大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法

摘要：本文主要介绍了大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法.

第一天：

1. 将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C下过夜培养

2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）以备第二天摇瓶用

3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升）,保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用

第二天

4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升摇瓶

5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时

6. 定时监控OD600值（培养1小时后每半小时测定一次）

7. 当OD600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）

8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液（如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天）

9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞.先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升）,然后加水稀释至离心管的2/3体积.

10. 照上面步骤重复离心,小心弃去上清液

11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞

12. 离心,弃上清液

13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞

14. 照上面步骤离心,小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）

15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml

16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80°C保存

转化方法：

1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA,冰上培育约5分钟

2. 添加1-3μl DNA,冰上培育约5分钟

3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中

4. 加载P1000,准备好300μl LB 或2xYT

5. 对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd,2.5 千伏）（检查时间常数,应该在3以上）

6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中

7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原

8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养

高效率感受态细胞的制备注意要点

摘要：根据实验室的实际情况,我们将其稍作修改,做成了GLP文件,但其中仍有许多可改进或需要注意的地方,其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮助.

关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多,最复杂的莫过于电转化,而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化.对于做克隆工作的人而言,高而稳定的感受态可减轻不少麻烦.

现在大肠杆菌转化效率最高的要数电转化,可达到1010,但是操作起来比较麻烦.要想又简单,又能有较高的转化效率,最好的莫过于1990年《Gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受态细胞的制备与转化方法.

根据实验室的实际情况,我们将其稍作修改,做成了GLP文件,但其中仍有许多可改进或需

要注意的地方,其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮助.

1、所用器具的洁净程度.这一点非常重要,是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的,毋庸置疑.

2、培养基的装量.培养基的装量是很重要的,这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题,是有氧还是无氧生长.厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的.建议装量不要高于此值：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml,50ml/250ml.

3、培养基的pH值.这里讲的pH值并非单指配制或灭菌后的pH值,而且还包括整个摇瓶结束后的pH值.一般来说,接种前的pH值在6.8-7.2.等菌摇好后,可以测一下pH值,不要低于6.0,最好在6.5以上.这表示菌体的代谢为有氧代谢,生长状态良好,按要求做,肯定效率不低.

4、培养后的OD值.其实这是一个非常重要的参数,只是当OD值大到一定的程度后,菌体要保持对数生长已经不太可能,因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6、0.8等等.同时,OD值大时菌体总量大,感受态绝对数量要大一点.因此需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点.

5、培养基中的各种离子.经验证明,当培养基中存在一定量的Mg2+离子时,该方法制得的感受态要相对较高.在制备普通感受时,使用20mM MgCl2做为培养基的添加物,在感受态收获之前20-30分钟加入,会收到很好的效果.

6、培养温度.文献及经验告诉我们,较低的温度培养有利于感受态的形成,这样可以获得较高的感受态,但太低又不实用,因而产生了Inoue的高效感受态制备方法,它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法.

7、此外文献报道,在保存感受态时,DMSO要比甘油的效果要好,它会使感受态的效率增加.

8、液氮速冻也会使感受态的效率提高,因此推荐用液氮速冻感受态,然后保存于超低温冰箱内.至于在液氮中保存12小时以后再转入超低温冰箱,这点未做实验,只是一种感觉,第一次这样做了,没问题,以后就照此办理而已.

感受态细胞转化操作流程及提高转化效率的建议

摘要：下文是感受态细胞转化操作流程及提高转化效率的建议.

1、在冰上预冷2支14-ml BD Falcon聚丙烯圆底离心管.1支用来转化样品,1支做pUC18对照.同时将NZY+ broth培养基在42°C预热.

2、冰上融化感受态细胞.融化时轻轻将细胞混匀并分装成100ul/管.

3、每管中加入随试剂盒提供的4 ml b-ME(巯基乙醇).

4、温和转动试管,将细胞在冰上放置10分钟,每2分钟温和转动一下.

5、每管细胞加入0.1–50 ng样品DNA (或2 ml连接反应物)(参见DNA 质量与体积说明.)用灭菌dH2O水按1:10稀释对照pUC18 DNA,并取1 ml稀释的pUC18 DNA加入转化细胞.

6、温和转动试管,并在冰上放置30分钟.

7、试管在42°C水浴热激30秒.热激时间对转化效率极度重要.

8、试管冰浴2 分钟.

9、每管加入0.9 ml 预热(42°C) 的NZY+ 肉汤,37°C、225–250 rpm 摇床培养1 小时.

10、取200 ml转化混和物铺带有相应筛选抗生素的LB琼脂糖平板(如果进行颜色筛选还需加入IPTG和X-gal).pUC18阳性对照则取5 ml 铺氨苄青霉素LB琼脂糖平板.

注意:细胞经1000 rpm离心10分钟会聚集,应将细胞沉淀用200 *l NZY+ 肉汤重悬.如果用于铺板的细胞<100 ml,先将细胞加入200 ml培养基中,然后用灭菌涂布棒铺板.如果采用100 ml细胞则可以直接铺板.倾斜涂布棒并轻轻拍打,尽量减少涂布棒上的细胞残留.

11、37°C培养过夜.颜色筛选请参见以下Blue-White Color Screening的操作指南.