大肠杆菌电转和文库扩增

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大肠杆菌基因电转化(1)

(制剂范围可以放大或缩小）

感应态菌制备

培养液和制剂：

-无任何抗生素及含有氨苄青霉素/ carbnicillin或其他适当抗生素的LB平板

-2×LB或YT培养基500毫升

-SOC培养基

-冰冷的高压灭菌去离子水：1000毫升

-冰冷的高压灭菌10 ％甘油（500毫升）

-预冷却的50ml离心管，离心管和电转移杯。

方法：

1．从一个新鲜的琼脂平板上接种单个大肠杆菌单菌落到含有5ml的2 ×YT培养基的烧瓶中。孵育培养5小时或过夜，于37℃和250rpm旋转振荡器培养。

2 。用5ml过夜的细菌培养物接种到在2升烧瓶中500毫升预热的2 ×YT培养基中。于37℃搅拌下（250转的旋转振荡器）。一个小时以后，每20分钟测定OD600值。

3 。当培养物的OD 600达到0.2.5-0.3 ，迅速将烧瓶转移到冰水浴中15-30分钟。偶尔转动培养瓶以确保冷均匀。

4 。转移培养物至50ml冰冷的离心瓶。在4500rpm和在2 ℃下离心10分钟，收获细胞倒出上清液和重悬细胞沉淀在50毫升冰冷的纯水并在2 ℃下孵育3分钟。

5 。通过在2 ℃下离心10分钟收获细胞（4500rpm）, 倒出上清液和重悬细胞沉淀在50毫升冰冷的纯水中并孵育3分钟。

6 。通过在2 ℃下离心15分钟收获细胞（4500rpm），倒出上清液和重悬细胞沉淀在25毫升冰冷的10％甘油中。

7 。通过在2 ℃下离心15分钟收获细胞（4500rpm），倒出上清液和重悬沉淀在10毫升冰冷的10 ％甘油。

8 。通过在2 ℃下离心15分钟收获细胞（4500rpm），小心地倒出上清液，并使用巴斯德吸管残余水滴。合并和重悬沉淀于1毫升冰冷的10 ％甘油。

9 。测量1:100稀释的细胞悬浮液的OD600值：用冰冷的10％甘油稀释细胞悬液，然后测定。浓度应是2× 1011到3× 1010个细胞/ ml 〜OD = 800 -120 （1.0 OD 600 =约2.5× 108细胞/ ml）。

10 。转移40微升的悬浮于冰冷的电穿孔杯中（0.1厘米间隙）并放电施加是否发生电弧（请参阅下文第12到18步）。如果是这样，用冰冷的10％甘油洗涤的细胞悬浮液的剩余部分再次，以确保细菌悬浮液的导电率足够低（<5毫当量）。

11 。如无电弧发生，就进行存储，分配所述40微升细胞悬浮液等份放入无菌的，冰冷的0.5 - ml离心管，并立即转移到-80 ℃的冰箱中。

12 。加入10毫微克，容积不超1-3微升DNA 到每个离心管，并在冰上孵育管60秒或以上。包括所有适当的阳性和阴性对照。质粒量为细胞体积不能达到十分之一。

13 。设置电转仪提供的电容25μF ，2.5千伏和200欧姆电阻的电脉冲。

14 。转移DNA /细胞混合物倒入冷电比色皿，并确保细菌和DNA的悬浮坐在试管的底部。干燥凝结和湿气的反应杯的外侧。将试管中的电穿孔设备。

15 。在上面设置中，释放一个4-5毫秒脉冲电力。12.5千伏/厘米的探测或磁场强度的时间常数应该在屏幕上显示。

16 。尽可能快的脉冲后，取出电穿孔杯，在室温下, 加入0.5 ml SOC培养基。

17 。将细胞转移到一个含有0.5毫升SOC的17 ×150毫米的聚丙烯管中，于37℃下慢转动（250转）培养1小时. 18．涂0.5hml 培养液`于抗菌素LB板上,370C下隔夜培养, 检测转化效率.

cDNA质粒文库扩增

培养液和制剂：

-质粒文库培养基：

混合200毫升2xLB （pH值7.0 ）+ 0.4 ％超低胶凝温度的琼脂糖（SeaPrep品牌或其他）并分发50毫升于各200毫升烧杯中。高压灭菌后，允许LB +琼脂糖冷却至50℃，并添加氨苄青霉素（或其他抗菌素），50微克/毫升，放置在37℃，并直至加入细胞。

-质粒文库培养板(选择性)：4 x150mm 含有抗菌素的LB’平板

方法：

1. 加3微升的DNA 到冰冷40微升电感受态管中（菌落应10倍高浓度高于所需DNA）的管中。

2. 转移混合物到已在冰中0.1厘米电反应杯（已冷却了5分钟）. 混合后，并在使用前并且擦干反应杯面上的冰和水。3。调节电转仪到25 μF ，200欧姆，2.5千伏.

4. 在上面设置中，释放一个4-5毫秒脉冲电力。12.5千伏/厘米的磁场强度（应该在屏幕上显示）；电穿孔后，然后立即加1毫升SOC培养基，并转移到含有1毫升的15毫升培养管和在37℃培养1小时。

(5. （选择性），混合10μL培养液和90微升SOC，并涂板（LB + AMP），在37℃孵化过夜。第二天，计数菌落每个平板，并确定其中的DNA稀释给出菌落的期望数目。)

6. 总库扩增：加入约480-500微升细胞到各个含有LB-抗菌素- 琼脂糖的50毫升培养基，( 或加入约480-500微升细胞到各个含有抗菌素的150 mm LB’平板)

7. 将每个已经加了培养液的烧杯放在在冰水桶中一小时左右，让琼脂糖凝固。

8. 仔细转移到37℃培养箱，没有任何晃动。

9. 培养两个晚上（44-48小时），应该看到的小菌落悬浮在LB +琼脂糖。确定菌落会下沉到试管底部(均相性)。

10.使用中量质粒试剂盒纯化质粒

a）倒入50毫升培养物的内容放到离心管..

b）6000rpm的转速在4℃旋转20分钟。

c）仔细取去上层琼脂糖层。

d）加相同体积蒸馏水。

e）旋转15分钟8000转。

f）移除上清液，重悬每管并进入下一个步骤。

质粒保存-80，