GST pulldown实验技术
GST-pull down
GST-pull down 实验一、实验所需试剂及配制：1、LB培养基成分：1%（W/V）Tryptone5%（W/V）Y east Extract1%（W/V）NaCl（1）称取下列试剂，置于1L烧杯中：Tryptone 10 g；Y east Extract 步骤：5 g；NaCl 10 g（2）加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解（3）滴加NaOH调节PH值至7.0-7.2（注：1L培养基约需5 MNaOH 1 ml）（4）加去离子水定容至1L（5）高温高压灭菌后，4 ℃保存。
2、LB/Amp 培养基配制成分：1%（W/V）Tryptone5%（W/V）Y east Extract1%（W/V）NaCl0.1 mg/ml Amp（氨苄青霉素）步骤：（1）--（5）同上（6）高压后，温度降至60 ℃以下，加入1L Amp（100 mg/ml）后均匀混合，4 ℃保存。
（注：高压后直接加入，温度过高易使抗生素灭活）3、Amp （100 mg/ml）配制：步骤：（1）称量5 g Amp置于50 ml离心管中（2）加入40 ml 灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml（3）用0.22 um过滤膜过滤除菌（4）小分分装（1 ml/分）后，-20 ℃保存。
4、LB固体培养基配制：成分：1%（W/V）Tryptone5%（W/V）Y east Extract1%（W/V）NaCl15 g/L 琼脂糖粉步骤：（1）同LB培养基称取上述试剂充分混匀后并调PH值（2）高压灭菌后，等待培养基冷却至50-60 ℃，加入抗生素，摇匀（3）超净台中均匀铺板，待冷却凝固后，4 ℃密封保存（注：每个板子大约需要25 ml培养基）二、目的质粒转化大肠杆菌、菌种挑取及保存（一）转化1、-80 ℃冰箱中取感受态细菌（15 ul），冰上解冰。
2、加入质粒DNA溶液（5 ul），轻摇匀，冰上放置30 min。
3、42 ℃水浴中热击45s，促使细菌吸收质粒，热击后迅速置于冰浴冷却2 min。
GST pull-down实验技术
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
1.1 GST-A融合蛋白的表达 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1: 50比例将表达蛋白的冻存 菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
GST pull-down 示意图
Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
3、在管中加入预冷的200微升PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以 免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤 一次， 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清;
4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸 净但不吸走珠子），即获得结合有GST-A融合蛋白的Sepharose；
1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
5、如果用于检测，在Sepharose 加入15~20微升1×蛋白电泳上 样缓冲液，于沸水中煮5~10min。
6、12000 rpm/min离心5min，取上清做SDS-PAGE和WB检测。
2. B蛋白的制备
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
GST-Pull-down技术服务
原理简介：
GST-Pull-down技术是一种体外检测蛋白质之间相互作用的方法。
其基本原理是利用GST对于其底物-谷胱甘肽具有极高的特异性，故GST融合蛋白可亲和固化在谷胱甘肽树脂上，作为与猎物蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,当猎物蛋白溶液过柱时便可从中捕获与之相互作用的蛋白(目的蛋白)，洗脱结合物然后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,此方法简单易行,操作方便。
服务内容：
一验证两蛋白质间相互作用
诱饵蛋白与猎物蛋白原核表达载体的构建
诱饵蛋白与猎物蛋白的诱导表达
诱饵蛋白与猎物蛋白的纯化
Pull-down技术蛋白互作分析
Western bloting进一步鉴定互作蛋白表达
二，验证目的蛋白与细胞裂解物蛋白互作
诱饵蛋白原核表达载体的构建
诱饵蛋白的诱导表达
诱饵蛋白的纯化与固定
Pull-down技术蛋白互作分析
互作靶蛋白的鉴定
服务承诺: 吉赛保证为您提供客观，公正的实验结果详情请咨询广州吉赛生物有限公司。
GST-pull-down实验技术
1.1.2 (His)-B融合蛋白的纯化
Western Blot
5、加入适量体积Elution Buffer，不必吹打，晃动洗脱蛋白。 3000 rpm/min，4℃离心5min，吸净上清，His-B融合蛋白即在 上清中；
6、如果用于检测，取10微升样品，加入10微升1×蛋白电泳上 样缓冲液，于沸水中煮5~10min；
2、将过夜培养物按1:100比例接入200ml LB(Amp＋) ，220 rpm， 30℃培养至OD600=0.4-0.6;
3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋 白（IPTG 0.5mM，20℃，200 rpm培养10~16小时）;
4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清 （如需要该步沉淀能保存在-80℃）；
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
1.1 GST-A融合蛋白的表达 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1: 50比例将表达蛋白的冻存 菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
体外蛋白的结合?1将结合有gsta融合蛋白的sepharose4b悬浮在适量体积缓冲液中加入悬浮在适量体积缓冲液中加入2030微升含有b蛋白的溶液原核表达或真核表达产物同时采用结合有蛋白的溶液原核表达或真核表达产物同时采用结合有gst蛋白的sepharose作为阴性对照
GST pull-down 实验技术
主讲：段志强
Western Blot
GST pull-down原理 GST pull-down实验流程
GSTPullDown（以Rac1活性检测为例）（原创）
GSTPullDown（以Rac1活性检测为例）（原创）1、⽤GST-PAK-CRIB融合蛋⽩载体转化BL21感受态细菌，37℃培养过夜，12-16h之后出现菌
落；
2、挑取阳性单克隆，接种到含有抗⽣素的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床中剧烈振摇⾄菌
液OD600值在0.4-0.6之间时，加⼊IPTG 0.1mmol/L诱导，继续孵育3-4h，离⼼，收集菌体（可
以-70℃保存备⽤）；
3、加⼊2 ml细菌裂解液（含蛋⽩酶抑制剂），重新悬浮菌体，冰上振荡15 min；
4、12000 rpm离⼼10 min，取上清；
5、向上清中加⼊100 µl的含有⾕胱⽢肽的琼脂糖磁珠（⽤之前需⽤washing buffer洗涤3
次），4℃旋转混合⾄少30min，再⽤washing buffer洗3次；
6、从培养的细胞中提取全蛋⽩，取蛋⽩200µg，与上述琼脂糖磁珠混合，⽤washing buffer 补
⾜300 µl，4℃旋转孵育⾄少1 h，⽤于沉淀细胞中的⽬的蛋⽩，（注：此步反应的温度和孵育时
间均需根据不同的的蛋⽩进⾏优化，孵育的最后阶段进⾏略微的涡旋震荡能够去掉⾮特异性结
合的蛋⽩，降低背景）；
7、⼩⼼移去上清，⽤400 µl washing buffer 洗3-5次，第⼀次可室温孵育5 min，并在孵育过程
中偶尔进⾏混匀；
8、向琼脂糖磁珠中加⼊30 µl 2×SDS-PAGE加样缓冲液，沸⽔浴5 min，直接加样进⾏SDS-
PAGE蛋⽩电泳；
9、以下实验操作同westernblotting（见前天实验流程）。
GST-pull down 方案 方法 流程
GST-pull down 技术一大量制备GST蛋白1 活化冻存菌种GST和GST-X：按1：50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5ｍｌＬＢ（Ａｍｐ＋），37℃，140~150rpm培养过夜2 将过夜培养物按1：100比例接入200mlＬＢ（Ａｍｐ＋），220rpm，30℃培养至OD600=0.4-0.63 以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白。
（IPTG 0.5mM，20℃,150rpm 培养10~16小时）4 诱导适当时间后，4℃，5000g离心10min后弃上清。
（如需要该步沉淀能保存在-80℃）5 重悬沉淀：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬6 冰上超声沉淀重悬液：2S 间隔1S 至悬液透明（一般可容性蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声６～９min可透明）7 10,000g*10min离心上清转移至新的离心管，加DTT至终浓度1mmol/L二谷胱甘肽-琼脂糖树脂的处理1 轻轻颠倒树脂盛装容器，混成匀浆2 取适量匀浆放入离心管中，4℃，500g离心5min后弃上清（每10ml 细菌培养物可以用50ul匀浆）3 每1.33mL 初始匀浆加入10 mL 4℃预冷的PBS，颠倒混匀后，4℃，500g离心5min后弃上清（50ul初始匀浆用400ulPBS洗）4 每1.33mL 初始匀浆加入1 mL 冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒混匀置冰上放置待用。
（50ul初始匀浆加入40ulPBS）三结合GST蛋白1 上清与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，4℃轻摇30min（可过夜让其充分结合）。
2 4℃，500g离心5min后弃上清3 沉淀加入10倍床柱体积PBS（1床柱体积=0.5*50%匀浆体积）(50ul初始匀浆用400ulPBS 洗），颠倒混匀以洗去未与树脂结合的杂蛋白（每次可在混旋仪上混匀５min)4 4℃，５00g离心5min后弃上清5 重复步骤3和4两次，共三次四预清除细胞裂解液1 将细胞裂解液与50ul的和GST结合的50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂悬液在4℃翻转混合孵育2h。
gstpull down实验原理
gstpull down实验原理GSTP（Global Software Test Platform）是一种基于客户端-服务器架构的软件测试平台，它可以实现分布式测试、自动化测试以及测试工具的集成。
GSTP的核心技术之一就是GSTPull Down实验原理。
GSTPull Down实验原理是GSTP中的一种测试方法，用于模拟客户端请求与服务器响应的交互过程。
通过这种方法，可以对服务器的性能、稳定性和负载能力进行评估和验证。
在GSTP中，GSTPull Down实验原理的主要步骤包括：构建测试用例、模拟客户端请求、发送请求到服务器、接收服务器响应、分析响应结果。
下面将对这些步骤进行详细描述。
构建测试用例是GSTPull Down实验原理的第一步。
测试用例是为了模拟真实的客户端请求，通常包括请求的类型、参数、路径等信息。
测试用例的设计要尽可能地贴近真实的使用场景，以保证测试结果的准确性。
接下来，通过模拟客户端请求，将测试用例发送到服务器。
在GSTP中，可以使用自定义的脚本或工具来实现请求的发送。
这些工具可以模拟不同的网络环境、请求频率和负载情况，从而对服务器的性能和稳定性进行全面测试。
服务器接收到客户端的请求后，会进行相应的处理，并生成相应的响应结果。
GSTP会将服务器的响应结果返回给测试者，以方便对响应结果进行分析和评估。
在分析响应结果时，可以根据预先设定的评估指标对服务器的性能进行评估。
评估指标可以包括响应时间、并发数、吞吐量等。
通过分析这些指标，可以了解服务器在不同负载下的性能表现，并找出潜在的性能瓶颈。
通过GSTPull Down实验原理，测试者可以对服务器的性能和稳定性进行全面的评估。
它可以帮助测试者发现服务器的性能瓶颈，优化服务器的配置和性能，提高服务器的负载能力。
GSTPull Down实验原理是GSTP中的一种测试方法，通过模拟客户端请求和服务器响应的交互过程，对服务器的性能和稳定性进行评估和验证。
GST pull-down
百泰派克生物科技
GST pull-down
Pull down（拉下实验）是一种体外亲和纯化蛋白的技术，Pull down技术将已知蛋白（诱饵蛋白）利用亲和试剂标签（如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸六肽、生物素）进行标记，再特异性识别混合体系中的配体蛋白（靶蛋白），以达到富集、分离、纯化某种配体蛋白质的目的，是在体外研究蛋白与蛋白相互作用的有力工具。
GST pull-down实验，也称GST融合蛋白沉降技术，是利用谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记诱饵蛋白进行的Pull down实验。
GST pull-down可用于证实已知的蛋白或肽的相互作用，也可以用来挖掘未知的蛋白或肽的相互作用。
百泰派克生物科技提供高效快速的GST pull-down 蛋白互作分析服务，可用于鉴定两种已知的兴趣蛋白质可能存在的直接相互作用，以及寻找可能与目标蛋白存在相互作用关系的未知蛋白，欢迎免费咨询。
GST pull-down原理及方法
看他是不是没有你不行, 还是可能有其他的新伙伴.
不做对照, 一厢情愿的希望, 并相信蛋白间的关系是幼稚的.
生物实验中, 单一的证据都是薄弱的, 无论他貌似多么正确, 要通过对照和多方取证才能确定真实的事实.
大家交朋友, 搞对象也类似于此. 关乎终身快乐, 幸福, 不可不察.
Coimmunoprecipitatio的自由恋爱问题. 一个蛋白在本性上可以同时喜欢很多其他的蛋白, 但是最终还是会有个最喜欢的, 而在Co-ip中就能发现他的喜好. 这种关系可能是直接的, 也可能是间接的, 是更接近于东方的.
两个蛋白可能在生物体内素昧平生, 一个在头上, 一个在脚上. 也许两者之间或许很合辙, 生来却天各一方. 在GST pull down 的环境中, 他们可能相遇, 吸引在一起. 但在现实生活中, 这样的浪漫关系可能是不现实的. 脚上的蛋白若是跑到头上与情人幽会, 人就要出大问题. 还有的情况是, 两个蛋白即使独处在一起 在其他蛋白, 各种因素适当的辅助下, 却有可能形成稳定的搭档关系.
白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。
GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)
所以, 随缘, 就是像蛋白一样单纯, 却不简单.
有关Control和多方取证.
我们做试验, 都要有实验组, 阴性对照, 阳性对照. 即使体外生化实验都达成了, 还要通过多方取证来确定两个蛋白之间确定的生理关系.
gstpulldown实验技术
gstpulldown实验涉及一些危险性因素，如化学试剂的使用、高温高压操作等，因此需要进行相应的安全防护措 施。例如，穿戴实验室外套、戴手套、避免直接接触化学试剂等。此外，应定期检查实验室安全设施和应急处理 设备，确保实验过程的安全性。
04
gstpulldown实验数据 分析
数据收集与整理
详细描述
gstpulldown实验技术与基因芯片等技术结 合使用，可以用于检测特定条件下细胞中基 因表达的变化。这种方法有助于揭示基因表 达的调控机制和分子网络，为研究生物发育 、疾病发生发展等方面提供重要信息。
应用案例五：其他领域应用介绍
总结词
gstpulldown技术在其他领域也有广泛的应 用，如病毒致病机制研究、免疫学研究等。
详细描述
gstpulldown实验技术在病毒致病机制研究 中可用于分析病毒与宿主细胞的相互作用； 在免疫学研究中可用于研究免疫细胞的活化 和信号转导。此外，它还可用于研究细胞凋
亡、自噬等生物学过程。
THANKS FOR WATCHING
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对得到的实验结果进行验 证，如通过重复实验或使 用不同的蛋白质和DNA探 针进行验证。
实验注意事项
1. 选择合适的蛋白质和DNA探针
01
选择的蛋白质和DNA探针应具有代表性，能够反映所研究的问
题的本质。
2. 注意实验条件的一致性
02
为了保证实验结果的可靠性，需要在相同的条件下进行重复实
验。
3. 注意数据的分析和解读
未来发展趋势与展望
发展自动化和智能化技术
随着技术的发展，自动化和智能化将成为未来实验室技术的重要发展方向。通过开发自动 化和智能化的Gstpull-down实验技术，进一步提高实验效率和结果的稳定性。
gstpulldown实验技术
gstpulldown实验技术汇报人：2023-12-25•实验简介•材料准备•实验操作目录•结果分析•实验结论01实验简介验证已知的蛋白质相互作用gstpulldown实验可以用于验证已知的蛋白质相互作用，例如验证某个蛋白质是否与特定的结合蛋白相互作用。
发现新的蛋白质相互作用通过gstpulldown实验可以发现新的蛋白质相互作用，从而为研究新的生物学过程和疾病机制提供线索。
确定蛋白质之间的相互作用通过gstpulldown实验可以检测到与特定蛋白质结合的其他蛋白质，从而确定蛋白质之间的相互作用。
蛋白质相互作用gstpulldown实验利用GST（谷胱甘肽巯基转移酶）融合蛋白作为诱饵，与细胞或组织提取物中的目标蛋白质进行结合，从而检测到与诱饵蛋白结合的目标蛋白。
分离和纯化通过将GST融合蛋白与谷胱甘肽结合的琼脂糖珠结合，可以分离和纯化与目标蛋白结合的复合物。
检测目标蛋白通过Western blot等技术对分离和纯化的复合物进行检测，从而确定与诱饵蛋白结合的目标蛋白。
实验步骤准备GST融合蛋白和谷胱甘肽结合的琼脂糖珠将GST融合蛋白与琼脂糖珠结合，形成用于捕获目标蛋白的诱饵。
细胞或组织提取从感兴趣的细胞或组织中提取蛋白质混合物。
孵育将细胞或组织提取物与GST融合蛋白结合的琼脂糖珠孵育，使目标蛋白与诱饵蛋白结合。
洗脱和检测洗脱与诱饵蛋白结合的目标蛋白，并利用Western blot等技术进行检测和分析。
02材料准备GST琼脂糖珠磷酸化激酶洗涤液抗体01020304用于绑定目的蛋白，是实验的关键试剂。
用于磷酸化目的蛋白，确保实验的准确性。
用于清洗实验中使用的各种仪器和试剂。
用于检测目的蛋白的表达和磷酸化状态。
离心机用于分离和纯化目的蛋白。
摇床用于孵育实验中的各种反应。
超声波破碎仪用于破碎细胞，释放细胞内的目的蛋白。
凝胶电泳仪和电泳槽用于检测目的蛋白的表达和磷酸化状态。
所需样本细胞或组织样本实验所需的生物样本，需确保其质量和活性。
GST-pull-down试验方法(自己总结)
12.GST蛋白的表达和纯化12.1 GST蛋白的表达（1) 将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。
（2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液。
（3) 将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始OD600为0.1。
（4) 28℃,220rpm摇菌培养2小时。
（5) 加入50μl 100mM IPTG,16～27℃摇菌培养1～8小时。
（6) 收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃ 5krpmx5min离心，弃上清。
（7) 加入10ml PBS/管，重悬细胞,5krpm离心5min，弃上清。
（8) 加入2ml PBS/管，重悬细胞。
转移至5ml离心管。
（9) 超声破壁破壁前，在细胞悬液中加20μl 10mg/ml PMSF,80μl蛋白酶抑制剂(100x)。
破壁参数：Frequency:100～200w 60s， pause 20s run 40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。
加100μl 20% TritonX－100，冰上放置30min。
（10) 将裂解液分入1.5ml离心管中，4℃离心12krpm×10min，取上清。
（11) 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。
离心（12krpm,1min），取上清作SDS-PAGE电泳，检测表达情况。
12.2 准备50%GST Sepharose 4Bslurry（1) 将原75%Glutathione Sepharose 4B的slurry弹至混匀。
（2) 取677μl原液/管，3krpm离心5min，弃上清。
（3) 加500μl PBS，颠倒混匀，3krpm离心5min，弃上清。
反复5次。
（4) 加500μl PBS，颠倒混匀，配成50%Glutathione Sepharose 4B备用。
12.3 GST融合蛋白的纯化（1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl 50%Glutathione Sepharose 4B，4℃，摇床上摇，反应30min～60min。
gstpulldown实验技术
拓展应用领域与范围的可能性
拓展应用领域
将gstpulldown技术应用于更多生物学领域，如神经 科学、免疫学等。
拓展应用范围
将gstpulldown技术应用于更广泛的应用场景，如药 物筛选、疾病治疗等。
跨学科合作
加强与其他学科的交叉合作，共同推动gstpulldown 技术的发展和应用。
未来发展趋势预测与展望
化学分析方法开发
01
分析方法建立
通过gstpulldown实验技术可以 建立新的化学分析方法，为化学 分析领域提供新的工具和方法。
02
分析方法验证
03
分析方法改进
利用gstpulldown实验技术可以 对新的化学分析方法进行验证， 确保方法的准确性和可靠性。
基于gstpulldown实验结果，可 以对现有化学分析方法进行改进 ，提高分析的灵敏度和特异性。
有机合成反应研究
反应机理研究
通过gstpulldown实验技术可以研究有机合成反应的机理，了解 反应过程中各个中间体的变化情况。
反应条件优化
利用gstpulldown实验技术可以筛选出最佳的反应条件，提高有机 合成反应的产率和选择性。
合成策略设计
基于gstpulldown实验结果，可以设计新的合成策略，简化合成步 骤，提高合成效率。
VS
局限性
然而，GST Pulldown实验也有其局限性 ，例如可能会受到非特异性结合的干扰， 导致结果出现偏差。此外，该技术需要使 用特定的标签蛋白和亲和层析介质，增加 了实验成本和复杂性。
02
gstpulldown实验技术操作流 程
实验材料准备
GST标签蛋白
将目的蛋白与GST标签融合表达，用于亲和层析实验。
gst pull-down实验流程
GSTPulldown实验流程一、实验准备阶段1.确定实验目的（1）确定进行GSTPulldown实验的目的和研究问题（2）定义所需的实验指标和结果参数2.准备实验材料（1）准备所需的细胞或组织样本（2）提取或购买GST标记的蛋白二、样品处理与制备1.细胞处理（1）处理细胞以获得所需的细胞提取物（2）对细胞提取物进行蛋白浓缩或纯化2.样品制备（1）将GST标记的蛋白与细胞提取物混合（2）进行样品预处理如加入缓冲液等三、GSTPulldown实验1.准备GSH亲和树脂（1）将GSH亲和树脂进行预处理和平衡（2）加入样品到GSH亲和树脂上2.亲和纯化（1）将混合样品与GSH亲和树脂一起孵育（2）清洗亲和树脂以去除非特异性结合物3.Elution（1）使用Elution缓冲液洗脱目标蛋白（2）收集洗脱的蛋白样品并保存四、蛋白分析与检测1.SDSPAGE分析（1）将洗脱的蛋白样品进行SDSPAGE电泳分析（2）观察蛋白条带的大小和清晰度2.Westernblot检测（1）将SDSPAGE分离的蛋白转移至膜上（2）使用特异性抗体进行GST标记蛋白的检测五、数据分析与结果解释1.带图像分析（1）分析SDSPAGE和Westernblot的图像（2）计算目标蛋白的相对含量和表达水平2.结果解释（1）根据实验结果解释GSTPulldown实验的结论（2）分析实验结果与预期结果的一致性和差异六、结果验证与文献探索1.实验验证（1）重复实验以验证结果的可重复性和稳定性（2）进行相关实验以进一步验证结论2.文献探索（1）检索相关文献并对实验结果进行比对和验证（2）吸收和借鉴相关研究的成果，完善研究结论。
GST-pull down
一、实验步骤1. 重组蛋白表达与纯化1）将将编码蛋白A的GST标签重组质粒转化到BL21或者Rosetta DE3感受态细胞中。
2）向高压灭菌的锥形瓶中倒入150 ml LB培养基，按照1:1000加入氨苄青霉素储液（工作浓度为50 μg/ml）。
用高压灭菌过的10 μl枪头挑取平板上的单克隆菌落，37℃条件下以200 rpm转速振荡培养约6 h，使OD600为0.6-0.8。
3）每管加入按照1:200-1:500加入IPTG（工作浓度为0.2-0.5 mmol/L），20-25℃条件下200 rpm继续振荡培养过夜。
4）4℃条件下4,000 rpm离心15 min，收集细菌沉淀。
a)尽量倒净上清，每管加入10 ml PBS缓冲液重悬细菌，置于冰上超声。
5）4℃，12,000 rpm离心30 min，留取上清并分装后（混匀）于-80℃保存，即为纯化的原核融合蛋白A。
2. GST-pull down实验1）将编码B蛋白的重组质粒转染入HEK293细胞中，48 h后提取细胞总蛋白。
2）留取50 µl蛋白加入2×蛋白样品缓冲液，混匀后100℃金属浴加热10 min使蛋白变性，室温12,000 rpm离心15 s，-20℃保存，作为Input。
3）用预冷PBS缓冲液洗涤Glutathione Sepharose 4B珠子，然后然后按照1:1的比例向Glutathione Sepharose 4B珠子中加入PBS缓冲液并混合均匀。
吸取珠子时应减掉枪尖部分，避免破坏珠子。
4）取适量纯化的原核融合蛋白A（SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色调整各个融合蛋白的蛋白量，如果有验证多个蛋白，比如截短蛋白，保证加到另一个蛋白里的蛋白量一样），加入30-40 µl预处理过的Glutathione Sepharose 4B珠子，4℃颠倒混匀4-6 h。
5）于4℃条件下12,000 rpm离心15 s，弃上清。
GSTpulldown实验技术ppt
通过运用gstpulldown技术，科学家们可以研究特定蛋白质在药物作用过程中的变化情况，进而发现新的药物作用靶点。同时，该技术还可用于研究特定疾病过程中蛋白质的变化情况，为疾病的治疗提供理论依据。
gstpulldown技术在生物医药领域的应用
该技术在其他领域也有着广泛的应用，如环境保护、农业科学等。
总结词
通过运用gstpulldown技术，科学家们可以研究特定蛋白质与其他蛋白质之间的相互作用，进而揭示细胞生命活动的内在机制，为研究疾病的发生机制、药物作用靶点等提供了重要支撑。
详细描述
gstpulldown技术在基础研究中的应用
总结词
该技术在生物医药领域具有广泛的应用前景，为药物研发、疾病治疗等提供了新的思路。
数据分析的挑战
GST Pulldown实验产生的数据量庞大且复杂，需要专门的数据分析技术和工具进行处理。然而，目前数据分析的难度较大，限制了该技术的应用和发展。
随着生物学和医学研究的不断发展，GST Pulldown技术正在不断拓展应用领域。例如，该技术在研究疾病发生机制、药物筛选和生物技术等领域的应用正在不断增加。
加样
将蛋白样品加入到含有GST标签蛋白和Glutathione beads的试管中。
洗涤
将沉淀用水洗涤多次，以去除未结合的蛋白。
孵育
将加样后的试管在室温下孵育1hr左右。
裂解
向沉淀中加入适量的裂解液，将结合的蛋白从beads上解离下来。
离心
将孵育后的试管进行离心处理，分离出沉淀和上清液。
检测
对裂解后的蛋白进行Western blot检测。
总结词
通过运用gstpulldown技术，科学家们可以研究环境中特定蛋白质的变化情况，进而探讨环境污染对人类健康的影响。此外，该技术还可用于研究植物耐受逆境胁迫的机制，为提高作物抗逆性提供理论支持。
大家都在做的GSTpull
大家都在做的GSTpull一、GST pull-down 基本知识1. GST pull-down 概念GST pull-down：是利用重组技术将探针蛋白与 GST 谷胱苷肽巯基转移酶融合，融合蛋白通过GST 与固相化在球珠上的GSH 谷胱甘肽结合。
从而分离出能与融合蛋白相互作用的蛋白的技术。
2. GST pull-down 研究对象二、GST pull-down 原理1. GST pull-down 结合原理2. GST pull-down 分离原理三、GST pull-down 流程1. 蛋白的抽提与纯化：① 原核表达蛋白纯化② 真核表达蛋白抽提2. 体系孵育与 pull-down3. 考染检测与 WB 验证四、GST pull-down 结果1. GST pull-down 结果分析① 考马斯亮蓝检测② Western blot 验证五、GST pull-down 拓展1. GST pull-down 与 Co-IP 区别① GST pull-down② Co-IPGST pull-down 与 Co-IP 区别：GST pull-down 是原核纯化蛋白与真核蛋白在试管内发生生化反应互作的结果，只要互作蛋白间具有相互结合的结构域基础即可实验证明；Co-IP 实验是细胞内高表达目的蛋白，并通过IgG 球珠-抗体-蛋白复合物体系，分离出互作的蛋白复合物，是细胞内的体内反应结合。
2. GST pull-down 实验优点① 可验证蛋白质-蛋白质之间的直接互作。
② GSH 谷胱甘肽偶联球珠亲和力强，洗脱纯度高。
3. GST pull-down 实验缺点① 验证互作是在试管中进行的生化反应，不能够完全反应细胞内蛋白真实互作状态。
② 融合表达的 GST 标签，肽链较长，可能会改变原目的蛋白的原有的折叠结构。
分子生物学笔记：GSTpull-downassay
分子生物学笔记：GSTpull-downassayGST pull-down assayGST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。
其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
此方法简单易行,操作方便。
GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)补充：融合蛋白(fusion protein)有两种不同的含义，一种是通过DNA 重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。
另一种含义就是介导两个细胞质膜融合的一组蛋白，如在仙台病毒脂双层外侧小叶中含有的两种糖蛋白之一，介导病毒被膜与宿主细胞质膜的融合作用。
另一种糖蛋白是血细胞凝集素神经酰胺酶。
两个不同的蛋白质连成一个大分子。
可以通过化学方法连接，也可通过基因的融合来实现。
在基因操作中，对一些分子数小的多肽基因常采用融合的方法与某一基因（如lac）相连，二者之间接上某一酶（如凝血酶）的切口，以增加在体内表达后产物的稳定性，也有的故意使两个分子串连融合以提高疗效，如IL-3与GM-CSF。
也有与分泌性蛋白的信号肽基因组成融合基因，以使表达产物分泌到膜外或胞外。
技术特点融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌) 也可在真核细胞中进行表达。
原核表达系统的特点是时程短，费用低，是科研中的主要工具。
其缺点是真核蛋白表达没有得到确切修饰；大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物，需要复杂的变性和复性过程；大量蛋白的分泌较困难。
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➢ 3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋 白（IPTG 0.5mM，28℃，200 rpm培养10~16小时）;
➢ 4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清 （如需要该步沉淀能保存在-80℃）；
GST pull-downFra bibliotek示意图Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
Western Blot
➢ 1.1 GST-A融合蛋白的表达
➢ 5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； ➢ 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声6~9min可透明）; ➢ 7、12000 rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管，
B蛋白的来源： ➢ 1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达与纯化 ➢ 1.2 (HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达
Western Blot
➢ 1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达
➢ 1、活化冻存菌种His和His-B：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌 液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
➢ 1.1 GST-A融合蛋白的表达 ➢ 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
Western Blot
➢ 1.1 GST-A融合蛋白的表达
➢ 1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1: 50比例将表达蛋白的冻存 菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
➢ 3、在管中加入预冷的200微升Wash Buffer（沿壁加入，小心勿 剧烈，以免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将珠子 洗涤一次， 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清;
➢ 4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸 净但不吸走珠子），即获得结合有His融合蛋白的Ni-NTA；
加DTT至终浓度1mmol/L。
Western Blot
➢ 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
➢ 1、 在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的50%Glutathione Sepharose 4B，4℃缓慢摇动，反应30~60min；
➢ 2、 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清。该Sepharose上结合 了GST-A融合蛋白。
加DTT至终浓度1mmol/L。
Western Blot
➢ 1.1.2 (His)-B融合蛋白的纯化
➢ 1、 在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的Ni-NTA珠子， 4℃缓慢摇动，反应30~60min；
➢ 2、 3000 rpm/min，4℃离心5min，弃上清。该Ni-NTA珠子上结 合了His-B融合蛋白。
➢ 3、在管中加入预冷的200微升PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以 免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤 一次， 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清;
➢ 4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸 净但不吸走珠子），即获得结合有GST-A融合蛋白的Sepharose；
GST pull-down 实验技术
主讲：段志强
Western Blot
GST pull-down原理 GST pull-down实验流程
Western Blot
GST pull-down原理：
GST pull down 是一种在体外研究蛋白质相互作用的 方法。
原理： 利用DNA重组技术将已知蛋白与GST (Glutathione S transferase) 融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体 上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合 蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合 物混合时就可被吸附而分离。
➢ 2、将过夜培养物按1:100比例接入200ml LB(Amp＋) ，220 rpm， 30℃培养至OD600=0.4-0.6;
➢ 3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋 白（IPTG 0.5mM，20℃，200 rpm培养10~16小时）;
➢ 4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清 （如需要该步沉淀能保存在-80℃）；
Western Blot
➢ 1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达
➢ 5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； ➢ 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可溶性
蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声6~9min可透明）; ➢ 7、12000 rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管，
➢ 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
➢ 5、如果用于检测，在Sepharose 加入15~20微升1×蛋白电泳上 样缓冲液，于沸水中煮5~10min。
➢ 6、12000 rpm/min离心5min，取上清做SDS-PAGE和WB检测。
2. B蛋白的制备
Western Blot
Western Blot
GST pull-down原理：
基本原理：
假定A蛋白和B蛋白可能有相互作用，将纯化的融合GST 标签的A蛋白和纯化的B蛋白以及能特异结合GST的 Sephrose 4B beads 孵育一定时间，充分洗涤未结合的蛋 白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳，通过Western blotting 检测，可以看见GST-A和B分别对应的条带,表明A和B因 相互作用而被GST-A pull-down；而GST对照组始终仅有 一个条带。