构建食品级的重组乳酸乳球菌表达纳豆激酶
乳酸乳球菌表面展示表达系统的构建及其鉴定
乳酸乳球菌表面展示表达系统的构建及其鉴定谷贵章;宋达峰;顾青【期刊名称】《生物技术》【年(卷),期】2006(16)6【摘要】目的：旨在构建一个将抗原靶向于乳酸乳球菌细胞表面的表达系统。
方法：运用PCR技术从金黄色葡萄球菌基因组中克隆出蛋白A（SPA）C-末端544个碱基对的锚定域序列（Spax）。
通过酶切、连接将Spax构建入分泌型质粒pAMJ399形成携有整合外源基因位点BglⅡ的pAMJ400质粒。
将报告蛋白一绿色荧光蛋白的基因（Gfp）插入载体pAMJ400的整合位点产生模式质粒pAMJ401并电转化其于乳酸乳球菌MG1363。
绘制转化子MGI363（pAMJ401）生长曲线确认诱导期。
调节pH值（6．0-6．5）诱导转化子并在荧光显微镜下观察杂合蛋白（GFP：SPAX）的表达情况。
结果：在395nm的蓝色激发光下，诱导后的细菌发出较明亮的绿色荧光，而未诱导的细菌几乎不产生荧光。
结论：成功地构建了乳酸乳球菌表面展示表达系统，此系统可以作为口服活菌疫菌研究的可行性操作平台。
【总页数】5页(P17-21)【关键词】乳酸乳球菌;表达系统;展示表达【作者】谷贵章;宋达峰;顾青【作者单位】浙江工商大学生物工程系【正文语种】中文【中图分类】Q789【相关文献】1.乳酸乳球菌NICE系统食品级分泌表达载体pRNV48的构建及铜绿假单胞菌融合外膜蛋白的表达 [J], 徐波;曹郁生;陈燕;郭兴华2.构建及鉴定表达胃泌酸调节素的乳酸乳球菌 [J], 向荣;林艳;李晓曦;张欣;巩思嘉;赵子建3.乳酸乳球菌食品级表面表达系统建立和报告基因检测 [J], 庄重;季莉;徐莹莹;李珊珊;季玉红;段义农4.乳酸乳球菌表面表达Brazzein甜味蛋白系统的建立 [J], 王长远;许凤;沈冰蕾;于长青;姚笛5.乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达 [J], 徐波;曹郁生;陈燕;郭兴华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基于thyA基因的乳酸乳球菌的达系统的构建及纳豆激酶基因的克隆的中期报告
基于thyA基因的乳酸乳球菌的达系统的构建及纳豆激酶基因的克隆的中期报告本报告旨在介绍基于thyA基因的乳酸乳球菌的达系统的构建以及纳豆激酶基因的克隆的中期研究进展。
在本阶段的研究中，我们主要完成了以下内容：构建thyA基因敲除的乳酸乳球菌株、构建达系统、克隆纳豆激酶基因等。
一、构建thyA基因敲除的乳酸乳球菌株为了实现对thyA基因的敲除，我们采用了单交换子式重组技术。
首先，设计了thyA基因的上下游引物，并利用PCR扩增出目标片段。
然后，将扩增片段与质粒进行连接并转化到相应宿主菌中。
接下来，通过重组活性选择，筛选出了含有敲除thyA基因的乳酸乳球菌株。
通过PCR和测序验证，确认乳酸乳球菌thyA基因已成功敲除。
二、构建达系统为了实现纳豆激酶基因的高效表达，我们构建了基于thyA基因的乳酸乳球菌达系统。
首先，将thyA基因编码序列与表达载体进行连接，得到重组质粒。
然后，通过电穿孔法将重组质粒导入thyA基因敲除的乳酸乳球菌株中。
经过适当培养和筛选，成功获得了表达纳豆激酶基因的乳酸乳球菌株。
三、纳豆激酶基因的克隆为了克隆纳豆激酶基因，我们首先设计了基于已知序列的引物，并利用PCR扩增得到目标片段。
然后，将扩增片段与克隆载体进行连接，并转化到大肠杆菌中。
通过筛选和测序，成功获得了含有纳豆激酶基因的重组质粒。
进一步将重组质粒导入乳酸乳球菌中，得到能够高效表达纳豆激酶的乳酸乳球菌株。
四、中期研究进展在本阶段的研究中，我们成功构建了thyA基因敲除的乳酸乳球菌株，并建立了能够高效表达纳豆激酶基因的达系统。
同时，通过克隆获得了纳豆激酶基因的重组质粒并导入乳酸乳球菌中。
这些成果为后续的研究提供了坚实的基础。
总结：本中期报告介绍了基于thyA基因的乳酸乳球菌的达系统的构建以及纳豆激酶基因的克隆的中期研究进展。
通过构建thyA基因敲除的乳酸乳球菌株和建立达系统，我们成功实现了对纳豆激酶基因的高效表达。
这些研究结果为进一步的研究提供了重要的基础和方向。
乳酸乳球菌食品级分泌性表达载体pSQZ的构建及报告蛋白的表达
文章编号:1002-2694(2008)03-0224-05乳酸乳球菌食品级分泌性表达载体pSQZ的构建及报告蛋白的表达孙强正,熊衍文,叶长芸,徐建国摘 要:目的 构建乳酸乳球菌(L a ctococcus lactis ,L lactis)食品级分泌表达载体,表达报告蛋白核酸内切酶(NucA)。
方法 PCR 扩增乳酸乳球菌未知分泌蛋白(Usp45)编码基因的启动子、核糖体结合位点、分泌信号和成熟肽前11个氨基酸编码序列,克隆到载体pS H91中,构建食品级分泌性表达载体p SQZ ;克隆报告蛋白金黄色葡萄球菌Nuc A 成熟肽的编码序列nucA 到pSQZ 中分泌信号后,转化乳酸乳球菌MB P71,构建乳酸乳球菌分泌性表达系统L lactis MB P71/pSQZ 2nucA ;采用TB 2D 法和酶谱法检测乳酸乳球菌分泌性表达的NucA 活性。
结果 PCR 扩增得到usp45基因片段,酶切、连接到载体pS H91中构建了食品级表达载体pSQZ;将扩增的nucA 基因片段克隆入载体p SQZ 并转化乳酸乳球菌,得到乳酸乳球菌分泌性表达系统L lactis MB P71/pSQZ 2nucA 。
在TB 2D 平板上,L l actis MB P71/p SQZ 2nucA 克隆子周围出现橙色光晕;在酶谱检测中,L lactis MBP71/pSQZ 2nucA 上清和菌体在18kDa 位置均有橙色条带,但上清条带亮度和宽度大于菌体。
结论 成功构建了乳酸乳球菌食品级分泌表达系统,实现了报告蛋白NucA 在乳酸乳球菌中分泌性表达,为进一步保护性抗原的分泌性表达研究奠定了基础。
关键词:乳酸乳球菌;食品级载体;分泌性表达;报告蛋白 中图分类号:R155.5 文献标识码:A Constr uct ion of a f ood 2gr ade secr et ion expr ession vectoran d the expression of r epor ter pr otein in Lact ococcus l actisSUN Qia ng 2zheng ,XION G Yan 2we n ,YE Chang 2yun ,XU Jia n 2guo(S tate Key L abora tor y f or i nf ectious dise ase prevention an d cont rol ,N a tiona l I nstitute f or Communica ble D isease Controla nd Pr evention ,Chinese Center f or D isease Cont rol a nd P revention ,Bei jing 102206,Chi na)AB S T RAC T :To const ruct a food 2gra de secretion e xpre ssion vector and it s use in the exp ression of repo rter protein nucle 2ase (Nuc A),a f ragment ,Usp45,containing the coding sequence of promoter ,ribosomal binding site ,secretion signal and the cod 2ing seque nce for 11pre 2amino acids was a mplif ied by PCR using t he ge nomic DNA of ctis M G 1363,and t hen inser te d into t he f ood 2gra de vecto r pSH91,t hus to constr uct a secretion exp ression vector pSQZ.In addition ,the coding sequence of NucA (nucA)was also amplified f rom St ap hyloco ccus a ur eus chromoso me and inser ted into vector p SQ Z under the control wit h pro 2mote r usp45to constr uct a recombina nt pla smid pSQZ 2nuc A.Nuclea se plate activ ity and zymogram assa ys we re to be used to detect the NucA activity in the secretion expression of ctis.It was demonstrated tha t the secretion expressio n vector sys 2tem ctis MB P71/pSQZ 2nuc A was successively const ructed thro ugh t he processe s mentioned a bove and the qua ntity of Nu 2cA sec reted into c ultural super natants wa s gr ea te r tha t t hat in bacterial lysates.Because all the fr agments used to co nstr uct the vector pSQZ we re obtained f rom food 2grade bacteria ,the vector pSQZ can be regarded as a food 2gra de secretion e xpre ssio n vec 2tor.These data can be used a s the foundation fo r the f urther st udy on t he secretion expression of t he protective antigen in t he o 2ral vaccine. KE Y W O RDS :L actoco ccus lactis ;Food 2gra de vector ;Secre tio n expr ession ;Repor te r protein 通讯作者徐建国,x j @ 作者单位中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室,北京 6 乳酸菌(l act ic aci d bacteri a ,L AB )是一类可发酵糖产生乳酸的细菌总称,包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌等二十几个属,广泛用于食品工业,用来生产和保存乳制品及其他食品,被公认为是安全的食品级微生物(generall y regarded a s safe ,GRAS)。
基于pyrF的乳酸乳球菌食品级表达载体的构建
王帅，邓木兰，梁志成，等. 基于pyrF 的乳酸乳球菌食品级表达载体的构建[J]. 食品工业科技，2024，45（9）：124−130. doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023060149WANG Shuai, DENG Mulan, LIANG Zhicheng, et al. Construction of a Food-grade Expression Vector Based on pyrF Gene in Lactococcus lactis [J]. Science and Technology of Food Industry, 2024, 45(9): 124−130. (in Chinese with English abstract). doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023060149· 生物工程 ·基于pyrF 的乳酸乳球菌食品级表达载体的构建王 帅1，邓木兰1, +，梁志成2，周泓宇1，何少媚1，张 智3，穆云萍1，李芳红1, *，赵子建1,*（1.广东工业大学生物医药研究院，广东广州 510006；2.华南理工大学医学院，广东广州 510006；3.深圳大学生命与海洋科学学院，广东深圳 518060）摘 要：基于pyrF 筛选标记和来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis ，L. lactis ）的基因组DNA 为表达元件，构建L. lactis 食品级表达载体，用于食品和药用多肽的表达和生产。
首先，利用NZ3900 pyrF 基因列构建同源重组突变盒，构建NZ3900 ΔpyrF 突变株；然后，分别以来源于L. lactis 的repA 和repC 基因为复制元件、pyrF 基因为筛选标记、P 32和P 8为启动子、以及T usp 45和T pepN 为终止子，构建食品级表达质粒pLD ；最后以绿色荧光蛋白ZsGreen 为报告基因，验证ZsGreen 在NZ3900 ΔpyrF 突变株的表达及pLD-ZsG 的遗传稳定性。
乳酸乳球菌表达系统的研究进展_王永刚
图 1 NICE 系统蛋白表达示意图
2 乳酸乳球菌表达系统的应用
乳酸乳球菌是肠道内的常见菌种， 其作为一种食 品级的安全微生物已越来越受到科研工作者的青睐。 目前对乳酸乳球菌应用最多的是食品工业和医药行 业。 2.1 L. lactis 表达系统应用于食品工业
目前， 构建乳酸菌乳球菌食品级载体-受体系统， 寻找一些在乳酸乳球菌中的克隆和表达中有价值的基 因已成为乳酸菌分子遗传学研究的趋势并在食品研究 和生产领域具有重大意义。 乳酸菌食品级高效表达系 统 （NICE） 是 现 阶 段 应 用 最 广 的 高 效 诱 导 表 达 系 统 ， 由 于 NICE 系 统 的 诱 导 剂 、 宿 主 菌 和 载 体 都 是 安 全 的 食品级的， 其应用前景相当广阔。 如若在该系统中加 入诱导物乳链菌肽后诱导率可达 1 000 倍以上 。 ［12-13］ 因 此， 在可控蛋白的生产中该系统是首选表达系统， 同 时在生产表达时该系统具有良好的安全性， 所以可用
乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达
表 1 合成的引物序列及限制性酶切位点
Primer PA1 P2 PV1 PV2 PO1 PO2 PO3 PO4
Table 1 Primer sequence and size
Sequence (5′→3′)
Enzyme site
GCCTCTAGAATTAAATTCTGAAGTTTGTTAGATACAAT
47 卷 4 期 2007 年 8 月 4 日
微生物学报 Acta Microbiologica Sinica
47 (4) : 604～609 4 August 2007
乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达
徐 波1 ,曹郁生1 3 ,陈 燕1 ,郭兴华1 ,2
(1食品科学教育部重点实验室 南昌大学中德联合研究院 南昌 330047) (2中国科学院微生物研究所 北京 100080)
Xba Ⅰ
TAATCTAGAGCTAGCTTGATTGTTCTATCGAAAGCGAAATCA Nhe Ⅰ
AGCCATGGAACCGAACTTAATGGGAGG
Nco Ⅰ
GAAGCTAGCCGCAAAAAGGCCATCCGTCAGGA
Nhe Ⅰ
ATCGCCATGGGTTGTCATCGGCTCGCTGGTTGC
当aaga基因克隆到其他不能发表达原理以载体praf800pnz8048和pve5524prna48和细胞壁锚定诱导表达载体prnv48用于prnv48均为e型复制的翻译融合型载体分别含有的工作中构建了铜绿假单胞菌oprfoprh的融合外合基因克隆入prna48和prnv48中对诱导方法当l1actisnz9000prna48oprfh和l1actisnz9000prnv48oprfh培养至对数期时分别加入10ngml和1ngml诱导剂nisin使细菌的生长与的代谢负荷位于nisa启动子下游的oprfh基因被激活转录表达出所需的oprfh融合蛋白
乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达
乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达徐波;曹郁生;陈燕;郭兴华【期刊名称】《微生物学报》【年(卷),期】2007(47)4【摘要】以α-aga基因为食品级选择标记构建了乳酸乳球菌食品级高效诱导细胞内和细胞壁锚定表达系统,并用这一表达系统表达了铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因OprF/H.首先以pRAF800和pNZ8048构建了含有α-aga、PnisA-MCS-pepN和θ复制子的乳酸乳球菌食品级细胞内诱导表达载体pRNA48,再以pRNA48和pVE5524为出发载体构建了含有α-aga、PnisA-SPUsp45-nucA-CWAM6-t1t2和θ复制子的乳酸乳球菌细胞壁锚定诱导表达载体pRNV48.然后以食品级载体pRNA48和pRNV48为基础,构建了不含抗生素抗性选择标记的铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因的表达质粒pRNA48-OprF/H和pRNV48-OprF/H.利用nisin进行重组乳酸乳球菌菌株的诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot 分析,检测到表达蛋白分别占细胞内可溶蛋白的9.6%和细胞壁锚定蛋白的9.8%,表达产物具有免疫原性,可与含OprF/H的乳球菌以及铜绿假单胞菌发生特异性的凝集反应.【总页数】6页(P604-609)【作者】徐波;曹郁生;陈燕;郭兴华【作者单位】食品科学教育部重点实验室,南昌大学中德联合研究院,南昌,330047;食品科学教育部重点实验室,南昌大学中德联合研究院,南昌,330047;食品科学教育部重点实验室,南昌大学中德联合研究院,南昌,330047;食品科学教育部重点实验室,南昌大学中德联合研究院,南昌,330047;中国科学院微生物研究所,北京,100080【正文语种】中文【中图分类】Q786;Q93【相关文献】1.乳酸乳球菌NICE系统食品级分泌表达载体pRNV48的构建及铜绿假单胞菌融合外膜蛋白的表达 [J], 徐波;曹郁生;陈燕;郭兴华2.多角体包埋异源蛋白杆状病毒表达系统的构建 [J], 郭建军;袁林;曾静;魏国汶;杨一兵3.乳酸乳球菌食品级分泌性表达载体pSQZ的构建及报告蛋白的表达 [J], 孙强正;熊衍文;叶长芸;徐建国4.食品级分泌表达载体的构建及报告蛋白在乳酸乳球菌中的表达 [J], 孙强正;熊衍文;叶长芸;徐建国5.重组植物甜蛋白马宾灵的食品级乳酸乳球菌诱导表达系统的构建 [J], 顾文亮;夏启玉;姚晶;胡新文;符少萍;郭建春因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一种重组乳酸乳球菌菌株及其制备方法和应用[发明专利]
![一种重组乳酸乳球菌菌株及其制备方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/608237345022aaea988f0f1f.png)
专利名称：一种重组乳酸乳球菌菌株及其制备方法和应用专利类型：发明专利
发明人：乔建军,薛二淑,吴昊,财音青格乐,宋倩倩,田开仁,支宁
申请号：CN201910091383.0
申请日：20190130
公开号：CN109652436A
公开日：
20190419
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种重组乳酸乳球菌菌株及其制备方法和应用，通过过表达murF基因得到重组乳酸乳球菌菌株。
构建菌株的方法：将乳酸乳球菌菌株的基因murF连接到质粒载体上，获得重组质粒；将重组质粒电转到乳酸乳球菌中，选取阳性转化子，获得重组菌株。
重组乳酸乳球菌菌株可提高菌株的耐酸性和乳酸链球菌素(Nisin)产量。
将原始菌株和过表达murF的菌株在发酵培养基中发酵12h，培养到8h时Nisin产量达到最大，过表达murF的菌株比原始菌株Nisin产量提高1.1～1.5倍，酸应激存活率提高1.1～1.7倍。
本发明的重组菌株对产物Nisin和菌株抗逆性有明显的影响。
其中Nisin 是一种安全无毒的食品防腐剂。
申请人：天津大学
地址：300350 天津市津南区海河教育园雅观路135号天津大学北洋园校区
国籍：CN
代理机构：天津市北洋有限责任专利代理事务所
代理人：琪琛
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纳豆激酶基因工程菌的构建及高密度发酵
纳豆激酶基因工程菌的构建及高密度发酵血栓引起的发病率和死亡率的比重越来越高,溶栓剂是治疗的最有效药物,但当前临床使用的溶栓剂都存在一些缺点,溶栓剂仍需要不断被开发和改进,尤其是预防性的食源性的溶栓剂很有必要。
纳豆激酶(nattokinase,NK)最早来自日本传统食品纳豆中,是由纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶,由aprN基因编码。
作为新型溶栓剂的代表,NK无免疫原性,不仅溶栓效果显著且安全无毒,正成为一种具有开发和利用价值的功能性食品。
生产NK的传统方式为固态发酵,尽管产量较高,但NK分离纯化步骤繁琐、酶活损失严重;采用基因工程菌液体发酵又可能存在产生包涵体、酶活性低的问题。
为提高NK的产量,本研究主要内容如下:(1)利用PCR技术扩增B.subtilis natto的aprN基因,并依据枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的密码子偏好性优化了起始30个氨基酸的密码子,添加六个组氨酸片段便于纯化,构建了重组表达质粒pHT01-aprN1。
经限制性酶酶切、PCR扩增和测序验证了其序列的正确性。
通过电击法将含有强启动子的pHT01-aprN1导入B.subtilis 168,利用氯霉素抗性筛选获得B.subtilis 168/pHT01-aprN1工程菌。
(2)探究IPTG和2,6-吡啶二羧酸用量、诱导温度、培养基浓度和接种量对酶活的影响,经摇瓶培养,采用四肽底物法检测最高酶活为289 U/mL(RSD%=1.1),酶活表达稳定性良好,是野生菌的3.9倍。
用镍柱纯化发酵上清液,经SDS-PAGE和Western-Blot验证得到电泳纯NK。
(3)为实现工业化生产,进行补料发酵实验,酶活达到4521.78IU/mL(RSD%=1.2),进一步优化补料方案,酶活达7778.5 IU/mL(RSD%=1.1)。
发酵液经硫酸铵沉淀的酶活回收率为89.02%。
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构建食品级表达纳豆激酶的乳酸乳球菌重组菌株冯浩余凤云单凤娟闫达中*武汉工业学院生物与制药工程学院湖北武汉 430023摘 要:纳豆激酶(Nattokinase,NK)是从日本传统食品纳豆中分离到的、具有高效溶栓活性的蛋白激酶，它能够很好地弥补传统溶血栓药物的缺陷，极有可能开发为新一代口服制剂用于血栓性疾病的预防和治疗。
以HisH基因作为同源重组的靶位点，构建整合型表达载体pFY008，通过同源重组的方法将含有纳豆激酶原基因的表达盒PnisA-aprN整合到乳酸菌的基因组上，实现纳豆激酶在乳酸乳球菌中食品级的表达。
构建的食品级基因工程菌安全性高、稳定性好，并赋予了其溶栓的功能。
本研究为生产新型溶栓保健乳酸饮料提供理论和技术支持。
关键词: 纳豆激酶；同源重组；乳酸乳球菌中图分类号：Q786 文献标识码:A文章编号：脚注收稿日期：基金项目：湖北省教育厅中青年项目（Q200718003）武汉工业学院研究生教育创新计划资助(09cx018)作者简介：冯浩(1988-)，男，硕士研究生，研究方向为微生物学。
E-mail：sqfenghao@*通讯作者：闫达中(1968-)，男，副教授，研究方向为微生物学。
E-mail：yandz6808@Construction of a Recombinant Lactococcus lactis to Realize Food-gradeExpression of NattokinaseFENG Hao YU Feng-yun SHAN Feng-juan YAN Da-zhong*College of biological and pharmaceutical engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China Abstract: Nattokinase (NK) is a protein kinase with strong fibrinolytic property, seperated from Japanese traditional food natto. Because it could make up for the shortcomings of traditional thrombolytic drug well,it may be used as a new kind of oral agents for thrombotic diseases. An integrative expression vector pFY008 was constructed with hisH gene as the homologous recombination target site. In order to realize nattokinase gene (aprN) food-grade expression in Lactococcus lactis, the expression cassette PnisA-apr N gene was integrated into the genome of Lactococcus lactis by homologous recombination.A food-grade recombinant Lactococcus lactis was constructed to produce a thrombolytics protein. The recombinant Lactococcus lactis was endowed with fibrinolytic property. Meanwhile, it had fine stabilityand high safety. The work mentioned above has provided a theory and technical support for the development of a new lactic acid drink with thrombolytic activity.Keywords: Nattokinase; Homologous recombination; Lactococcus lactis1992年NADAMURA等人[1]采用鸟枪法首次从分泌纳豆激酶的枯草芽孢杆菌中克隆到包括调控序列在内的纳豆激酶全长基因aprN，并对1473 bp的aprN编码序列进行分析。
纳豆激酶是分子量较小的单链蛋白，易被人体吸收；并可以直接降解交联纤维蛋白，且对纤维蛋白原不敏感，而且能促进内源性t-PA(Tissue-type plasminogen activator)增生[2]，药效时间长，价格低廉；有一定的抗胰酶水解能力，可由肠吸收入血，口服效果好，具备一定的抗凝血功能，安全性高。
纳豆激酶很好地弥补了传统溶血栓药物的缺陷，极有可能作为新一代口服制剂用于血栓性疾病的预防和治疗。
近年，纳豆激酶作为功能性食品、食品添加剂和普通食品发展的十分迅速。
一些制药公司已转向生产功能性食品，这也是保健食品发展的趋势。
就世界范围而言，所有的制药企业也都在努力占领保健品市场。
仅美国和欧洲的营养品和功能性食品的市场销售额就达5000亿美元，并以17-20%的增长率，逐年增加，一些制药企业开始生产功能性食品。
乳酸乳球菌(L. lactis)是乳球菌属中最重要和最典型的一个种，在食品工业中应用广泛，被公认为安全的(generally-regarded-as-safe, GRAS)食品级微生物。
以乳酸乳球菌作为宿主菌，构建表达载体用来表达异源蛋白和酶，逐渐成为食品工业、生物制药和疫苗研究的热点。
可以把感兴趣的基因导入这种系统中制成制剂或疫苗, 因为乳酸菌食品级基因表达系统中的载体、受体及诱导物均为食品级，这种活菌制剂可以直接口服,从而可简化或免除一般基因工程所需的烦琐、复杂的提取工艺,降低基因工程产物的危险性,为用基因工程生产安全廉价的生物制品提供了一种新思路。
本研究在探讨乳酸乳球菌中实现纳豆激酶活性表达的可行性及其表达所需的各个元件的基础上[3]，构建乳酸乳球菌基因整合型表达载体，通过同源重组将含有纳豆激酶原基因的表达盒整合到乳酸乳球菌基因组上，最终获得食品级的具有溶栓活性的重组乳酸乳球菌，表达具有药用价值的溶栓蛋白，赋予乳酸菌溶栓功能。
本研究为生产新型溶栓保健乳酸饮料提供理论和技术支持。
1材料与方法1.1试剂Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶购自宝生物工程（大连）有限公司，PCR 纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司，革兰氏阳性菌基因组抽提试剂盒购自美国OMEGA公司，酵母提取物、胰蛋白胨购自OXOID公司，其他试剂均为分析纯。
NisinA由浙江银象生物工程有限公司提供。
引物合成与测序由生工生物工程（上海）有限公司完成。
1.2培养基与培养方法E.coli DH5α用LB培养基[4]，37℃、200r/min振荡培养。
ctis NZ9000生长于GM17培养基[5]（M17培养基添加了0.5%的葡萄糖），30℃静置培养。
用于保存和筛选转化子的抗生素终浓度：氨苄100 μg/mL，氯霉素10μg/mL。
1.3菌株与质粒研究使用的菌株及质粒见表一。
表1 质粒和菌株Table 1 Plasmids and bacteria菌株和质粒相关特征来源E.coli DH5α(pFY003) 氨苄抗性（Amp R）和氯霉素抗性（Cm R）本研究构建E.coli DH5α(pFY004) 氯霉素抗性（Cm R）本研究构建E.coli DH5α(pFY005) 氨苄抗性（Amp R）本研究构建E.coli DH5α(pFY006) 氯霉素抗性（Cm R）本研究构建E.coli DH5α(pFY007) 氨苄抗性（Amp R）本研究构建E.coli DH5α(pFY008) 氯霉素抗性（Cm R）本研究构建ctis NZ9000荷兰乳品研究所ctis NZ9000(pNZ8048)氯霉素抗性（Cm R）荷兰乳品研究所ctis NZ9000(pFY002) 氯霉素抗性（Cm R） 3ctis NZ9000::pFY008 发生单交换的重组子，氯霉素抗性（Cm R）本研究构建ctis NZ9000::Pnis-aprN发生双交换的重组子本研究构建pUC18 pMB1复制子, 氨苄抗性（Amp R）,克隆载体6pNZ8048 氯霉素抗性（Cm R）, 表达载体荷兰乳品研究所pFY002 表达框PnisA-aprN克隆到pNZ8048,氯霉素抗性（Cm R）3pTG19-T 氨苄抗性（Amp R）,克隆载体上海捷瑞生物工程有限公司pFY003 氯霉素基因（cat）克隆到pTG19-T，氨苄抗性（Amp R）和氯霉素抗性（Cm R）本研究构建pFY004 氯霉素抗性基因（cat）替换pUC18中的氨苄抗性基因（bla）本研究构建pFY005his H基因克隆到pTG19-T，氨苄抗性（Amp R）本研究构建pFY006his H基因克隆到pFY004，氯霉素抗性（Cm R）本研究构建pFY007表达框 PnisA-apr N克隆到pTG19-T，氨苄抗性（Amp R）本研究构建pFY008 表达框 PnisA-apr N克隆到pFY006，氯霉素抗性（Cm R）本研究构建1.4重组表达载体的构建1.4.1含氯霉素抗性基因的重组质粒pFY003构建：以P3，P4为引物（见表二），pNZ8048为模板，扩增氯霉素抗性基因片段。
循环参数：95℃预变性5min，94℃变性1min，30℃退火1min，72℃延伸80s，30个循环，72℃延伸10min。
电泳后凝胶回收938bp氯霉素抗性基因片段,与pTG-19载体连接获得重组质粒，转化感受态细胞E.coli DH5α。
用含氯霉素的LB平板筛选阳性克隆。
1.4.2重组质粒pFY004的构建：以P5，P6为引物（见表二），pUC18为模板，扩增pUC18载体骨架基因片段，循环参数：95℃预变性5min，94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸80s，30个循环，72℃延伸10min。
电泳后凝胶回收1500bp的片段，Xbo I酶切该片段后电泳凝胶回收并去磷酸化。
pFY003经过Xbo I酶切后回收938bp的氯霉素基因片段与处理好载体骨架连接获得重组质粒，转化感受态细胞E.coli DH5α。
用氯霉素抗性LB平板筛选阳性克隆酶切鉴定。
1.4.3含His H基因的重组质粒pFY005的构建：以P7，P8为引物（见表二），ctis NZ9000基因组为模板，扩增His H基因片段，循环参数：95℃预变性5min，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸80s，30个循环,72℃延伸10min。