大肠杆菌电转和文库扩增
电转化大肠杆菌感受态细胞
电转化大肠杆菌感受态细胞
1．从-80︒C冰箱取出感受态细胞，置于冰上解冻。
2．将无菌的电击杯置于冰上预冷。
3．将解冻的感受态细胞按照100ul/管分装至预冷的1.5ml的离心管中，混匀，冰上放置。
4．向装有感受态细胞的离心管中加入1-2 µl质粒或连接产物，并混匀，冰浴10min。
5．打开电转仪，电压为2.0 kV，电击5ms [这些参数设置可以根据经验略作调整]。
6．将混合物转移至已预冷的电击杯中，轻轻敲击电击杯使混合物均匀进入电极杯的底部。
并用吸水纸吸干电击杯外壁的冰水。
7．将电击杯推入电转仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入2X 500μl 的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。
8．37︒C，220rpm复苏1小时。
9．离心，涂板，置于37︒C，过夜培养，次日观察结果。
BAC文库的构建
BAC文库构建技巧基因组DNA文库构建实验技巧基因组DNA文库有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。
通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为4大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。
一、分离基因组DNA（gDNA）毫无疑问，优质的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。
研究者需要查阅文献，通过经验来选择合适的基因组DNA 分离方法，在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA的纯度。
二、处理基因组DNA根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。
不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，研究者必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。
比如，对于黏粒载体（比如Epicntre的pCC1FOSTM、pEpiFOSTM-5、pWEB-TNCTM、pWEBTM），合适的片段长度大约为40kb；对于BAC载体（比如Epicentre 的pIndigoBAC-5、pCC1BACTM），平均来说，合适的片段长度为120kb-300kb。
构建黏粒基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA 连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb 左右的DNA片段，随后使用Epicentre GELase 胶回收试剂盒回收DNA。
构建BAC基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb），随后透析回收DNA。
需要注意：（1）电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。
用Epicentre试剂盒构建黏粒文库时，就可以直接采用文库试剂盒内的Control Insert DNA来做marker，既方便又准确。
大肠杆菌转录的基本过程
大肠杆菌转录的基本过程
大肠杆菌转录的基本过程
大肠杆菌转录是指RNA合成的过程，也就是核酸从DNA复制成RNA的过程。
这个过程反映了大肠杆菌基因的表达，通过转录的过程，大肠杆菌可以利用其基因组中存储的信息生产出合成蛋白的基本单元——核酸分子。
转录不仅可以产生遗传信息，而且还能产生功能性的重要核酸分子，如riboprotein、riboswitch等。
大肠杆菌转录的基本过程主要包括5个步骤：
1. 启动子扩增：启动子被激活分子RNA激酶调节，使得RNA合成发生，RNA激酶把启动子序列拉长，使其成为引物。
2. 引物捕获： RNA合成复制器把引物与丝氨酸聚合酶结合起来，捕获并识别启动子上的碱基链。
3. RNA合成：丝氨酸聚合酶识别转录模板上的碱基链，并根据转录模板，复制出一条线粒体RNA。
4. 终止：一旦RNA合成完成，转录过程就会停止，终止因子和复制器分离，RNA合成停止，释放出RNA分子。
5. 折叠：RNA分子根据其特定的化学性质注意力折叠，以完成其机械功能并成为一条3D的分子结构。
大肠杆菌转录的这5个基本步骤是RNA合成的核心过程，是细胞内大肠杆菌基因表达的基本法则。
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大肠杆菌的转化、扩增及一些基础的实验前准备
A．大肠杆菌的转化（热击法）1. 从-80℃超低温冰柜中取出一管感受态大肠菌（BL21），立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10 min。
从冰箱中拿出含目标基因片段的质粒一管，也插入冰中，冰浴5~10 min，待融化。
2. 往上述大肠菌中加入5 μl(一般大肠菌50ul,质粒5ul)连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100 ng），轻轻震荡后放置冰上20 min。
同时，将恒温水浴的温度调到42℃。
顺便把质粒管放回原处。
(移液器枪头可能要用贴有白色标的那种).(有时大肠菌为10UL，质粒1~2UL。
比例在10:1左右)3. 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1 min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置5~10 min。
这样质粒就被导入了。
4. 在超净工作台中向上述引入质粒的大肠杆菌管中加入500 μl LB培养液（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床弹簧架上37℃震荡0.5h。
5. 同时将含合适抗菌素（AMP）的固体LB平板培养皿，放入烘箱37℃下烘0.5h。
这样可以防止大肠菌因为较大温差而死亡。
6. 在超净工作台中取上述转化混合液（即导入质粒的大肠菌）150 μl，滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过（防止杂菌）的玻璃涂布棒涂布均匀，注意涂布棒不可烧后直接涂，要降温。
将多余的转化混合液倒入废液缸，管子投入指定地点。
7. 倒置培养基，在培养皿上做上标记，放置在37℃恒温培养箱中培养箱过夜（约12-15小时）。
9. 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，整理。
B．大肠杆菌扩增用的“营养肉汤培养液”的配制酵母提取物，蛋白胨，氯化钠，NaOH溶液等按照实验室写的来，加1L超净水。
配好的培养基灭菌时需要在摇瓶上加透气的塞子，然后120度20分钟灭菌。
写上标签。
有些需要灭菌的器材都可以在此时灭菌。
C1．大肠杆菌扩增（在2*TY培养基上）1.实验前先对双手消毒。
实验时也要注意对器材在火上烧一下如镊子，移液器，试管口，试管盖，使用前后的竹签。
大肠杆菌电转化-精品资料
大肠杆菌电转化感受态细胞制备实验步骤和转化方法实验步骤：1、将适合菌株（如XL1-Blue, DH5 a）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37'C下过夜培养。
2、高温灭菌大的离心瓶（250-500ml ）。
准备几瓶灭菌水（总量约1.5 升），保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用。
3、转移0.2-1ml 过夜培养物至装有500ml LB （或其他营养丰富的培养基）的1-2 升挡板摇瓶中。
4、37C下剧烈振荡培养2-6小时。
5、定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次），当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15 分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）。
6、细胞在4C 5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4C的10%甘油中保存一两天）。
7、用灭菌的冰水重悬浮细胞。
先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3 体积。
8、照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。
9、照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。
10、离心，弃上清液。
用20ml 灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）。
11、用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml。
12、将细胞按150g l等份装入微量离心管，于-80 C保存。
转化方法:2、添加1-3g l DNA，冰上培育约5分钟1、在冰上解冻电感受态细胞添加1-10g l DNA，冰上培育约5分钟3、转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中。
4、加载P1000,准备好300 g l LB 或2xYT。
3 以上）5、对电穿孔容器进行脉冲（200欧姆，25 g Fd, 2.5千伏）（检查时间常数，应该在6、立即添加300g l的LB或2xYT至电穿孔容器中。
7、37 C下培养细胞40分钟至1小时以复原。
8、转移细胞至适当的选择培养基上培养。
大肠杆菌电击转化流程
大肠杆菌感受态制备及电转化流程1.细菌电转化感受态细胞的制备准备:50mL离心管3个10%甘油≥200mL 灭菌蒸馏水≥100mL 冰盒(50mL离心管预冷)2个1)由-80℃冰箱保存的菌种划单菌落,过夜培养16-20h。
晚上将新鲜的菌落接种于装有20mLLB培养基的250mL三角瓶中,37℃振荡培养过夜(约12h),转速控制在200rpm;2)第二天,取过夜培养物以1%接种量(可适当加大)转接入2个含50mLLB培养基的250mL三角瓶中,37℃剧烈振荡(200rpm)培养至OD600约为0.5~0.6;3)将2瓶细菌培养物分别倒入两个预冷的50mL离心管,然后至于冰水混合物中骤冷,一定要骤冷,冰水混合物中冷却至少15min(需要的话这种方式可以存放培养液数小时)3)将离心管于4℃,4000rpm,离心10min,收集菌体,弃上清;4)用50ml灭菌蒸馏水(预冷至4℃)轻轻重悬菌体,先加入少量水重悬菌体,然后把水加满, 4℃,4000rpm离心10min,弃上清,再重复一次;5)再用10%甘油重复步骤4)两次,4000rpm离心10min,最后一次倒尽上清后,再用残存管底的甘油悬浮细胞,分装ep管,100μL/支(一般,25mL起始培养物最终用200-250μL l0%甘油悬浮);6)放入-80℃冰箱中速冻。
或者立即用于电转化。
注意:1)菌种最好是-80℃冻存的,活化后生长状态较好。
2)20ml培养过夜,振荡速度不要过高(一般应该是37℃,300rpm,6h,当天转接,这样一天内工作量太大,这里我们选择过夜培养,时间长,转速控制在200rpm,可以适当缩短时间,前一天晚接种,第二天早转接)3)培养完毕后一定要骤冷,是培养物在短时间内迅速冷却。
冰水混合物中摇动瓶子,大约15min。
4)使用的器皿一点要非常干净,没有化学物质残存,可以先用餐洗净洗,再加入NaOH固体和蒸馏水产热,最后用蒸馏水反复冲洗干净。
大肠杆菌电转糊板的原因
大肠杆菌电转糊板的原因
大肠杆菌电转糊板的原因可能有以下几个方面：
基因组差异：大肠杆菌的基因组在不同菌株之间存在一定的差异，这可能导致某些菌株在电转过程中更容易发生糊板现象。
细胞壁结构：大肠杆菌的细胞壁结构对电转糊板的发生也可能有影响。
一些细胞壁结构较为松散的菌株可能在电转过程中更容易发生糊板现象。
生长条件：大肠杆菌的生长条件如培养基成分、温度、pH等也可能影响电转糊板的发生。
例如，培养基中某些成分可能会影响细胞的通透性或细胞壁的稳定性，从而增加糊板的风险。
电转条件：电转条件如电场强度、电转时间、电极间距等也可能影响糊板的发生。
例如，过高的电场强度可能会导致细胞内物质泄漏，从而增加糊板的风险。
操作不当：在电转过程中，如果操作不当，如电极放置不当、电极间距过小等，也可能导致糊板现象的发生。
综上所述，大肠杆菌电转糊板的原因是多方面的，包括基因组差异、细胞壁结构、生长条件、电转条件和操作不当等。
为了减少糊板现象的发生，可以尝试优化电转条件、选择合适的生长条件和操作方法等措施。
同时，对于出现糊板现象的菌株，可以采用适当的处理方法，如离心洗涤、重新悬浮等，以提高电转的效率和质量。
大肠杆菌菌株感受态制备_电击转化及转化效率检测
大肠杆菌DH10B（Streptomycin resistant）电转化感受态制备1．从保存的甘油管中取出200 μL菌液到100 mL的LB液体中，37o C，200 rpm培养约13~16小时后（对数期），按2%接种到SOB培养基中；2．37o C，约2~2.5小时后，OD600约0.5左右，取出，冰上缓慢摇育30 min。
3．预先4o C降温的冷冻离心机离心收集菌体，用预冷的离心管，并时刻保持在冰上，5000 rpm离心5 min；4．用50~60 mL的冰预冷灭菌超纯水洗菌体两次，用枪吸打时一定要轻柔，并时刻保持在冰上，第二次洗时可以将2管的菌体并到一管，水洗过程离心的转速要高一些，约6000 rpm离心5 min，因为离心得不是很实，离心完后要立即倒掉上清，以免菌体重新悬浮造成损失；5．用50 mL的冰预冷灭菌10%甘油洗菌体两次，用枪吸打时一定要轻柔，并时刻保持在冰上，离心后立即倒掉上清；6．最后一次甘油洗涤后立即倒掉上清，视菌体量加入0~x μL的10%冰预冷甘油重新悬浮细胞，75~200 μL/管,分装到预冷的离心管中，电转化或立即放入-80o C冰箱保存，该感受态可以在-80o C保存半年。
SOB培养基（1L）：20 g Tryptone；5 g Yeast Extract；0.6 g NaCl；0.19 g KCl，8磅灭菌20 min。
注意事项：种子一定要新鲜，最好是从甘油管中直接液体活化的。
OD600控制在0.5左右，建库用的话千万不要过！过了0.6感受态效率不会太高，做一般克隆和质粒转化的要求可以适当放低。
菌体时刻保持冰上（4 o C以下）！尽量减少离开冰的时间。
最后分装的菌体浓度要浓。
对待菌体要尽量轻柔。
收集菌体用的管和枪头要灭菌，并在超净台操作。
电击转化1.75 μL的感受态细胞加入TE溶解的质粒和连接产物最好不要超过0.6 μL，不然容易击穿，如果质粒是用纯水溶解的可以适当提高，冰上放置10~30 min；2.洗干净并烘干的电转杯冰上预冷，快速将上述感受态细胞转到电转杯里，感受态细胞要位于杯子底部；3.此步骤动作要快：将杯子外壁擦干，2 mm的杯子用电转化程序Ec2，1 mm杯子用电转化程序Ec1，电击后立即加入900~1000 μL37o C预热的SOC（见分子克隆），轻柔吸打，转到2 mL的离心管中，37o C摇床，150 rpm，45~60 min后取适量涂平板。
大肠杆菌基因工程 (2)
大肠杆菌基因工程引言大肠杆菌(Escherichia coli)是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阴性菌，它可以在动植物肠道中找到。
由于其生长快速、易于培养和转化，大肠杆菌成为了基因工程研究中最重要的模式生物之一。
大肠杆菌基因工程是通过改变大肠杆菌的遗传特征，实现对其功能的改造和优化，从而达到生产特定产物或解决特定问题的目的。
大肠杆菌基因工程的原理基因传递与插入大肠杆菌基因工程的核心在于将目标基因导入到大肠杆菌中。
目前常用的方法有以下几种：1.转化(transformation)：通过将外源DNA直接导入大肠杆菌细胞内，使其在细胞内复制和表达。
2.电转化(electroporation)：利用强电场将质粒DNA引入细胞内，使其与大肠杆菌细胞内的DNA重组。
3.病毒介导的转染(viral-mediated transduction)：使用病毒载体将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
4.转座子介导的DNA转移(transposon-mediated DNAtransfer)：利用转座子将目标基因插入到大肠杆菌染色体的特定位点上。
基因表达与调控在大肠杆菌基因工程中，外源基因导入之后需要进行表达和调控，以产生所需的受体蛋白或产物。
常用的表达系统包括启动子-启动子区域-编码序列-终止子的结构。
其中，启动子可以选择适当的促进剂或抑制剂进行调节，以控制基因的表达水平和时机。
应用案例生物医药领域在生物医药领域，大肠杆菌基因工程被广泛应用于生产重组蛋白药物。
通过引入外源基因，大肠杆菌可以高效地合成重组蛋白，并通过分离和纯化得到高纯度的药物。
例如，利用大肠杆菌表达系统，可以生产出重组人胰岛素、生长激素等重要药物。
环境治理领域大肠杆菌基因工程还可以应用于环境治理领域。
例如，通过改造大肠杆菌的基因组，使其具有降解有机污染物的能力，可以用于处理工业废水和土壤污染。
此外，大肠杆菌的工程还可以用于制造生物能源，例如利用大肠杆菌产生生物柴油或生物氢。
将重组质粒导入大肠杆菌的方法
将重组质粒导入大肠杆菌的方法
将重组质粒导入大肠杆菌有多种方法，其中包括化学转化、电转化和共转化等。
1. 化学转化：通过将重组质粒与大肠杆菌细胞一起暴露在一种化学溶液中，使细胞发生渗透增强，从而使质粒能够进入细胞。
常用的化学转化方法有钙离子诱导法、聚乙二醇法等。
2. 电转化：通过利用强电场作用，使质粒能够通过细胞膜进入细胞。
将含有重组质粒的细胞与电极片一起置于电场中，施加脉冲电压，使细胞膜发生破裂，从而实现质粒的导入。
3. 共转化：将含有重组质粒的细胞与另一种质粒（例如载带质粒）一起转化，使质粒通过共转化机制进入细胞。
在共转化过程中，载带质粒的存在可以提高重组质粒的转化效率。
以上是常用的将重组质粒导入大肠杆菌的几种方法，具体使用哪种方法取决于实验需求和条件。
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(Jin-Lab)随着基因工程和生物技术的发展，基因克隆和DNA转化技术已经成为生命科学研究的基本技术之一。
大肠杆菌是广泛应用的微生物基因克隆和表达系统，其中电转化是一种常用的DNA转化方法。
在电转化过程中，使用感受态细胞进行DNA 转化可以提高转化效率和获得更多的转化子。
因此，制备感受态细胞及其转化方法研究对开展基因克隆和表达等方面的研究具有非常重要的意义。
感受态细胞制备方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为Luria-Bertani（LB）培养基。
2.细胞质壁分离方法将DH5α菌株经过预培养后，用LB培养基洗涤一次，收集菌落后进行以下步骤。
•在含有1mM EDTA的冷0.5M葡萄糖缓冲液中洗涤细胞三次；•加入60mg/mL的亚胺青钾（IPTG）处理4小时取得感受态细胞。
3.细胞计数及保存使用平板计数器计数，将细胞用LB培养基稀释至约1 x 10^9/mL，添加10% v/v的甘油保存在-80℃。
电转化方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为SOC培养基（Super Optimal broth with Catabolite repression）。
2.DNA处理方法将所需构建质粒经过酶切和纯化等操作处理后，加入所需菌株中进行转化。
3.转化操作•取感受态细胞保存液用LB培养基洗涤3次；•加入所需DNA，静置30分钟使其与感受态细胞充分结合；•以1mm间隔安置两条电极在电转化仪中；•用微管脚吸取约50μL细胞转移到抗电极侧的铝箔上，用蒸馏水润湿铝箔；•将铝箔上细胞转移到电极之间的空间内，使用脉冲电压脉冲电压 1.8 kV, 25 uF, 200Ω电阻取得转化产物。
以上是大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化的实验步骤。
感受态细胞制备方法和电转化方法的优化将提高转化效率和转化获得率，从而为生命科学研究提供更好的服务。
电转化大肠杆菌试验[资料]
![电转化大肠杆菌试验[资料]](https://img.taocdn.com/s3/m/d2110659842458fb770bf78a6529647d2728348c.png)
电转化大肠杆菌
所需试剂和器材：
无水乙醇；70%乙醇；双蒸水；感受态细菌（-80℃冰箱）；LB培养基；抗生素（根据实验目的选择）；1.5ml ep管；电转杯；电转仪
操作步骤：
1．将电转杯以此用双蒸水、70%乙醇、无水乙醇充分清洗（很重要，否则电转杯短路，实验就会失败！），置于空气中充分晾干后，放于冰上；
2．将待电转DNA与感受态细菌混合，加入电转杯的缝隙处。
（除了腺病毒同源重组外，均使用1mm电转杯）
3．选择电转仪的Mannul选项，调节电压为1.8KV，按Pulse键进行电转；用无抗生素的LB培养基500μl冲洗电转杯中细菌，随后转入含抗生素的LB培养基中培养或涂布在抗生素平板上筛选单菌落。
注意事项：
1．电转杯要充分预冷
2．在进行腺病毒的重组实验室，要选用2mm内径的电转杯，其它均使用1mm内径的电转杯。
CRISPR Cas9 大肠杆菌基因编辑试剂盒V1.1-使用手册说明书
Cat. No.: CR3011E.coli. CRISPR/Cas9基因编辑试剂盒V1.1产品简介：本试剂盒采用CRISPR/Cas9系统对大肠杆菌基因组进行编辑。
可以实现对基因的敲除、敲入、点突变等。
也可以同时对基因组的多个位点进行编辑。
试剂盒中配备了实验过程所需要的载体及相关试剂，客户仅需合成数条引物即可完成整个实验。
整个实验周期仅需一周，基因敲除成功率高达90%。
该系统中转入的质粒均可以在敲除完成后很方便的清除，恢复对抗生素的敏感性，不残留抗性基因，实现无痕编辑。
产品特点：⚫无痕基因编辑⚫不残留抗性基因⚫可反复编辑多个基因⚫表达单靶点产品内容：pFN-Cas9-K2质粒(50ng/μl) 20μlpFG-sgRNA线性化质粒(50ng/μl) 25μlSL Enzyme Mix 25μl5×SL Buffer 50μlSCV Primer Mix1 200μlSCV Primer Mix2 200μlSCV Primer Mix3 200μl诱导剂1 2ml诱导剂2 250μl相关产品品名货号sgRNA体外转录试剂盒PC1380 Cas9体外酶切试剂盒PC1400相关服务服务名称货号大肠杆菌基因编辑服务SC1020 pFG-sgRNA载体构建服务SC1021产品应用：单点切割，基因删除：单点切割，基因插入/突变：单点切割，同时构建多个突变体：试剂盒组分：pFN-Cas9-K2质粒pFN-Cas9-K2是在原pFN-Cas9-K的改进而来。
通过改进质粒表达结构，我们实现了更加可靠的spCas9诱导表达系统。
该质粒功能为诱导表达spCas9蛋白以及–Red重组酶，实现可控的基因组DNA定点切割和重组修复。
pFG-sgRNA-HR质粒pFG-sgRNA-HR表达sgRNA并提供重组修复所需的重组模板。
SL Enzyme Mix重组连接pFG-sgRNA-HR载体。
实验流程：☆基因编辑设计原则：1.设计的靶点和重组片段所依据的基因组序列要非常精确。
载体构建方法
载体构建方法
载体构建方法是指通过合适的技术手段，创建出用于携带DNA等遗传物质的载体。
常见的载体包括质粒、噬菌体、大肠杆菌、酵母等微生物，以及病毒等。
以下是一些常用的载体构建方法：
1. 质粒构建方法：质粒是一种环状DNA分子，可用于携带外源DNA。
通常采用PCR扩增和限制性酶切等技术将外源DNA插入到质粒中，然后转化到宿主细胞中。
2. 噬菌体构建方法：噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，可用于携带外源DNA并转化到宿主细胞中。
常用的噬菌体构建方法包括重组噬菌体技术和噬菌体展示技术等。
3. 大肠杆菌构建方法：大肠杆菌是一种常见的细菌，可用于携带外源DNA并表达目的蛋白。
常用的大肠杆菌构建方法包括转化、电转化、化学转化等。
4. 酵母构建方法：酵母是一种单细胞真核生物，可用于携带外源DNA并表达目的蛋白。
常用的酵母构建方法包括转化、电转化、融合等。
5. 病毒构建方法：病毒是一种寄生于细胞的微生物，可用于携带外源DNA并转化到宿主细胞中。
常用的病毒构建方法包括重组病毒技术、腺病毒技术、AAV技术等。
以上是一些常见的载体构建方法，不同的载体构建方法适用于不同的实验需求。
在选择合适的载体构建方法时，需要考虑到载体的稳定性、转化效率、表达效率等因素。
影响大肠杆菌电转化效率因素的探讨
影响大肠杆菌电转化效率因素的探讨大肠杆菌电转化是一种高效的基因转移方法，被广泛应用于基因克隆、基因表达和基因组学研究等领域。
然而，大肠杆菌电转化效率受到多种因素的影响，包括细胞状态、基因型、电场强度、电极材料、培养条件、目的基因特性、转录和翻译机制以及转导效果评估等。
本文将对这些因素进行探讨，以期提高大肠杆菌电转化效率。
1. 细胞状态细胞状态对大肠杆菌电转化效率具有重要影响。
一般来说，活细胞比死细胞更易接受外源DNA的导入。
细胞处于对数生长期时，其转化效率最高。
因为此时细胞分裂旺盛，细胞膜通透性较高，有利于外源DNA的导入。
此外，细胞密度也会影响转化效率。
当细胞密度较高时，细胞间的电阻增加，导致电场强度减弱，从而降低转化效率。
2. 基因型不同基因型的大肠杆菌具有不同的电转化特性。
一些菌株由于其基因组结构的不同，对外源DNA的接受能力也会有所不同。
因此，在电转化实验中，应选择适合该实验条件的基因型。
3. 电场强度电场强度是影响大肠杆菌电转化效率的关键因素之一。
在一定范围内，提高电场强度可以增强细胞的通透性，从而提高外源DNA的导入效率。
但是，过高的电场强度会对细胞造成伤害，导致细胞死亡或基因组不稳定。
因此，需要根据细胞的特性和目的基因的特性选择合适的电场强度。
4. 电极材料电极材料对大肠杆菌电转化效率也有重要影响。
一般来说，导电性能好的材料可以提供更稳定的电场，从而提高转化效率。
常见的电极材料包括金属、碳纤维和玻璃纤维等。
在实际应用中，应根据实验条件和设备状况选择合适的电极材料。
5. 培养条件培养条件对大肠杆菌电转化效率具有重要影响。
在培养过程中，需要控制好温度、pH值、氧气浓度等条件。
适宜的培养条件可以促进细胞的生长和分裂，提高细胞的通透性，从而提高转化效率。
6. 目的基因特性目的基因的长度、结构和性质等特性也会影响大肠杆菌电转化效率。
较短的基因片段通常更容易导入细胞，而较长的基因片段则导入难度较大。
大肠杆菌 DH5a电转化操作
Protocol 13DElectro Cell Manipulator™ECM®399/395 ELECTROPORATION PROTOCOLE.coli DH5α, DH1DNA: pUC12Cell Preparation:Growth Medium: L-Broth (10gm bacto tryptone, 5gm bacto yeast extract, 5gmNaCI per liter)Temperature: 37°CCell Density: 0.5 - 1.0 OD600 (~ 1010 cell/ml)Temperature: Chill on iceWashing procedure: Pellet 1 L of culture at 4000 x g at 4o C 15 minWash 1: Resuspend 1 volume sterile cold H2OPellet 4000 x g at 4o C 15 minWash 2: Resuspend 0.5 volume sterile cold H2OPellet 4000 x g at 4o C 15 minWash 3: Resuspend 0.5 volume sterile cold H2OPellet 4000 x g at 4o C 15 minWash 4: Resuspend 0.02 volume sterile cold H2OPellet 4000 x g at 4o C 15 minFinal Dilution: Resuspend 0.002 - 0.003 volume sterile cold 10% Glycerol (filter sterilized)(aliquots may be frozen at -70o C, thaw on ice 5 - 10 min)Electroporation Settings:Mode: HVChamber Gap: BTX Disposable Cuvette P/N 610 (1mm gap)Set Charging Voltage: 1.3 - 1.5kVDesired Field Strength: 13.0 - 15.0 kV/cmPulse Length:Automatically fixed at 5-6 msecElectroporation Procedure:Sample Volume: 40µlTransfectant Volume: 1 µl plasmid (1ng/µl in H2O, low salt TE or ligation mix diluted 1:5 in H2O) Handling: "Flick" cuvette to mix and settle mixture (Note: suspension must touch both sidewalls of cuvetteOperating Temperature: 0°C - chill filled cuvette on ice for 1 min prior to electroporationCharge: Switch the knob A from CHARGE to PULSEDilution Media: Immediately add 960µl LB or SOCThis step is critical - Do Not Delay!Briefly and gently pipet up and down to mix thoroughlyIncubate: Transfer to polypropylene tube and hold at 37°C for 1 hr (shaking at 225 rpmmay improve recovery)Plating: Transfer 1 – 100µl to appropriate agar plateSelection Method: Antibiotic resistanceResults: 1 x 108 - 1 x 109 transformants/µg DNAReference:Personal communication Dr. Steven Mayfield, Scripps Institute,San Diego, CA。
大肠杆菌cDNA文库的构建与质量分析
大肠杆菌cDNA文库的构建与质量分析肖业;王婷婷;向双林【摘要】采用Stratagene公司的cDNA文库构建试剂盒构建大肠杆菌的cDNA文库,从中筛选出与RNaseⅢ有相互作用的蛋白,为研究RNaseⅢ蛋白在原核生物中的作用奠定基础.用Trizol试剂提取大肠杆菌的总RNA,在E. coli poly( A) Polymerase作用下给mRNA特异性地加上poly( A)尾,分离纯化mRNA,利用mRNA作为模板反转录合成双链DNA.经pfx酶补平双链末端,在两端加上EcoRⅠ接头,XhoⅠ酶切消化产生粘性末端.用CHROMA SPIN-400 column分级分离纯化cDNA片段,与pTRG XR载体连接后,电击转入XL1-BLUE MRF′菌电转感受态中.得到原始文库,经计算文库的容量达到3×106个克隆.用PCR方法测得文库的重组率为100%,插入片段的平均长度基本位于300 bp以上,测定放大文库的滴度为：3.15×1010 pfu/mL.说明构建的大肠杆菌cDNA文库质量比较高,适合用于筛选目的基因克隆.%To investigate the role of RNaseⅢin prokaryote, a cDNA library of Escherichia coli was construc-ted using the cDNA library construction kit purchased from Stratagene, which could be further usedfor identifying RNase Ⅲinteracting-proteins. In this study, the cDNA library of E. coli was constructed using the following meth-od:the total RNA of E. coli was extracted using Trizol kit, and the poly( A) tail was specifically added to mRNA with E. coli poly( A) Polymerase. After that, mRNA was separated, purified, and reverse-transcripted into double-strand DNA. The ds-cDNA termini was blunted with pfu DNA polymerase. The blunted cDNAs were added to EcoRⅠadaptors and then digested by XhoⅠ. The cDNA size was fractionated by CHROMA SPIN-400 column. These purifiedfragments were ligased into the pTRG XR vector and transformed into XL1-BLUE MRF′ competent cells, which generated the oriental unamplified cDNA library. The unamplified library contained about 3 × 106 recombi-nants. The PCR results showed that the percentage of positive recombinant clones was 100%. The length of the in-serted cDNA fragment was over 300 bp. The titer of the amplified library was 3. 15 × 1010 pfu/mL. The quality of the constructed E. coli library was excellent and helpful to screen new genes in the future.【期刊名称】《湖南师范大学自然科学学报》【年(卷),期】2016(039)004【总页数】5页(P29-33)【关键词】大肠杆菌;细菌双杂交;cDNA文库【作者】肖业;王婷婷;向双林【作者单位】湖南师范大学生命科学学院，中国长沙 410081;湖南师范大学生命科学学院，中国长沙 410081;湖南师范大学生命科学学院，中国长沙 410081【正文语种】中文【中图分类】Q78RNase Ⅲ是一种双链特异性的核酸内切酶，在细菌、酵母和人类的rRNA成熟过程中起加工rRNA前体的作用，在一些细菌中它也参与mRNA和小片段核酸RNA的加工、RNA干扰或rRNA的成熟过程[1].在真核生物的RNA干扰过程中，RNase Ⅲ起重要作用，主要是Drosha和Dicer两种RNase Ⅲ参与干扰小RNA的剪切成熟过程[2].Yang等发现大肠杆菌的RNase Ⅲ酶能将双链的RNA剪切成endoribonuclease-prepared siRNA(esiRNA)，从而介导有效的RNA干扰[3].为了研究RNase Ⅲ酶在原核生物中的作用，本实验室构建大肠杆菌的cDNA文库，采用细菌双杂交的方式从中钓取出与RNase Ⅲ有相互作用的蛋白.通过分析钓取到的蛋白，研究RNase Ⅲ蛋白在原核生物中的作用，探究细菌内是否存在类似真核生物的RNA干扰方式.1.1 材料BacterioMatch Ⅱ Two-Hybrid System Library Construction Kit购自Stratagene公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购自TIAGEN公司，PolyATtract mRNA Isolation system IV购自Promega公司，pBT诱饵质粒和pTRG靶蛋白质粒购自Stratagene公司，pGEX-4T-2和pQE-N2质粒为湖南师范大学基因功能与调控教育部重点实验室保存，限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自Fermentas公司，CHROMA SPIN-400 column柱子购自Clontech公司，Trizol试剂购自Invitrogen公司，adenine HCl和3-amino-1,2,4-triazole购自Sigma公司，His Dropout Supplement和Bacto agar购自BD/Clontech公司.1.2 方法1.2.1 大肠杆菌总RNA的提取37 ℃培养细菌至OD600达到0.5 ℃左右，收集3 mL菌体，加入200 μL的TE buffer:10 mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L EDTA，pH=8.0，含10 g/L的溶菌酶，室温处理5 min. 5 min后加入1 mL Trizol试剂提取总RNA[4]，将RNA保存在-80 ℃.1.2.2 mRNA加poly(A)尾并纯化用E.coli poly(A) Polymerase加尾酶，给细菌总RNA中的mRNA特异性地加上poly(A)的尾，方法参照NEB公司E.coli poly(A) Polymerase说明书.按Promega公司的PolyATtract mRNA Isolation system IV试剂盒说明书，分离纯化mRNA，再用12 g/L的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测.1.2.3 mRNA加尾验证取mRNA 5 μg在逆转录酶的作用下，以oligo(dT)做为引物，反转录合成cDNA第一条链.cDNA第一条链反转录后用细菌的GAPDH 引物做PCR，验证mRNA加尾和反转录是否成功，引物序列见表1所示.1.2.4 cDNA双链的合成及纯化参照Stratagene公司的BacterioMatch Ⅱ Two-Hybrid System Library Construction Kit中cDNA双链合成步骤合成cDNA双链，取5 μg mRNA 为模板，以含XhoⅠ酶切位点的Oligo(dT)作为引物，在AccuScript RT反转录酶作用下42 ℃孵育1 h，合成cDNA第一条链.在第一条链混合物中，加入RNase H，DNA polymerase I，second-strand dNTP mixture(其中dCTP甲基化)，16 ℃孵育2.5 h合成cDNA第二条链，用pfx酶补平双链的末端，在T4连接酶的作用下，两端加上EcoRⅠ接头，T4 polynucleotide kinase使其磷酸化后，再用XhoⅠ酶切消化产生cDNA 粘性末端.采用clontech公司的CHROMA SPIN-400 column柱子分级分离纯化cDNA 双链片段，主要除掉300 bp以下的片段.1.2.5 高效率电转感受态的制备高效率电转感受态的制备，参照韦晓明等人的实验方法[5].制备好的电转感受态须马上使用.1.2.6 cDNA与表达载体重组及转化寄主菌取90 ng cDNA片段与90 ng pTRG载体，用T4 DNA连接酶，4 ℃连接过夜.加入3倍体积的酒精和0.1倍体积3 mol/L的醋酸钠沉淀连接产物，将沉淀重悬浮在一定体积的水中，得到纯化和浓缩后的连接产物，测定浓度.在4个0.2 cm的电击杯中，将200 ng连接产物转入XL1-BLUE MRF′菌中，得到原始cDNA文库，取一定体积的菌液按梯度稀释后涂在四环素平板上，30 ℃培养，统计克隆数计算文库的容量.1.2.7 cDNA文库的重组率和滴度测定在上一步四环素平板上随机挑取20个克隆，用表2的引物做菌落PCR，条件如下：94 ℃变性5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 1 min,30个循环后再72 ℃延伸10 min.PCR产物做DNA琼脂糖凝胶电泳，判断文库插入片段的大小并计算重组率；收刮所有四环素平板上的克隆，重悬浮于一定体积20%的甘油中，即放大文库.取一定体积的菌液按梯度稀释后，涂布在四环素平板上，30 ℃培养，统计克隆数计算放大文库的滴度.2.1 大肠杆菌总RNA的提取按标准的Trizol法提取细菌RNA，整个过程注意防止RNase酶污染，分别取1 μg RNA加在1，2号胶孔中，做DNA琼脂糖电泳，结果如图1，总RNA电泳后可见清晰明显的3个条带，条带干净无拖尾现象且23 S rRNA亮度差不多为16 S rRNA亮度的2倍，OD260/OD280≈2.0, OD260/OD230≈2.0, 这说明总RNA 基本上没有杂蛋白质、酚和硫氰酸胍污染，提取的RNA质量非常高.2.2 mRNA的加poly(A)尾及纯化给240 μg总RNA中的mRNA做特异的加poly(A)尾处理.加尾后的mRNA纯化后再溶解在30 μL DEPC处理过的水中，测浓度为326.1 mg/L，取0.5 μg做DNA琼脂糖凝胶电泳，结果如图2，mRNA 呈弥散状分布,前后缘界限明显,一方面说明分离的mRNA 没有降解,另一方面也说明总RNA 的完整性比较好, 基本上没有降解.2.3 cDNA双链的合成及 cDNA第一条链反转录验证mRNA加尾后，在反转录酶作用下反转录合成cDNA第一条链，再用细菌的GAPDH引物做PCR，取2 μL做DNA琼脂糖凝胶电泳，结果见图3，PCR产物大小基本吻合且条带单一(设计GAPDH引物预期PCR产物大小为500 bp)，说明mRNA是成功加上poly(A)尾；cDNA第一条链反转录也是成功的. cDNA第一链和第二条链合成后，分别取5 μL做DNA琼脂糖凝胶电泳，结果如图4，cDNA 呈弥散状分布，且500 bp左右条带较亮，说明cDNA大小呈不均一分布且片段大小大部分在300 bp以上，而在100 bp以下的部分为短片段的cDNA和EcoRⅠ adapters.2.4 cDNA双链的纯化用Clontech公司的CHROMA SPIN-400 column柱分级分离纯化合成的cDNA片段，结果如图5，从图来看从6号开始洗脱出cDNA，6～9号管的cDNA片段大小基本在300 bp以上，而10～14号管的cDNA片段大小基本在300 bp以下，须丢弃，因为这些小片段的cDNA 会优先与载体连接, 所构建的cDNA 文库中均是一些小片段的克隆, 造成cDNA 文库完整性非常差.收集6～9号管的cDNA溶液，经异丙醇和醋酸钠沉淀后，重新溶解在20 μL无菌水中，测质量浓度为84mg/L.2.5 文库的构建和质量分析将原始文库的菌液涂在52个150 mm四环素平板上，计算得到的克隆数达到3×106 cfu，即文库容量的大小.从四环素平板上随机挑取20个cfu做菌落PCR，PCR产物做DNA琼脂糖凝胶电泳，1～20号为随机挑取的克隆，结果如图6，从结果来看20个克隆中无空载体，片段大小呈不均一分布且大小基本位于300 bp以上，说明文库质量较高.将52个150 mm平板上的菌落全部刮取下来，计算放大文库的滴度为3.15×1010 pfu/mL.3.1 改善提取高质量细菌RNA的方法RNA在提取过程中极容易被降解，细菌的RNA 具有含量少、半衰期短、容易降解等特点，所以与动、植物等真核生物相比较，更难提取出高质量的RNA.目前最常使用的RNA 提取方法当推1987 年Chomczynski 等提出的“硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法”[6], 其优点是收获的非降解RNA产量大、纯度高, 不需超速离心或多步酚氯仿抽提[7].但需要长时间在氯化铯柱中超离心且毒性强，费用高.2006发表在Nature上的一篇文章，研究者们开发出Trizol试剂，能很方便简单地提取各种样本的总RNA[4].目前提取细菌总RNA方法还有：SDS-Phenol 法、CTAB 法、热硼酸法及改良热硼酸法等[8].本实验发现如果直接用Trizol提细菌总RNA，提出来的RNA质量比较差，可能因为Trizol试剂破细菌细胞壁的能力较差.而用含溶菌酶浓度为10 g/L的TE Buffer预处理除细胞壁后，发现能够提出高质量的RNA.除此之外，收集过夜菌和对数期的菌液提RNA，发现在对数期的菌液能提出更高质量的RNA[9].分别取1.5,3.0,4.5 mL对数期菌液提RNA，发现用3.0 mL菌液能提出质量更好的总RNA.3.2 制备高效率感受态要构建一个高质量高代表性的文库，需要高效率的感受态.感受态可分为化学感受态和电转感受态，化学转化的方法很多, 如Hanahan法、氯化钙法及Inoue法[10].Hanahan法和Inoue法做得仔细的话，其转化效率可以达到108/μg DNA，但由于其操作复杂, 并且试验结果重复性不理想[5].建库优先考虑电击转化，其转化效率至少可以达到8×108～109/μg DNA.文献报道电场强度和电击脉冲时间是影响电转化效率的两个主要因素[11].1988年William等人研究发现在0.2 cm电击杯中采用2.5 kV场强、200 Ω电阻和25 μF电容的条件能达到最高的转化效率：109～1010/μg DNA，并且感受态浓度越高，电击后立马加入SOC培养基的时间越短，其转化效率也越高[12].OD600值最好界于0.35～0.4之间，一定不能超过0.4.一般感受态做好后都是直接放于-80℃冻存或用液氮速冻，作者发现这会使感受态的转化效率下降约一个数量级.3.3 cDNA文库的构建及评价用Promega公司的PolyATtract mRNA Isolation system IV试剂盒富集mRNA 时，用0.1×SSC漂洗颗粒时mRNA的得率很低，后来发现采用0.2×SSC漂洗能大幅提高mRNA洗脱得率.cDNA片段的纯化普遍采用的是Clontech公司的CHROMA SPIN-400 column柱[13]，不过其纯化步骤比较繁琐，采用Promega 公司的Sephacryl S-400 Resin也可以达到相同的效果，而且只需过柱一次，操作简单快捷.在构建的cDNA文库中，为使低丰度的mRNA的cDNA克隆存在的概率大于99%，一个cDNA文库至少要包含多少个克隆，可由Clack-Carbon公式计算：N=ln(1-p)/ln(1-1/n) (N 为cDNA文库中包含的克隆数；p为要求的概率,通常要求大于99%；1/n为每一种低丰度mRNA占总mRNA的比例).为使某低丰度mRNA概率大于99%，文库的重组子数不应低于1.7×105个[14]，本实验构建的大肠杆菌cDNA文库的容量达到3×106个克隆，足以达到所需标准.而且随机挑取的20个克隆做菌落PCR，结果重组率达到100%，放大文库的滴度为:3.15×1010pfu/mL，说明作者成功构建了一个完好的cDNA文库，可用于后续筛选目的基因、大规模测序等研究.【相关文献】[1] CHRISTIAN C, ELENA E H, GABRIELE K. Both N-terminal catalytic and C-terminal RNA binding domain contribute to substrate specificity and cleavage site selection of RNase Ⅲ [J]. FEBS Lett, 2001,509(1):53-58.[2] HARUHIKO S, MIKIKO C S. On the road to reading the RNA-interference code [J].Nature, 2009,457(22):396-404.[3] YANG D, BUCHHOLZ F, HUANG Z, et al. Short RNA duplexes produced by hydrolysis with Escherichia coli RNase Ⅲ mediate effective RNA interference in mammaliancells[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2002,99(15):9942-9947.[4] CHOMCZYNSKI P, SACCHI N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on [J]. Nat Protoc, 2006,1(2):581-585.[5] 韦晓明,苏明权,郝晓柯,等.电转化条件对大肠杆菌XL1-Blue菌株转化效率的影响 [J].生物技术通讯, 2003,14(6):566-568.[6] CHOMCZYNSKI P, SACCHI N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J]. Anal Biochem,1987,162(1):156-159.[7] COX R A. The use of guanidine chloride in the isolation of nucleic acids[J]. Methods Enzymol, 1968,12(6):120-129.[8] 陈星,潘迎捷,孙晓红,等.细菌总RNA 提取方法的研究进展 [J].湖南农业科学,2010,3(5):9-11.[9] MANGAN J A, SOLE K M, BUTCHER P D, et al. An effective method of RNA extraction from bacteria refractory to disruption, including mycobacteria [J]. Nucleic Acids Res, 1997,25(3):675-676.[10] SAMBROOK J, RUSSELL D W. 分子克隆实验指南[M].3版.北京:科学出版社, 2002.[11] WOODALL C A. Electroportaion of E.coli [J]. Methods Mol Biol, 2003,235(1):55-69.[12] WILLIAM J D, JEFF F M, CHARLES W R. High efficiency transformation of E.coli by high voltage electroporation [J].Nucleic Acids Res,1988,16(13):6127-6145.[13] 王立新,郑尧,杨朝霞,等.大鲵皮肤cDNA 文库构建及Arpc5l 基因cDNA 序列和组织表达分析 [J].中国生物化学与分子生物学报, 2011,27(3):273-281.[14] 王来元,王金星,赵小凡,等.家蝇cDNA 文库的构建 [J].动物学研究, 2001,22(2):89-92.。
大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备
3. 大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，同时，DNA在电场力的作用下进入细胞，随后细胞复苏和弥合，从而实现质粒DNA的物理转移。
为避免电击时出现“击穿”，即产生电流，细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。
转化效率为109〜1010转化子/卩g DNA3.1 ．感受态细胞的制备(1)感受态细胞及材料准备同钙转化感受态细胞的制备相同。
(2)选合适的大肠杆菌在4C, 3000 rpm下离心10min,弃上清液(如需要，沉淀可在4C的10%扌油中保存1〜2天)。
(3)弃上清，离心管中加入少量ddHO,轻柔的悬浮沉淀后，再将水注满离心杯，4C, 3000 rpm 离心10min。
( 4)重复步骤( 3) 1 次。
(5)小心弃上清 (沉淀可能会很松散) ,再往离心管中加入少量10%甘油(灭菌, 预冷) , 重悬菌体，再加满10%T油，4C, 4000 rpm离心10min。
(6)用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2〜3ml,将细胞按200卩I等份装入微量离心管，放置于—80C下保存。
( 7)按照钙转化感受态细胞方法进行转化效率和抗性检测。
3.2 ．电转化为了降低离子浓度，待转化的质粒DNA如质粒或酶连产物，在电转化前应该进行纯化(乙醇沉淀),以下所有步骤都需要保持无菌操作。
(1)从—80C冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；加入待转化的质粒DNA冰浴10min；同时将电转化杯进行冰浴。
实际操作中, 如果电转化杯浸泡在乙醇中, 可提前取出电转化杯, 在无菌的超净台上吹干。
(2)打开电转仪，调至Manual,调节电压为2.1KV。
特别注意，不同的电转化杯，所使用的电压不同。
防止电压不够,难以有效转化,以及,电压过高,击爆电转化杯,产生火花,产生危险。
(3)将冰浴后的感受态细胞(含DNA转移到电转化杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部 (注意：其体积以填充电转化杯到电极之间空间即可，具体的用量可参见具体所使用的电转化杯的说明)。
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大肠杆菌基因电转化(1)
(制剂范围可以放大或缩小）
感应态菌制备
培养液和制剂：
-无任何抗生素及含有氨苄青霉素/ carbnicillin或其他适当抗生素的LB平板
-2×LB或YT培养基500毫升
-SOC培养基
-冰冷的高压灭菌去离子水：1000毫升
-冰冷的高压灭菌10 ％甘油（500毫升）
-预冷却的50ml离心管，离心管和电转移杯。
方法：
1．从一个新鲜的琼脂平板上接种单个大肠杆菌单菌落到含有5ml的2 ×YT培养基的烧瓶中。
孵育培养5小时或过夜，于37℃和250rpm旋转振荡器培养。
2 。
用5ml过夜的细菌培养物接种到在2升烧瓶中500毫升预热的2 ×YT培养基中。
于37℃搅拌下（250转的旋转振荡器）。
一个小时以后，每20分钟测定OD600值。
3 。
当培养物的OD 600达到0.2.5-0.3 ，迅速将烧瓶转移到冰水浴中15-30分钟。
偶尔转动培养瓶以确保冷均匀。
4 。
转移培养物至50ml冰冷的离心瓶。
在4500rpm和在2 ℃下离心10分钟，收获细胞倒出上清液和重悬细胞沉淀在50毫升冰冷的纯水并在2 ℃下孵育3分钟。
5 。
通过在2 ℃下离心10分钟收获细胞（4500rpm）, 倒出上清液和重悬细胞沉淀在50毫升冰冷的纯水中并孵育3分钟。
6 。
通过在2 ℃下离心15分钟收获细胞（4500rpm），倒出上清液和重悬细胞沉淀在25毫升冰冷的10％甘油中。
7 。
通过在2 ℃下离心15分钟收获细胞（4500rpm），倒出上清液和重悬沉淀在10毫升冰冷的10 ％甘油。
8 。
通过在2 ℃下离心15分钟收获细胞（4500rpm），小心地倒出上清液，并使用巴斯德吸管残余水滴。
合并和重悬沉淀于1毫升冰冷的10 ％甘油。
9 。
测量1:100稀释的细胞悬浮液的OD600值：用冰冷的10％甘油稀释细胞悬液，然后测定。
浓度应是2× 1011到3× 1010个细胞/ ml 〜OD = 800 -120 （1.0 OD 600 =约2.5× 108细胞/ ml）。
10 。
转移40微升的悬浮于冰冷的电穿孔杯中（0.1厘米间隙）并放电施加是否发生电弧（请参阅下文第12到18步）。
如果是这样，用冰冷的10％甘油洗涤的细胞悬浮液的剩余部分再次，以确保细菌悬浮液的导电率足够低（<5毫当量）。
11 。
如无电弧发生，就进行存储，分配所述40微升细胞悬浮液等份放入无菌的，冰冷的0.5 - ml离心管，并立即转移到-80 ℃的冰箱中。
12 。
加入10毫微克，容积不超1-3微升DNA 到每个离心管，并在冰上孵育管60秒或以上。
包括所有适当的阳性和阴性对照。
质粒量为细胞体积不能达到十分之一。
13 。
设置电转仪提供的电容25μF ，2.5千伏和200欧姆电阻的电脉冲。
14 。
转移DNA /细胞混合物倒入冷电比色皿，并确保细菌和DNA的悬浮坐在试管的底部。
干燥凝结和湿气的反应杯的外侧。
将试管中的电穿孔设备。
15 。
在上面设置中，释放一个4-5毫秒脉冲电力。
12.5千伏/厘米的探测或磁场强度的时间常数应该在屏幕上显示。
16 。
尽可能快的脉冲后，取出电穿孔杯，在室温下, 加入0.5 ml SOC培养基。
17 。
将细胞转移到一个含有0.5毫升SOC的17 ×150毫米的聚丙烯管中，于37℃下慢转动（250转）培养1小时. 18．涂0.5hml 培养液`于抗菌素LB板上,370C下隔夜培养, 检测转化效率.
cDNA质粒文库扩增
培养液和制剂：
-质粒文库培养基：
混合200毫升2xLB （pH值7.0 ）+ 0.4 ％超低胶凝温度的琼脂糖（SeaPrep品牌或其他）并分发50毫升于各200毫升烧杯中。
高压灭菌后，允许LB +琼脂糖冷却至50℃，并添加氨苄青霉素（或其他抗菌素），50微克/毫升，放置在37℃，并直至加入细胞。
-质粒文库培养板(选择性)：4 x150mm 含有抗菌素的LB’平板
方法：
1. 加3微升的DNA 到冰冷40微升电感受态管中（菌落应10倍高浓度高于所需DNA）的管中。
2. 转移混合物到已在冰中0.1厘米电反应杯（已冷却了5分钟）. 混合后，并在使用前并且擦干反应杯面上的冰和水。
3。
调节电转仪到25 μF ，200欧姆，2.5千伏.
4. 在上面设置中，释放一个4-5毫秒脉冲电力。
12.5千伏/厘米的磁场强度（应该在屏幕上显示）；电穿孔后，然后立即加1毫升SOC培养基，并转移到含有1毫升的15毫升培养管和在37℃培养1小时。
(5. （选择性），混合10μL培养液和90微升SOC，并涂板（LB + AMP），在37℃孵化过夜。
第二天，计数菌落每个平板，并确定其中的DNA稀释给出菌落的期望数目。
)
6. 总库扩增：加入约480-500微升细胞到各个含有LB-抗菌素- 琼脂糖的50毫升培养基，( 或加入约480-500微升细胞到各个含有抗菌素的150 mm LB’平板)
7. 将每个已经加了培养液的烧杯放在在冰水桶中一小时左右，让琼脂糖凝固。
8. 仔细转移到37℃培养箱，没有任何晃动。
9. 培养两个晚上（44-48小时），应该看到的小菌落悬浮在LB +琼脂糖。
确定菌落会下沉到试管底部(均相性)。
10.使用中量质粒试剂盒纯化质粒
a）倒入50毫升培养物的内容放到离心管..
b）6000rpm的转速在4℃旋转20分钟。
c）仔细取去上层琼脂糖层。
d）加相同体积蒸馏水。
e）旋转15分钟8000转。
f）移除上清液，重悬每管并进入下一个步骤。
质粒保存-80，。