乳酸杆菌

在5μg/ml红霉素的MRS平板上无生长 而未经传代的细菌可生长 说明红霉素耐药基因已自发缺失
Lb. casei hCGβ稳定菌株体外分泌hCGβ动态观 察
300 250 200
mIU/ml
150 100 50 0 0 13 21 24 ¡ Ê Ð ± 38 45 60
外源基因hCGβ整合对 Lb. casei 生长状态的影响
P
SD
pIlac
PstI NdeI SmaI EcoRI
NdeI 信号肽 hCGβ EcoRI
NdeI/EcoRI ligate
P
NdeI 信号肽 + hCGβ EcoRI
pIlac hCGβ
pIlac hCGβ的构建
1.00E+06 1.00E+05
CFU/ugDNA
1.00E+04 1.00E+03 1.00E+02 1.00E+01 1.00E+00 600 900 1200 1500 Voltage 1800 2100 2400
Lb. casei hCGβ分泌性表达动态变化
500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 5 10 15 20 25 30 35 40
mIU/ml
±¼ Ê ä £ ¨Ð ¡ Ê ±£ ©
乳酸杆菌表达hCG的分布
500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 16 ¡ Ê Ð ± 21
技术路线:
PCR扩增670bp片段并测序 与hCG基因连接
构建质粒pIlac-hCG 电穿孔转化乳酸杆菌
PCR扩增信号肽+ hCG 将信号肽+ hCG克隆入pIlac, 得到 pIlac hCG
获得重组hCG 乳酸杆菌稳定表达株
pIlac-hCG 的构建:
扩增670bp的S-层蛋白表达信号
mIU/ml
É å Ï Ç Ö Ð Ä µ hCG¦ Â · ° Ï û Ñ Á ½ â ¹ Ò Ö Ð µ Ä hCG¦ Â
重组hCG乳酸杆菌培养上清免疫印渍分析
97KDa 66 KDa 45 KDa 30 KDa 20.1 KDa 14.4 KDa
红霉素耐药基因的重组缺失及建立稳定表达株
在无红霉素的MRS传50代后
与hCG序列比较：
agacaaggcaggggacgcaccaaggatggagatgttccaggggctgctgctgttgctgct 237 agacaaggcaggggacgcaccaaggatggagatgttccaggggctgctgctgttgctgct 60 gctgagcatgggcgggacatgggcatccaaggagccgcttcggccacggtgccgccccat 297 gctgagcatgggcgggacatgggcatccaaggagccgcttcggccacggtgccgccccat 120 caatgccaccctggctgtggagaaggagggctgccccgtgtgcatcaccgtcaacaccac 357 caatgccaccctggctgtggagaaggagggctgccccgtgtgcatcaccgtcaacaccac 180 catctgtgccggctactgccccaccatgacccgcgtgctgcagggggtcctgccggccct 417 catctgtgccggctactgccccaccatgacccgcgtgctgcagggggtcctgccggccct 240 gcctcaggtggtgtgcaactaccgcgatgtgcgcttcgagtccatccggctccctggctg 477 gcctcaggtggtgtgcaactaccgcgatgtgcgcttcgagtccatccggctccctggctg 300 cccgcgcggcgtgaaccccgtgggtctcctacgccgttggctcttagctgtcaatgtgca 537 cccgcgcggcgtgaaccccgt-ggtctcctacgccg-tggctctcagctgtcaatgtgca 358
NdeI
SmaI
EcoRI
TAAAAAGGAGGCTGCAGCATATGCCCGGGGAATTCAATCGGAGGGAATG
LacF LacG
Em
优点：
可在大肠杆菌中高拷贝 的扩增，便于基因克隆； 获得大量纯化质粒，使 得转化方便 介导外源基因整合入宿 主菌的基因组中，稳定 表达；红霉素耐药基因 可自发缺失，安全
pH
葡萄糖对乳酸杆菌hCGβ表达的影响
300 250 200
0.75%Æ Ï Ì Ñ Ì Ç £ ¬ 0.5%È é Ì Ç 0.5%Æ Ï Ì Ñ Ì Ç £ ¬ 0.5%È é Ì Ç 0.25%Æ Ï Ì Ñ Ì Ç £ ¬ 0.5%È é Ì Ç 0%Æ Ï Ì Ñ Ì Ç £ ¬ 0.5% é Ì È Ç
共同粘膜免疫机制
MALT 血液 抗原
M cell
归巢
Dome
T cell zone CD4+ T-naï ve CD4+ T activated CD4+ T memory B cell zone
lympoepithelium
粘膜效应部位： 胃肠道 上呼吸道 泌尿生殖道 腺体
Surface IgA+ B Activated B Resting B
CD8+ CTLs
活疫苗载体在粘膜部位持续表达抗原
细菌/ 病毒减毒株：减毒沙门氏菌、Bordetella pertussis，呼吸道合孢病毒等
细菌/ 病毒减毒株有潜在致病能力
乳酸杆菌是人体正常菌群，具有GRAS(generally regarded as safe)特性
乳酸杆菌表达抗原经粘膜免疫
pIlac 4895bp
Ap
ori
基因组DNA
目的基因
基因组DNA
目的基因 目的基因
pIlac
Ery
Ery pIlac
基因组DNA
目的基因
研究目的：
构建乳酸杆菌hCG 稳定表达株
乳酸杆菌在小鼠阴道内表达hCG抗原
经阴道免疫小鼠，以在生殖道局部刺激产生抗hCG抗体
第一部分
hCGβ抗原在乳酸杆菌的分泌性表达
3 2.5
OD600
2 1.5 1 0.5 0 0 8 13 ¡ Ê Ð ± 21 24 38
Ö × ³ é ¾ ú Ç Ö ² × ³ é ¾ ú
外源基因 hCGβ 整合对 Lb. casei培养上清 pH值 的影响
7 6 5 4 3 2 1 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Ð ¡ Ê ± Ö × ³ é ¾ ú ² Ç Ö × ³ é ¾ ú
阴道、肠道常驻菌，拮抗致病菌
在粘膜局部定居并持续表达抗原
避免体细胞表达抗原时可能的基因突变 方便、易于接受
用乳酸杆菌在生殖道局部表达外源蛋白并刺激产生 抗原特异性抗体 至今未见报道
乳酸杆菌基因工程的发展
• 可用乳酸杆菌表达多种细菌蛋白： 几丁质酶，噬菌体胞 壁水解酶，果聚糖酶，超氧化物歧化酶 • S-层蛋白表达信号 获得了240mg/L表达效率 • 膜锚定序列将目的蛋白锚定在胞膜上 • 从未表达过哺乳动物功能蛋白
EcoRI pUC18A S-层蛋白表达信号 KpnI BamHI
KpnI HindIII pBShCGβ hCGβ BamHI KpnI BamHI双酶切
KpnI
hCGβ
BamHI
连接
EcoRI S-层蛋白表达信号
BamHI hCGβ
PCR
NdeI 信号肽 hCGβ EcoRI
扩增S－层蛋白信号肽序列＋hCGβ
mIU/ml
150 100 50 0 0 9 16 ¡ Ê Ð ± 23 32
乳糖对乳酸杆菌hCGβ表达的影响
400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 9 16 ¡ Ê Ð ± 23 32
0%È é Ì Ç 0.25%È é Ì Ç 0.5%È é Ì Ç 0.75%È é Ì Ç 1%È é Ì Ç
乳酸杆菌基因工程的挑战：
优势 G＋细菌
不存在周质空间，可直接从上清中 获得分泌性表达的目的蛋白 不易裂解，质粒抽提效率低 外源基因导入困难(不接受连接混 合物；需大量纯化的质粒：电转 一次，500ng)
劣势
无商品化的工具
整合型表达载体pIlac、表达菌Lb casei CECT5276
RBS
PstI
pIlac质粒在不同电压下的转化效率
pIlac hCGβ和pIlac 的转化效率比较：
250000 200000
CFU/ugDNA
150000 100000 50000 0
1200v 200000 1500v 100000
pIlac pIlac hCG¦ Â
V
乳酸杆菌基因组hCGβ整合基因鉴定
2000 750 500 250 100
重组hCGβ乳酸杆菌对小鼠阴道粘 膜免疫的效果
李大金
复旦大学妇产科研究所
研究现状:
避孕疫苗：安全、方便、不影响生殖内分泌 精子抗原、 hCG 、卵透明带、FSH Talwar, hCGβ-HSD疫苗 有效：50ng/ml hCG结合力 可逆： 35ng/ml, 内源性hCG无免疫原性 有效率：80-85% 原因：载体；免疫途径 系统免疫(1/10)、粘膜免疫
mIU/ml
pH值对乳酸杆菌hCGβ表达的影响
400 350 300
mIU/ml
250 200 150 100 50 0 0 9 16 小时 23 32
pH7，乳糖0.5% pH6，乳糖0.5% pH5，乳糖0.5% pH4，乳糖0.5%
小结1：
Lactobacillus casei CECT5267稳定、分泌、高效 表达了hCGβ蛋白： 在无选择压力下培养50代并经2次冻存、复苏后， 上清中hCGβ浓度仍可达到 250 mIU/ml
S－层蛋白信号肽序列hCGβ融合产物测序及blast分析
Байду номын сангаас
与S-层蛋白序列比较： atgcaatcaagtttaaagaaatctctttacttgggccttgccgcattgagctttgctggt 103 atgcaatcaagtttaaagaaatctctttacttgggccttgccgcattgagctttgctggt 327 gttgctgccgtttcaacgactgcttcagct 133 gttgctgccgtttcaacgactgcttcagct 357
EcoRI KpnI
Lb DNA pUC18 PCR
BamHI XbaI HindIII
EcoRI/KpnI双酶切
EcoRI KpnI
670bpS-层蛋白表达信号
连接
EcoRI
pUC18A
S-层蛋白表达信号
KpnI
S-层蛋白表达信号序列测序及blast 结果
agctgaagcagtcgttgaaacggcagcaacaccagcaaagctcaatgcggcaaggcccaa agctgaagcagtcgttgaaacggcagcaacaccagcaaagctcaatgcggcaaggcccaa gtaaagagatttctttaaacttgattgcataatttttcttcctccaaacataaaatatgc gtaaagagatttctttaaacttgattgcataatctttcttcctccaaacataaaatatgt aatttatcaagcaagaatagtataaccgaagttagcgcttttgttaagaaatttattcga aatttatcaagcaagaatagtataaccgaagttagcgcttttgttaagaattttatttca taacatcagcggacccgatcagctatcccctaactacgaagataagtatagcgatttcct taacattagcggacccgatcagctatcccctaactacgaagataagtatagcgatttcct taaggagatacaaggattacgccctgattgtcgttggattgaaacaattatgggtatcct taaggagatacaaggattacgctctgattgtcgttggattgaaacaattatgggtgtcct gtaatgttattgttacataactaaaagtctactaacctgcttaaagcctttgtaa gtaatgttattgttacataactaaaacgtcactaacctgcttaaagcctttgtaa