 1.8 kV, 25 uF, 200Ω电阻取得转化产物。
以上是大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化的实验步骤。
感受态细胞制备方法和电转化方法的优化将提高转化效率和转化获得率，从而为生命科学研究提供更好的服务。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验原理及步骤
实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验原理体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。
研究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。
大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。
用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。
CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
宿主细胞一般是限制―修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。
若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。
从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。
本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。
将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。
转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。
二、仪器及试剂1. 仪器：恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。
2. 材料E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。
3. 试剂：LB培养液（1L）：胰蛋白胨 10g酵母粉 5gNaCl 10g（高盐）或5g（低盐）氨苄青霉素（Ampicillin） 100mg/ml在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。
实验-大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验仪器、材料、试剂
1、仪器：恒温摇床，恒温水浴锅，电热
恒温培养箱，无菌工作台，微
量移液枪。
2、材料：DH5α感受态细胞、质粒pGEX-4T2
3、试剂：LB液体及固体培养基、氨苄青霉
素Amp（50mg/ml）。
实验步骤
1、每100ul感受态细胞加入1ul质粒DNA， 同时做一个空白对照（由第一组完成） 。
Amp的平板上，直至液体被培养基全部吸收；
6、平板倒置，37 ℃，过夜培养。
时间。
4、悬浮细胞时动作要轻柔，以免造成菌
体破裂，影响转化。
思考题
1、影响感受态细胞转化效率的因素有哪
些？
内容二：质粒DNA的转化与转化体筛选
1
实验目的 实验原理
实验仪器、材料、试剂
2
3
4
实验步骤
注意事项 思考题
5
6
实验目的
了解转化的概念及其在分子生物学研究中
的意义。
学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞及筛 选重组子的方法。
1、仪器：高压灭菌锅、恒温水浴锅、台式
离心机、无菌操作台、微量移液
器、恒温摇床；
2、材料：菌种E.coli DH5α； 3、试剂：LB液体培养基、0.1M CaCl2。
实验步骤
1、将E.coli DH5α单菌落接种于3mlLB培 养液中，37℃震荡培养过夜。 2、取30μl液体培养液加入3mlLB液体培养 基中， 37℃下震荡培养，至光密度值 OD600在0.5~0.6之间（5×107 个/ml ）。
感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体
DNA分子导入受体细胞。
实验原理
用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感 受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细 菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并 在宿主中实现其携带基因的转录、表达。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告引言：大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和基因工程领域。
在这个实验报告中，我们将讨论大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验。
实验目的：本实验的目的是制备大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
通过这个实验，我们可以研究细菌的基因表达和遗传变异。
实验材料和方法：1. 大肠杆菌培养基：含有适当营养物质的LB培养基。
2. 大肠杆菌感受态细胞：选择性培养基（如含有抗生素的培养基）筛选得到的细菌株。
3. 目标DNA：从其他生物体中提取的DNA片段。
4. 热激转化装置：用于将DNA转化到感受态细胞中的装置。
5. 热激转化条件：将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，然后在热激转化装置中进行热冲击。
实验步骤：1. 制备感受态细胞：从大肠杆菌培养基中挑取一小部分细菌，接种到含有适当抗生素的选择性培养基中。
在37摄氏度下孵育过夜。
2. 提取目标DNA：从其他生物体中提取目标DNA片段，可以使用商业提取试剂盒或自制提取试剂进行操作。
3. 转化实验：将感受态细胞取出，进行适当的处理，如洗涤和离心。
将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，并在热激转化装置中进行热冲击。
然后将细菌培养在含有抗生素的选择性培养基上。
4. 孵育和筛选：将转化后的细菌培养在含有抗生素的选择性培养基中，以筛选出成功转化的细菌。
在孵育过程中，可以使用PCR或其他方法进行确认。
结果和讨论：通过本实验，我们成功制备了大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
在筛选过程中，我们观察到在含有抗生素的培养基上生长出了抗性菌落，表明转化成功。
通过进一步的分析，如PCR检测，我们可以确认转化的目标DNA是否存在于细菌中。
这个实验的结果对于后续的基因表达研究和遗传工程应用具有重要意义。
大肠杆菌是常用的宿主细胞，可以用于大量表达外源蛋白和合成重组蛋白。
大肠杆菌感受态制备及转化
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
1
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
2
对照组
实验结果
B
A
C
写明实验目的、实验原理、仪器、材料与试剂
转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。
实验原理
实验原理
本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pCT74质粒共保温，实现转化。 pCT74质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。
4000rpm离心5 min,弃上清
加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15％的甘油 可－70℃长期保存
感受态细胞制备
实验步骤
实验步骤
转化 9． 取目的DNA（稀释好的pCT74质粒50μl）加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min 10． 于42℃水浴90S 11． 冰上放置2min 12． 加入800μlLB液体培养基于37培养1小时 13． 将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上 14． 将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果
实验一 大肠杆菌感受态制备及外源DNA的转化
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摘要：本文主要介绍了大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法.
第一天：
1. 将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C下过夜培养
2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）以备第二天摇瓶用
3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升）,保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用
第二天
4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升摇瓶
5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时
6. 定时监控OD600值（培养1小时后每半小时测定一次）
7. 当OD600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）
8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液（如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天）
9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞.先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升）,然后加水稀释至离心管的2/3体积.
10. 照上面步骤重复离心,小心弃去上清液
11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞
12. 离心,弃上清液
13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞
14. 照上面步骤离心,小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）
15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml
16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80°C保存
转化方法：
1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA,冰上培育约5分钟
2. 添加1-3μl DNA,冰上培育约5分钟
3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中
4. 加载P1000,准备好300μl LB 或2xYT
5. 对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd,2.5 千伏）（检查时间常数,应该在3以上）
6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中
7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原
8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养
高效率感受态细胞的制备注意要点
摘要：根据实验室的实际情况,我们将其稍作修改,做成了GLP文件,但其中仍有许多可改进或需要注意的地方,其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮助.
关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多,最复杂的莫过于电转化,而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化.对于做克隆工作的人而言,高而稳定的感受态可减轻不少麻烦.
现在大肠杆菌转化效率最高的要数电转化,可达到1010,但是操作起来比较麻烦.要想又简单,又能有较高的转化效率,最好的莫过于1990年《Gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受态细胞的制备与转化方法.
根据实验室的实际情况,我们将其稍作修改,做成了GLP文件,但其中仍有许多可改进或需
要注意的地方,其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮助.
1、所用器具的洁净程度.这一点非常重要,是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的,毋庸置疑.
2、培养基的装量.培养基的装量是很重要的,这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题,是有氧还是无氧生长.厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的.建议装量不要高于此值：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml,50ml/250ml.
3、培养基的pH值.这里讲的pH值并非单指配制或灭菌后的pH值,而且还包括整个摇瓶结束后的pH值.一般来说,接种前的pH值在6.8-7.2.等菌摇好后,可以测一下pH值,不要低于6.0,最好在6.5以上.这表示菌体的代谢为有氧代谢,生长状态良好,按要求做,肯定效率不低.
4、培养后的OD值.其实这是一个非常重要的参数,只是当OD值大到一定的程度后,菌体要保持对数生长已经不太可能,因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6、0.8等等.同时,OD值大时菌体总量大,感受态绝对数量要大一点.因此需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点.
5、培养基中的各种离子.经验证明,当培养基中存在一定量的Mg2+离子时,该方法制得的感受态要相对较高.在制备普通感受时,使用20mM MgCl2做为培养基的添加物,在感受态收获之前20-30分钟加入,会收到很好的效果.
6、培养温度.文献及经验告诉我们,较低的温度培养有利于感受态的形成,这样可以获得较高的感受态,但太低又不实用,因而产生了Inoue的高效感受态制备方法,它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法.
7、此外文献报道,在保存感受态时,DMSO要比甘油的效果要好,它会使感受态的效率增加.
8、液氮速冻也会使感受态的效率提高,因此推荐用液氮速冻感受态,然后保存于超低温冰箱内.至于在液氮中保存12小时以后再转入超低温冰箱,这点未做实验,只是一种感觉,第一次这样做了,没问题,以后就照此办理而已.
感受态细胞转化操作流程及提高转化效率的建议
摘要：下文是感受态细胞转化操作流程及提高转化效率的建议.
1、在冰上预冷2支14-ml BD Falcon聚丙烯圆底离心管.1支用来转化样品,1支做pUC18对照.同时将NZY+ broth培养基在42°C预热.
2、冰上融化感受态细胞.融化时轻轻将细胞混匀并分装成100ul/管.
3、每管中加入随试剂盒提供的4 ml b-ME(巯基乙醇).
4、温和转动试管,将细胞在冰上放置10分钟,每2分钟温和转动一下.
5、每管细胞加入0.1–50 ng样品DNA (或2 ml连接反应物)(参见DNA 质量与体积说明.)用灭菌dH2O水按1:10稀释对照pUC18 DNA,并取1 ml稀释的pUC18 DNA加入转化细胞.
6、温和转动试管,并在冰上放置30分钟.
7、试管在42°C水浴热激30秒.热激时间对转化效率极度重要.
8、试管冰浴2 分钟.
9、每管加入0.9 ml 预热(42°C) 的NZY+ 肉汤,37°C、225–250 rpm 摇床培养1 小时.
10、取200 ml转化混和物铺带有相应筛选抗生素的LB琼脂糖平板(如果进行颜色筛选还需加入IPTG和X-gal).pUC18阳性对照则取5 ml 铺氨苄青霉素LB琼脂糖平板.
注意:细胞经1000 rpm离心10分钟会聚集,应将细胞沉淀用200 *l NZY+ 肉汤重悬.如果用于铺板的细胞<100 ml,先将细胞加入200 ml培养基中,然后用灭菌涂布棒铺板.如果采用100 ml细胞则可以直接铺板.倾斜涂布棒并轻轻拍打,尽量减少涂布棒上的细胞残留.
11、37°C培养过夜.颜色筛选请参见以下Blue-White Color Screening的操作指南.
12、pUC18阳性对照预计有约250个克隆(?5 ×109 cfu/mg pUC18 DNA).而样品DNA的转化效率随DNA的量和组成(超螺旋或连接产物)有较大差异,大质粒和非超螺旋DNA往往得到较少的克隆.。